神經(jīng)節(jié)苷脂氟化寡糖在大腸桿菌中的生物合成

劉新平 譚玉萌 張雪 馮雁 楊廣宇

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240）

神經(jīng)節(jié)苷脂是由含唾液酸的寡糖和神經(jīng)酰胺組成的鞘糖脂類化合物，廣泛存在于所有脊椎動(dòng)物細(xì)胞中，尤其是在神經(jīng)細(xì)胞中含量豐富。它們在細(xì)胞識別、細(xì)胞免疫、細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用［1-2］。GM1是目前研究最深入的神經(jīng)節(jié)苷脂，在神經(jīng)退行性疾病如外傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、早期阿爾茲海默癥等疾病中體現(xiàn)了重要的藥物活性［3］。GM2和GM3廣泛參與細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等過程。在多種腫瘤細(xì)胞中，GM2和GM3表達(dá)增強(qiáng)并參與腫瘤的遷移過程，成為藥物開發(fā)的靶標(biāo)［4-5］。因此，發(fā)展神經(jīng)節(jié)苷脂的高效制備技術(shù)，對于研究此類化合物的生理功能、作用機(jī)制及促進(jìn)新藥開發(fā)均具有重要意義。

神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以利用傳統(tǒng)化學(xué)催化方法進(jìn)行合成。目前其主要生產(chǎn)來源是從天然生物組織如豬腦、牛腦中進(jìn)行提取，但仍存在成本高、收率低、提取過程污染嚴(yán)重等局限［6-7］。近年來，利用生物系統(tǒng)進(jìn)行神經(jīng)節(jié)苷脂的人工合成研究取得很大進(jìn)展。例如Yu等［8-9］開發(fā)了以糖基轉(zhuǎn)移酶為基礎(chǔ)的一鍋多酶（One-pot multienzyme，OPME）催化體系，但該體系中需要近10種酶協(xié)同作用，酶的表達(dá)、提取步驟繁多且需要消耗大量昂貴的糖核苷酸等底物，難以實(shí)現(xiàn)大量合成。Fierfort和Antoine等［10-11］利用代謝工程手段，在大腸桿菌體內(nèi)構(gòu)建了一系列用于神經(jīng)節(jié)苷脂寡糖模塊合成的細(xì)胞工廠，但是由于缺少寡糖鏈和神經(jīng)酰胺鏈的連接方法，無法實(shí)現(xiàn)完整神經(jīng)節(jié)苷脂的合成。本實(shí)驗(yàn)在前期研究工作中，基于合成生物學(xué)理念提出了新的神經(jīng)節(jié)苷脂合成體系［12］（圖1）。該體系主要分為3步：（1）以氟化乳糖為底物，利用糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成神經(jīng)節(jié)苷脂氟化寡糖；（2）利用糖苷合成酶EGCase獨(dú)特的催化活性，催化神經(jīng)節(jié)苷脂氟化寡糖與鞘氨醇組裝形成糖基鞘氨醇；（3）在鞘糖脂N-?；窼CDase催化下，糖基鞘氨醇與硬脂酸縮合形成完整的神經(jīng)節(jié)苷脂。

神經(jīng)節(jié)苷脂氟化寡糖的高效合成是上述整個(gè)合成體系的關(guān)鍵步驟。本研究以Escherichia coliJM107為出發(fā)菌株，該菌株敲除了半乳糖苷酶基因lacZ和唾液酸醛縮酶基因nanA，避免了氟化乳糖和唾液酸底物在胞內(nèi)被大量降解。在此基礎(chǔ)上，在大腸桿菌中引入腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）來源的CMP-NeuAc合成酶（neuA）［13］、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）來源的 α 2，3-NeuAc轉(zhuǎn)移酶（cst）［14］、β 1，4-GalNAc轉(zhuǎn)移（cgtA）［15］、β 1，3-Gal轉(zhuǎn)移酶（cgtB）［16］和 UDP-GlcNAc 異構(gòu)酶（gne）［17］，從而構(gòu)建以氟化乳糖和唾液酸為底物的神經(jīng)節(jié)苷脂GM3、GM2和GM1氟化寡糖生物合成途徑（圖2）。

