中藥石香膏對糖尿病大鼠慢性難愈合創(chuàng)面RAGE/NF-κBp65/eNOS mRNA表達(dá)影響的研究?

凌一鳴，費 冀，張開偉，周一夫，沈馮君

(1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽 550002； 2. 貴州省中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，貴陽 550001)

慢性難愈合創(chuàng)面是指各種因素導(dǎo)致傷口不能正常愈合，且皮膚解剖和功能的完整性不能在大約1個月內(nèi)實現(xiàn)的疾病。主要病因包括糖尿病潰瘍、褥瘡、小腿靜脈潰瘍和手術(shù)部位感染等[1-3]。該病發(fā)病率高、病程長、治愈率低，給患者及社會帶來了沉重負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計，該類患者占總住院患者比例的1.7‰，平均住院花費1.2萬元，但僅有一半患者可以痊愈[4]。 在全國名老中醫(yī)沈馮君教授的經(jīng)驗基礎(chǔ)上，貴州省中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑“石香膏”經(jīng)過大量的臨床研究證實，對于慢性難愈合創(chuàng)面修復(fù)具有顯著療效[5-7]。先前有關(guān)基礎(chǔ)研究已證實，中藥石香膏能夠通過刺激創(chuàng)面內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性生長因子，激發(fā)成纖維細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)[8]。本研究通過建立糖尿病潰瘍大鼠模型，從RAGE/NF-κBp65/eNOS mRNA表達(dá)水平的變化觀察石香膏外用對于創(chuàng)面愈合的干預(yù)作用，更深層次探究其作用機制，為該藥的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 受試藥物 石香膏制備過程：將乳香 150 g、沒藥 150 g、赤石脂 150 g、梔子150 g、煅龍骨 150 g、冰片150 g一同打成細(xì)粉末狀以方便制備。將約2 L麻油倒入鍋中加熱，充分加熱至冒煙后，緩慢加入爐甘石500 g并充分?jǐn)嚢?，防止鍋?nèi)液體起泡溢出。待爐甘石攪拌均勻后，分別倒入已經(jīng)磨好的乳香粉、沒藥粉、赤石脂粉、梔子粉、煅龍骨粉、冰片粉，持續(xù)充分?jǐn)噭?，約1 h熬成面糊狀約即可，此時加入約200 g蜂蠟，待冷卻后石香膏即制備完成。此操作于貴州省中醫(yī)醫(yī)院中藥制劑室制備。貝復(fù)濟(jì)(重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子溶液)購自珠海億勝生物制藥有限公司。

1.1.2 實驗動物 50只清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量300～350 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(貴州省實驗動物工程技術(shù)中心)提供(生產(chǎn)許可證號SCXK(黔)2012-0001)，于貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心實驗室分籠飼養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑、儀器 免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidin-biotinperoxidase method，SP)試劑盒；核因子-κB P65(Nuclear Factor-κ-gene Binding P65，NF-κB P65)一抗(#8242，1∶1000 稀釋)，核因子-κB pP65(Nuclear Factor-κ-gene Binding P65，NF-κB P65)一抗(#3039，1∶1000 稀釋)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide synthase，eNOS)一抗(#9572，1∶1000稀釋)購自武漢博士德公司；熒光定量PCR試劑(qPCR)，sybr green I，RT試劑，以上試劑均購自Western Biotechnology公司；DEPC處理水(DNase/RNase-free)購自美國Sigma公司；RNA提取劑(TRIzol)購自中國碧云天公司；實時熒光定量 PCR 儀購自加拿大Funglyn Biotech公司；電泳儀購自美國Bio-rad公司；凝膠成像儀購自美國Tianneng公司；GDS8000 凝膠掃描系統(tǒng)購自美國UVP公司。

1.2 動物分組及造模

1.2.1 實驗動物分組 50只清潔級雄性SD大鼠分籠飼養(yǎng)，維持飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，濕度50% 左右，溫度25 ℃左右，明暗周期12 h，自由飲水和進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)3周后稱重記錄。按隨機數(shù)字表法分為正常對照組(正常組)、正常創(chuàng)面對照組(正常對照組)、慢性難愈合創(chuàng)面組(難愈合組)、貝復(fù)濟(jì)處理慢性難愈合創(chuàng)面組(貝復(fù)濟(jì)組)、石香膏處理慢性難愈合創(chuàng)面組(石香膏組)5組，共設(shè)2時間點(分別為造模后7 d/14 d),每組每時間點5只共50只。

