高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定氨咖愈敏溶液中4種成分含量

梁愛(ài)仙，龐發(fā)根，劉 敏，李玉蘭

（廣東省深圳市藥品檢驗(yàn)研究院·廣東省深圳市藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518057）

氨咖愈敏溶液為抗感冒類(lèi)復(fù)方制劑，主要含對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、愈創(chuàng)木酚甘油醚和馬來(lái)酸氯苯那敏4種成分，用于減輕由感冒（包括流行性感冒）引起的發(fā)熱、頭痛、咽痛、鼻塞、流涕、咳嗽、咳痰等癥狀[1]。現(xiàn)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[2-3]中4種成分均采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定含量，其中對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因和愈創(chuàng)木酚甘油醚3種成分在同一流動(dòng)相體系下測(cè)定，而馬來(lái)酸氯苯那敏會(huì)在溶液中解離為馬來(lái)酸和氯苯那敏[4]，由于氯苯那敏極性很小，在C18柱上保留較強(qiáng)，易形成拖尾峰，故在另一洗脫能力較強(qiáng)的流動(dòng)相體系下測(cè)定。為了提高檢測(cè)效率[5]，節(jié)約成本，本研究中建立了同時(shí)測(cè)定氨咖愈敏溶液中上述4種成分含量的HPLC法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD型高效液相色譜儀（日本島津公司，包括高壓四元泵，在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測(cè)器、LCsolution工作站）；XS205DU型電子天平、MP220型pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）；Millipore Q純水器（德國(guó)默克公司）。

1.2 試藥

對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品（批號(hào)100018-201610，含量為99.9%）、咖啡因?qū)φ掌罚ㄅ?hào)171215-201211，含量為99.9%）、馬來(lái)酸氯苯那敏對(duì)照品（批號(hào)100047-201507，含量為99.7%）、愈創(chuàng)木酚甘油醚對(duì)照品（批號(hào)100528-201303，含量為99.6%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；氨咖愈敏溶液（批號(hào)分別為151105，160205，160407，規(guī)格為每1mL含對(duì)乙酰氨基酚12.0mg，無(wú)水咖啡因1.875 mg，愈創(chuàng)木酚甘油醚3.750 mg和馬來(lái)酸氯苯那敏0.112 5 mg）購(gòu)于北京九龍制藥有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

圖1 高效液相色譜圖

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：磷酸三乙胺緩沖液（取三乙胺3.0 mL，加水至1 000 mL，用磷酸調(diào) pH 至 2.6）-乙腈（85 ∶15，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：264 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：分別稱(chēng)取對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品約12 mg，咖啡因?qū)φ掌芳s9.5 mg，愈創(chuàng)木酚甘油醚對(duì)照品約9.5 mg，馬來(lái)酸氯苯那敏對(duì)照品約11 mg，精密稱(chēng)定，分別置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，作對(duì)照品貯備液，臨用前用流動(dòng)相稀釋成含對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、愈創(chuàng)木酚甘油醚和馬來(lái)酸氯苯那敏質(zhì)量濃度分別約為 120，19，38，22 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：精密量取氨咖愈敏溶液5 mL，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容，濾過(guò)，作供試品溶液Ⅰ（用于測(cè)定馬來(lái)酸氯苯那敏，約相當(dāng)于22.4 μg/mL），精密量取續(xù)濾液5 mL，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋并定容，作供試品溶液Ⅱ（用于測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因和愈創(chuàng)木酚甘油醚，分別約相當(dāng)于120.00，18.75，37.50 μg/mL）。

陰性對(duì)照溶液：按處方組成，取處方中不含4種主成分的輔料成分，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果所建立的方法對(duì)該4種成分分離良好，分離度均大于1.5，拖尾因子均在0.95～1.05之間，理論板數(shù)均大于5 000。

線性關(guān)系考察：將對(duì)照品貯備液稀釋成系列對(duì)照品溶液，照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以待測(cè)成分峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性方程和范圍試驗(yàn)結(jié)果（n=7）

精密度試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、愈創(chuàng)木酚甘油醚、馬來(lái)酸氯苯那敏峰面積的RSD分別為 0.51%，0.60%，0.44%，1.12%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)151105），分別于室溫下放置 0，6，12，18，24 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、愈創(chuàng)木酚甘油醚、馬來(lái)酸氯苯那敏峰面積的RSD分別為1.23%，0.96%，1.21%，1.33%（n=5），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)151105）6份，依法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，代入對(duì)應(yīng)的線性方程計(jì)算。結(jié)果對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、愈創(chuàng)木酚甘油醚、馬來(lái)酸氯苯那敏含量平均值分別為12.43，1.823，3.782，0.01099g/L，RSD分別為 1.21%，0.81%，1.43%，1.50%（n=6），表明方法重復(fù)性良好[6]374-378。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批樣品（批號(hào)151105）2.5 mL，共 9份，置25 mL容量瓶中，分3組，分別精密加入對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品、咖啡因?qū)φ掌贰⒂鷦?chuàng)木酚甘油醚對(duì)照品和0.11 g/L的馬來(lái)酸氯苯那敏對(duì)照品溶液（取1.1 g/L的馬來(lái)酸氯苯那敏對(duì)照品貯備液10.00 mL，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋定容，即得），按供試品溶液制備方法制備成低、中、高質(zhì)量濃度的溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定4種成分的峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 樣品含量測(cè)定

取不同批號(hào)的樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、愈創(chuàng)木酚甘油醚和氯苯那敏含量，并與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[2]比較。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

3 討論

氨咖愈敏溶液中，馬來(lái)酸氯苯那敏的含量低，不到對(duì)乙酰氨基酚含量的1%，故這2種成分不適合在同一供試品溶液中測(cè)定[7]。故本研究中分別配制2種不同質(zhì)量濃度的供試品溶液。經(jīng)全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在混合對(duì)照品溶液中，對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、愈創(chuàng)木酚甘油醚和氯苯那敏分別在245，272，274，264 nm波長(zhǎng)處有最大吸收?？紤]到氨咖愈敏溶液中對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因和愈創(chuàng)木酚甘油醚的含量較高，且最大吸收峰均較寬，在264 nm波長(zhǎng)處仍有較強(qiáng)吸收，故本研究中選擇氨咖愈敏溶液中含量最低的氯苯那敏的最大吸收波長(zhǎng)264 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)[8]。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（g/L，n=3）

本研究中建立的流動(dòng)相體系能較好地分離該4種成分。溶劑色譜峰和輔料色譜峰均能與最先出峰的對(duì)乙酰氨基酚色譜峰分離[9]318-319，不干擾測(cè)定；最后出峰的氯苯那敏色譜峰[9]62-63在約32 min時(shí)出峰，質(zhì)量濃度線性范圍內(nèi)峰形均較好，質(zhì)量濃度約為22 μg/mL時(shí)，拖尾因子為1.04，符合要求[6]59-61；高質(zhì)量濃度（大于 100 μg/mL）略有拖尾，拖尾因子為 1.15。

3批樣品含量測(cè)定結(jié)果與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法的結(jié)果相近。本研究中在同一種流動(dòng)相體系下同時(shí)測(cè)定氨咖愈敏溶液中4種成分，方法比現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)更簡(jiǎn)便、快速。