1 材料與方法

1.1 材料

圖1 完整神經(jīng)節(jié)苷脂GM3、GM2和GM1合成體系

圖2 神經(jīng)節(jié)苷脂GM3、GM2、GM1氟化寡糖生物合成途徑

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 敲除了nanA和lacZ兩個(gè)基因的Escherichia coliJM107作為出發(fā)菌株用于人工生物途徑的構(gòu)建，該菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。Escherichia coliDH5α用于載體的構(gòu)建，購自全式金生物有限公司。質(zhì)粒pUC18由本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pBBR1MSC3，pACYC184購自湖南豐暉生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 PrimeSTAR Max Premix DNA聚合酶購于日本Takara公司；對氨基苯甲酸、氰基硼氫化鈉、醋酸鈉等衍生試劑購自阿拉丁試劑有限公司；相關(guān)氟化寡糖由本實(shí)驗(yàn)室保存；唾液酸、甲酸、甲酸銨等購自Sigma公司；乙腈等液相用品購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。LB培養(yǎng)基氯化鈉10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 目的基因neuA（GenBank：U60146.1），cst（GenBank：AF130466.2），gne（GenBank：905422），cgtA（GenBank：AF401528.1），cgtB（GenBank：AF130984.1）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。重組載體采用重疊延伸PCR（Prolonged Overlap Extension cloning）的方法構(gòu)建而成［18］。以重組質(zhì)粒pUC18-neuA-cst的構(gòu)建為例說明POEPCR的具體方法。在引物設(shè)計(jì)時(shí)，基因片段與載體之間，串聯(lián)基因之間均保留25 bp左右的同源臂，分別使用特異性引物IF1-neuA/IR1-neuA擴(kuò)增第一個(gè)插入片段neuA基因，引物IF2-cst/IR2-cst擴(kuò)增第二個(gè)插入片段cst基因，引物VF1-pUC18/ VR1-pUC18進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增來制備線性化載體。擴(kuò)增獲得的基因片段和線性載體進(jìn)行膠回收后，以基因片段和線性化載體互為模板和引物進(jìn)行下一輪的PCR擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化Escherichia coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐抗性的平板上挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)的菌液提取質(zhì)粒并測序驗(yàn)證，獲得重組質(zhì)粒pUC18-neuA-cst。另兩個(gè)重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法同上，gne和cgtA基因串聯(lián)克隆至pBBR1MSC3載體，獲得重組質(zhì)粒pBBR1MCS3-gne-cgtA，cgtB基因克隆至pACYC184載體，獲得重組質(zhì)粒pACYC184-cgtB。引物設(shè)計(jì)見表1。

1.2.2 工程菌株的構(gòu)建 將單質(zhì)粒pUC18-neuA-cst轉(zhuǎn)入Escherichia coliJM107感受態(tài)細(xì)胞中，利用氨芐抗性平板篩選得到GM3氟化寡糖合成的菌株Strain-GM3。將雙質(zhì)粒pUC18-neuA-cst和pBBR1MCS3-gnecgtA電轉(zhuǎn)化至Escherichia coliJM107感受態(tài)細(xì)胞中，利用氨芐和四環(huán)素雙抗平板篩選得到GM2氟化寡糖合成的菌株Strain-GM2。將3質(zhì)粒pUC18-neuA-cst、pBBR1MCS3-gne-cgtA和pACYC184-cgtB共同轉(zhuǎn)化Escherichia coliJM107菌株，利用氨芐、四環(huán)素和氯霉素三抗平板篩選獲得GM1氟化寡糖合成的菌株Strain-GM1。

1.2.3 工程菌株的發(fā)酵 挑取Strain-GM3、Strain-GM2、Strain-GM1的單克隆分別接種于相對應(yīng)抗性的4 mL液體LB培養(yǎng)基中，于37℃恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)過夜。按1%的接菌量將3種新鮮菌液接種至200 mL含相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃的恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8左右。加入終濃度為50 mg/L的IPTG誘導(dǎo)劑、終濃度為2 g/L的氟化乳糖和終濃度為1.5 g/L的唾液酸，于30℃恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)90 h，并在培養(yǎng)過程中取樣分析。