1.2.2 建立誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型 造模前禁食18 h，可自由飲水；造模前先測量大鼠體質(zhì)量并記錄，比較大鼠前后體質(zhì)量差異變化。用采血針于尾靜脈處采血，血糖儀測定血糖，分別記錄各大鼠血糖值；然后以pH值為4.0，濃度為 0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液溶解鏈脲佐菌素(STZ)配制成1%溶液，將配置好的溶液以65 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)一次性腹腔注射于難愈合組、貝復(fù)濟(jì)組、石香膏組大鼠體內(nèi)，72 h后用上述測血糖方法測量，若隨機血糖值>16.7 mmol/L，即為誘導(dǎo)糖尿病模型。若測得隨機血糖>33.3 mmol/L，按血糖升高程度，肌肉注射諾和靈R(1-4 U/d)控制血糖，以提高實驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，減少誤差。正常對照組組大鼠僅注射濃度為0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液作為對照[9]。

1.2.3 建立慢性難愈合創(chuàng)面大鼠模型 注射1周后剃去正常對照組、難愈合組、貝復(fù)濟(jì)組、石香膏組大鼠背部毛發(fā)，給予硫化鋇再次脫毛，用鹽酸氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，將腰椎正中偏上處定為造模區(qū)并標(biāo)記一直徑約3 cm的圓形區(qū)域，術(shù)前備皮，在標(biāo)準(zhǔn)無菌操作下沿圓形區(qū)域剪去皮膚、皮下組織直至顯露肌筋膜，形成大鼠全層皮膚缺損開放性創(chuàng)面。

1.3 動物用藥

待大鼠創(chuàng)面充分止血后用藥，給藥劑量按《中藥藥理研究方法學(xué)》所提供的《實驗動物與人按體表面積比等效劑量換算比率表》倍數(shù)折算，計算出人鼠等效劑量為11.61 g/kg。貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面外用貝復(fù)濟(jì)約0.2 ml，石香膏組創(chuàng)面外敷石香膏厚度約2 mm，保證完全覆蓋創(chuàng)面，正常對照組、難愈合組、貝復(fù)濟(jì)組、石香膏組均以兩層無污染清潔紗布敷料覆蓋，膠布充分固定牢靠。從術(shù)前1 d起開始計算，連續(xù)4 d對各大鼠肌注青霉素(4000 U/只)防止感染。飼養(yǎng)方法同前。

1.4 標(biāo)本采集

分別在創(chuàng)面造模后第7天、第14天給予鹽酸氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，取正常對照組、難愈合組、貝復(fù)濟(jì)組、石香膏組大鼠背部創(chuàng)面肉芽組織標(biāo)本。部分肉芽組織標(biāo)本采用10%甲醛溶液固定，制成石蠟塊保存；部分置于-70 ℃冰箱中保存。

1.5 檢測

用切片機將石蠟塊中的組織切成5 μm厚的薄片，經(jīng)烤片、脫蠟、復(fù)水后HE染色，光鏡下觀察大鼠背部創(chuàng)面生長情況和病理變化。

使用Trizol法提取大鼠背部創(chuàng)面肉芽組織標(biāo)本中的RNA，用隨機引物將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總反應(yīng)體系20 μL，25℃10 min，42℃50 min，85℃5 min合成cDNA，然后設(shè)計特異性的引物和sybr green Ⅰ熒光染料進(jìn)行熒光定量PCR檢測，總反應(yīng)體積50 μL，條件設(shè)置94℃4 min，94℃20sec，60℃30sec，72℃30sec循環(huán)35次，72 ℃時檢測信號。RAGE：上游：5′-GGGACTCTTCACGCTTCGG-3′，下游：5′-ACCTTCAGGCTCAACCAACAG-3′，目的片段長度：187 bp；NF-κBp65：上游：5′-,下游：5′-GGGTGCGTCTTAGTGGTATCTG-3′,目的片段長度：168 bp；eNOS：上游：5′-GCAACAAACCGAGGCAATC-3′，下游：5′-GGTCCAGCCATGTTGAATACAG-3′，目的片段長度：189 bp。β-actin作為內(nèi)參，2-△CT法計算相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面大體形態(tài)觀察

圖1顯示，正常對照組(B1、B2)與難愈合組(C1、C2)在造模14 d后創(chuàng)面仍未完全修復(fù)，而貝復(fù)濟(jì)組(D1、D2)與石香膏組(E1、E2)在造模14 d后創(chuàng)面修復(fù)情況較好，且石香膏組比貝復(fù)濟(jì)組愈合情況更好。

