GC法同時(shí)測定鮮竹瀝中10種成分

肖小武， 林凱鵬， 周志強(qiáng)， 付輝政， 羅躍華， 陳偉康， 洪 挺

(江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院,江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心,國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330029)

鮮竹瀝為禾本科植物粉綠竹PhyllostachysglaucaMcCluve、凈竹PhyllostachysnudaMcClure及同屬數(shù)種植物的鮮桿經(jīng)加熱后自然瀝出的液體[1]，具有清熱化痰功效，用于肺熱咳嗽痰多、小兒痰熱驚風(fēng)等癥[2]，含酚類、糖、氨基酸等成分，其中有效物質(zhì)是愈創(chuàng)木酚、苯酚等及其同系酚性成分[3-7]，但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)以鮮竹瀝為主要原料的復(fù)方鮮竹瀝液等品種中的酚類進(jìn)行控制[8]，相關(guān)研究報(bào)道僅涉及愈創(chuàng)木酚、苯酚[9-12]，而多組分測定只見UV法測定總酚含量及GC-MS法測定其相對(duì)含量[13-15]。本實(shí)驗(yàn)在前期對(duì)鮮竹瀝中糖和氨基酸研究的基礎(chǔ)上[16-17]，建立GC法同時(shí)對(duì)苯酚、對(duì)甲基苯酚、對(duì)乙基苯酚3個(gè)苯酚及其同系物，以及愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚、異丁香酚、4-烯丙基-6甲氧基愈創(chuàng)木酚7個(gè)愈創(chuàng)木酚及其同系物的含量進(jìn)行測定，以期為原材料選取及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 8890B型GC色譜儀(美國Agilent公司)，配置氫火焰離子化檢測器(FID)、7693型液體自動(dòng)進(jìn)樣器、Openlab色譜工作站；BT25S型電子天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。愈創(chuàng)木酚(批號(hào)111510-200202，純度100.0%)、4-甲基愈創(chuàng)木酚(批號(hào)AL190815-27，純度99.98%)、苯酚(批號(hào)G181013-04，純度99.61%)、4-乙基愈創(chuàng)木酚(批號(hào)ZS190617-02，純度98.46%)、甲基苯酚(批號(hào)G201021-05，純度99.34%)、乙基苯酚(批號(hào)G191026-03，純度99.27%)、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚(批號(hào)MX190811-23，純度98.46%)、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚(批號(hào)MA190816-07，純度99.08%)、異丁香酚(批號(hào)82718，純度99.0%)、4-烯丙基-6-甲氧基愈創(chuàng)木酚(批號(hào)93727，純度99.0%)對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院)。剛竹屬毛竹、淡竹(粉綠竹)、凈竹、雷竹、毛金竹、高節(jié)竹及大明竹屬苦竹、仙居苦竹均采自江西省林業(yè)科學(xué)院竹類國家林木種質(zhì)資源庫，經(jīng)江西省林業(yè)科學(xué)院竹類研究所余林副研究員鑒定為正品，并委托江西仁安藥業(yè)有限公司通過工業(yè)生產(chǎn)干餾制備了鮮竹瀝各3批。乙醚等其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對(duì)甲基苯酚、對(duì)乙基苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚、異丁香酚、4-烯丙基-6-甲氧基愈創(chuàng)木酚對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.240 8、0.349 4、0.373 6、0.281 6、0.305 2、0.254 8、0.270 4、0.454 9、0.255 8、0.252 8 mg/mL的溶液，精密移取2.5 mL至25 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試品溶液制備 精密量取鮮竹瀝20 mL,稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1～2,乙醚振搖提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，乙醚液用20 mL 5%碳酸氫鈉溶液洗滌，分離乙醚層，揮干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL,即得。

2.3 色譜條件 DB-WAX色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；載氣N2，柱體積流量3.5 mL/min；分流比30∶1；進(jìn)樣口溫度260 ℃；程序升溫(初始溫度75 ℃，保持0.5 min，5 ℃/min升至150 ℃保持0.5 min，3 ℃/min升至210 ℃)；FID檢測器溫度300 ℃；進(jìn)樣量1 μL。色譜圖見圖1。

1.愈創(chuàng)木酚 2.4-甲基愈創(chuàng)木酚 3.苯酚 4.6-甲氧基愈創(chuàng)木酚 5.對(duì)甲基苯酚 6.對(duì)乙基苯酚 7.4-乙烯基愈創(chuàng)木酚8.4-乙基愈創(chuàng)木酚 9.異丁香酚 10.4-烯丙基-6甲氧基-愈創(chuàng)木酚1.guaiacol 2.4-methyl guaiacol 3. phenol 4.6-methoxy guaiacol 5.p-methyl phenol 6.p-ethyl phenol 7.4-vinyl guaiacol 8.4-ethyl guaiacol 9.isoeugenol 10.4-allyl-6-methoxy guaiacol圖1 各成分GC色譜圖Fig.1 GC chromatograms of various constituents