注：B1.造模后7 d正常對照組；B2.造模后14 d正常對照組；C1.造模后7 d難愈合組；C2.造模后14 d難愈合組；D1.造模后7 d貝復(fù)濟(jì)組；D2.造模后14 d貝復(fù)濟(jì)組；E1.造模后7 d石香膏組；E2.造模后14 d石香膏組圖1 干預(yù)7/14 d后正常對照組、難愈合組、貝復(fù)濟(jì)組、石香膏組大鼠創(chuàng)面大體形態(tài)觀察比較

注：B1.造模后7 d正常對照組；B2.造模后14 d正常對照組；C1.造模后7 d難愈合組；C2.造模后14 d難愈合組；D1.造模后7 d貝復(fù)濟(jì)組；D2.造模后14 d貝復(fù)濟(jì)組；E1.造模后7 d石香膏組；E2.造模后14 d石香膏組圖2 干預(yù)7/14 d后正常對照組、難愈合組、貝復(fù)濟(jì)組、石香膏組大鼠創(chuàng)面組織HE染色光鏡比較(HE×400)

2.2 創(chuàng)面組織鏡下觀察

圖2顯示，正常對照組(B1、B2)與難愈合組(C1、C2)在造模14 d后鏡下仍可見大片未修復(fù)組織，而貝復(fù)濟(jì)組(D1、D2)與石香膏組(E1、E2)在造模14 d后創(chuàng)面組織修復(fù)情況較好，鏡下可見較多的纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，促進(jìn)新生血管形成及創(chuàng)面修復(fù)，兩者比較石香膏組修復(fù)情況較好。

2.3 RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA和eNOS mRNA表達(dá)情況

表1顯示，干預(yù)7 d后與正常對照組比較，難愈合組中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量升高，eNOS mRNA相對表達(dá)量降低，石香膏組和貝復(fù)濟(jì)組中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量降低，eNOS mRNA相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與難愈合組比較，貝復(fù)濟(jì)組和石香膏組中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量降低，eNOS mRNA相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與貝復(fù)濟(jì)組比較，石香膏組中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量降低，eNOS mRNA相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 干預(yù)7 d后各組RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA和eNOS mRNA相對表達(dá)量比較

注：與同時間點正常對照組比較：(1)P<0.01；與同時間點難愈合組比較：(2)P<0.01；與同時間點貝復(fù)濟(jì)組比較：(3)P<0.01

表1顯示，干預(yù)14 d后與正常對照組比較，難愈合組中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量升高，eNOS mRNA相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。石香膏組RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量降低，eNOS mRNA相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與難愈合組比較，貝復(fù)濟(jì)組和石香膏組中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量降低，eNOS mRNA相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與貝復(fù)濟(jì)組比較，石香膏組RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

慢性難愈合潰瘍創(chuàng)面的中醫(yī)辨證屬于“癰疽”范疇?！鞍b疽”的中醫(yī)病機為各種原因?qū)е戮植繗庋斩簦}絡(luò)不暢，終致肉腐血敗。《素問·生氣通天論》所云:“營氣不從，逆于肉理，乃生癰腫?！苯?jīng)過長期的實踐與探索，形成了“提膿祛腐，煨膿長肉”的創(chuàng)新性理論體系。前者依據(jù)“腐不去則新肉不生”的理論，使用丹類藥物，使瘡瘍內(nèi)腐肉脫落，膿毒排出；后者則是指在瘡瘍祛腐排膿之后，運用斂瘡生肌、活血化瘀類藥物調(diào)節(jié)患處氣血，促進(jìn)局部組織快速生長。中藥“石香膏”是由乳香、沒藥、赤石脂、梔子、煅龍骨、冰片、爐甘石等藥物調(diào)制而成。方中乳香、沒藥均能活血定痛，消腫生??；赤石脂止血生肌，收濕斂瘡；梔子清熱利濕，涼血解毒；煅龍骨收斂固澀；冰片清熱解毒，去腐生??；爐甘石收濕止癢斂瘡解毒。膏中溶劑為麻油和蜂蠟，不僅能保持創(chuàng)面的濕潤，還能避免藥物對皮膚的過度刺激，以充分促進(jìn)創(chuàng)面肉芽的生長及上皮組織的再生。現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為，乳香能通過抑制促炎癥反應(yīng)細(xì)胞活素類的生成，減少基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌與活性進(jìn)行抗炎、抗菌以及抗?jié)僛10]；沒藥、赤石脂能縮短凝血酶時間，抑制血小板聚集，使傷口具有良好的祛瘀、止血效果[11-12]；梔子具有抗氧化、抗細(xì)胞凋亡和促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的功能[13]；煅龍骨中的鋅參與核酸及蛋白質(zhì)代謝，維持細(xì)胞膜的正常生理功能和調(diào)節(jié)機體免疫功能，積極參與損傷的修復(fù)過程，有助于慢性難愈合傷口的愈合[14]；冰片具有消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌的作用，特別是對金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用[15]；爐甘石能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，加快毛細(xì)血管生長，促進(jìn)血液循環(huán)，最終加快傷口愈合[16]。將這些藥物聯(lián)合使用，起到“提膿祛腐，煨膿長肉”的治療效果。貝復(fù)濟(jì)作為本次試驗的對照藥物，具有改善局部血液循環(huán)，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的作用。

創(chuàng)面修復(fù)是一個包括凝血過程、組織增殖等多個階段的復(fù)雜過程。由于致傷因子的作用造成局部組織破壞缺損，局部組織通過再生、修復(fù)、重建等一系列過程對患處進(jìn)行修補[17]。糖尿病患者因為長期處于高血糖狀態(tài)下，易生成AGEs(Advanced glycation end products，糖基化終末產(chǎn)物)，此物質(zhì)為體內(nèi)蛋白在非酶糖化和氧化反應(yīng)下與還原糖結(jié)合形成的結(jié)構(gòu)，對創(chuàng)面愈合有抑制作用[18]。由于AGEs在各種細(xì)胞中的積累，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能可能會隨著RAGE的參與而變化。RAGE是AGEs的受體，是細(xì)胞表面分子免疫球蛋白家族的成員，由多種細(xì)胞表達(dá)，可能介導(dǎo)炎癥體的激活和隨后炎癥介質(zhì)的釋放，從而促進(jìn)天然免疫反應(yīng)的傳播[19-20]。當(dāng)AGEs和RAGE結(jié)合后，觸發(fā)不同的信號傳導(dǎo)。NF-κB即為其產(chǎn)物之一，NF-κB是具有轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)功能的一種轉(zhuǎn)錄因子，由p50和p65等亞基組成，其中p65亞基是NF-κB中分布最廣、作用最強的成員[21]。NF-κB的激活會促進(jìn)多種基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，破壞組織修復(fù)細(xì)胞[22]。p65亞基的增加會促進(jìn)RAGE抑制抗炎因子的同時增加促炎因子的活性，抑制組織修復(fù)。NF-κBp65的活化靶向激活許多基因表達(dá)，如TF、p21 RAS、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK 1/2)以及RAGE本身的表達(dá)。這些促氧化基因的激活可以促進(jìn)NOS(Nitric oxidesynthase，一氧化氮合酶)在其他輔助因子的作用下，使NO(一氧化氮)分泌增加,可以促進(jìn)血管修復(fù)再生，在調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)方面有重要作用。eNOS是NOS其中的一個同工酶，產(chǎn)生的NO可以調(diào)節(jié)如蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運、氧化還原等過程。皮膚創(chuàng)面組織主要表達(dá)的是eNOS，并由eNOS維持皮膚組織中NO代謝的平衡[23-24]。

本次研究通過建立實驗性慢性難愈合創(chuàng)面大鼠模型，觀察了中藥“石香膏”外敷對其創(chuàng)面RAGE、NF-κBp65、eNOS信號通路mRNA的表達(dá)情況。研究表明，與慢性難愈合創(chuàng)面組比較，石香膏處理慢性難愈合創(chuàng)面組與貝復(fù)濟(jì)處理慢性難愈合創(chuàng)面組RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量降低，eNOS mRNA相對表達(dá)量升高。其中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA降低程度在7 d、14 d時石香膏處理慢性難愈合創(chuàng)面組均優(yōu)于貝復(fù)濟(jì)處理慢性難愈合創(chuàng)面組。而對于eNOS mRNA，在7 d時石香膏處理慢性難愈合創(chuàng)面組其表達(dá)量優(yōu)于貝復(fù)濟(jì)組，在14 d時兩者未見明顯差異。綜上所述，石香膏對于難愈性創(chuàng)面的修復(fù)效果優(yōu)于貝復(fù)濟(jì)。本次動物實驗研究初步闡明了中藥石香膏對于慢性難愈合創(chuàng)面具有修復(fù)作用，推測其作用機制之一為抑制RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA表達(dá)，減少細(xì)胞組織損害，從而促進(jìn)eNOS mRNA的表達(dá)，增加NO分泌，有助于創(chuàng)面的血管新生和傷口愈合，為臨床中醫(yī)治療慢性難愈合創(chuàng)面開拓了新的思路與方法。