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，依次稀釋成所需質(zhì)量濃度，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對(duì)甲基苯酚、對(duì)乙基苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚、異丁香酚、4-烯丙基-6甲氧基愈創(chuàng)木酚峰面積RSD分別為0.97%、1.22%、1.62%、0.60%、0.79%、0.65%、1.00%、0.85%、1.69%、0.82%，表明儀器精密度良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批鮮竹瀝(雷竹)，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對(duì)甲基苯酚、對(duì)乙基苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚、異丁香酚、4-烯丙基-6甲氧基愈創(chuàng)木酚含量RSD分別為1.02%、0.87%、0.96%、1.21%、0.54%、0.62%、1.25%、0.53%、0.67%、0.81%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批鮮竹瀝(雷竹)，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、6、12、18、24 h在“2.3”色譜條件下進(jìn)樣測定，測得愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對(duì)甲基苯酚、對(duì)乙基苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚、異丁香酚、4-烯丙基-6甲氧基愈創(chuàng)木酚峰面積RSD分別為0.46%、0.86%、1.06%、0.87%、1.16%、1.49%、1.24%、0.65%、1.30%、0.65%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取各成分含量已知的鮮竹瀝液(雷竹)6份，每份10 mL，精密加入等量對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，苯酚、甲基苯酚、愈創(chuàng)木酚、乙基苯酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚、異丁香酚、4-烯丙基-6-甲氧基愈創(chuàng)木酚平均加樣回收率分別為96.69%、97.68%、99.02%、98.88%、99.06%、99.77%、98.16%、101.01%、99.40%、98.23%，RSD分別為1.38%、1.88%、2.64%、2.51%、1.88%、2.74%、0.79%、1.41%、2.48%、1.32%。

2.4.6 樣品含量測定 取8種基原樣品各3批，每批2份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”色譜條件下進(jìn)行測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 不同基原樣品中各成分含量測定結(jié)果(μg/mL，n=2)

3 討論

3.1 前處理?xiàng)l件考察

3.1.1 萃取溶劑 本實(shí)驗(yàn)考察了正丁醇、乙酸乙酯、乙醚，以各成分含量為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于乙醚，正丁醇、乙酸乙酯萃取所得愈創(chuàng)木酚、丁香醛含量較低，而且乙醚更易揮發(fā)，故選擇其作為萃取溶劑。

3.1.2 萃取體積和次數(shù) 本實(shí)驗(yàn)考察了10、20、 30、40 mL乙醚萃取不同次數(shù)，以各成分含量為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)與樣品同等體積時(shí)含量達(dá)到最高，增加體積、次數(shù)無明顯變化，故選擇20 mL乙醚萃取3次。

3.2 色譜條件優(yōu)化 由于6-甲氧基愈創(chuàng)木酚色譜峰較大，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚較小，而且兩者較難分離，故參考文獻(xiàn)[18]對(duì)升溫程序和分流比進(jìn)行優(yōu)化。在保證各成分色譜峰分離度、峰形、出峰時(shí)間的情況下，確定為“2.3”項(xiàng)下色譜條件。

3.3 結(jié)果分析

3.3.1 基原 不同基原樣品中各成分總含量依次為毛竹>毛金竹>淡竹>雷竹>苦竹>仙居苦竹>苦竹>凈竹>高節(jié)竹；在愈創(chuàng)木酚及其同系物和苯酚及其同系物的含量方面，毛竹最高。目前，鮮竹瀝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未涉及毛竹，只列出淡竹和凈竹，但調(diào)研發(fā)現(xiàn)，江西、浙江、湖南等鮮竹瀝主產(chǎn)區(qū)毛竹資源豐富，淡竹、凈竹相對(duì)匱乏，故企業(yè)采用毛竹為原料來加工炮制。基于上述情況，建議修訂相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)將毛竹納入其中。

3.3.2 成分種類 不同基原樣品中含量最高的成分均為6-甲氧基愈創(chuàng)木酚，其次是愈創(chuàng)木酚，但現(xiàn)行鮮竹瀝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并未對(duì)酚類進(jìn)行質(zhì)量控制，而2020年版《中國藥典》對(duì)復(fù)方鮮竹瀝液、竹瀝達(dá)痰丸也未作類似規(guī)定。因此，建議修訂相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)將6-甲氧基愈創(chuàng)木酚、愈創(chuàng)木酚等成分或多組分酚類特征圖譜納入其中。

3.3.3 成分限度 6-甲氧基愈創(chuàng)木酚在毛竹、毛金竹中的含量均高于200.00 μg/mL，但在凈竹、高節(jié)竹中均低于50.00 μg/mL；愈創(chuàng)木酚在毛竹、毛金竹中含量均高于50.00 μg/mL，但在凈竹、高節(jié)竹中均低于5.00 μg/mL。按平均值的70%計(jì)算，暫定為每1 mL鮮竹瀝含愈創(chuàng)木酚(C7H8O2)不得少于40.0 μg，6-甲氧基愈創(chuàng)木酚(C8H10O3)不得少于145.0 μg。另外，各成分含量差異較大，故采用特征圖譜作為多組分酚類的質(zhì)控指標(biāo)。