表1 重組載體構(gòu)建引物設(shè)計(jì)

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的檢測及鑒定 使用HPLC柱前衍生的方法對GM3、GM2、GM1氟化寡糖進(jìn)行定量檢測。利用對氨基苯甲酸衍生化試劑對3種寡糖還原端的醛基進(jìn)行衍生化，衍生試劑為：10 mg/mL對氨基苯甲酸和10 mg/mL氰基硼氫化鈉溶于4%（W/V）醋酸鈉-甲醇緩沖液中。取不同發(fā)酵時(shí)間下的新鮮發(fā)酵液，超聲破碎收集上清液，加入4倍體積的衍生試劑，置于70℃的恒溫水浴中保溫45 min后終止反應(yīng)，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液用于HPLC檢測。3種寡糖標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的衍生化處理方法保持一致。HPLC檢測系統(tǒng)是配有熒光檢測器的安捷倫1260高效液相色譜系統(tǒng)，液相色譜柱為 HALO Glycan（4.6×150 mm，2.7 μm）；熒光檢測（FLD）激發(fā)波長Ex = 313 nm，發(fā)射波長Em = 358 nm；流動(dòng)相A為0.05 mol /L甲酸銨水溶液，流動(dòng)相C為純乙腈；洗脫條件：0-2 min 80% C，2-10 min 80% C到55% C，10-12 min 55% C，12-12.5 min 55%C到80% C，12.5-15 min 80% C；流速為0.6 mL/min；進(jìn)樣量為3 mL。LC-MS檢測系統(tǒng)是安捷倫6500系列四極桿（Q-TOF）液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，色譜條件同上，ESI負(fù)離子源，分子量掃描范圍100-1 100。

1.2.5 工程菌株的優(yōu)化 透酶的過表達(dá)：透酶基因lacY和nanT合成后，利用相同的載體構(gòu)建方法，將lacY-nanT片段插入pUC18質(zhì)粒得到pUC18-neuA-cst-lacY-nanT。將新的重組載體分別替換原菌株中pUC18-neuA-cst質(zhì)粒，得到透酶過表達(dá)的寡糖合成菌株。啟動(dòng)子的更換：大腸桿菌啟動(dòng)子文庫由武漢大學(xué)劉天罡教授饋贈(zèng)，可以用于基因表達(dá)量的精確調(diào)控［19］。在大腸桿菌啟動(dòng)子文庫中選取強(qiáng)度不同的啟動(dòng)子，以pUC18質(zhì)粒原Lac啟動(dòng)子強(qiáng)度作為參照，實(shí)驗(yàn)中所用啟動(dòng)子由強(qiáng)到弱的排列順序?yàn)閜XET11、pXET31、pTrc、pLac、PXETa34、pXET41。在透酶過表達(dá)菌株的基礎(chǔ)上，將5組啟動(dòng)子片段分別替換pUC18質(zhì)粒上原有啟動(dòng)子片段，載體和菌株的構(gòu)建方法同上。包含不同啟動(dòng)子的菌株進(jìn)行平行發(fā)酵，以原菌株為對照，檢測寡糖產(chǎn)量的變化情況。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒及工程菌株的構(gòu)建

擴(kuò)增得到的neuA-cst片段的大小為1 551 bp，gne-cgtA片段的大小為2 158 bp，cgtB基因片段的大小為912 bp，neuA-cst-lacY-nanT片段大小為4 315 bp，與理論大小均一致。重組質(zhì)粒pUC18-neuA-cst、pBBR1MCS3-gne-cgtA、pACYC184-cgtB和 pUC18-neuA-cst-lacY-nanT經(jīng)基因測序驗(yàn)證正確，重組質(zhì)粒pUC18-neuA-cst-lacY-nanT的PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖3-E。Strain-GM1、Strain-GM2、Strain-GM3的構(gòu)建示意圖如圖3-A，3組菌株進(jìn)行菌落PCR鑒定（圖3-B-D），陽性克隆片段的大小均與理論大小一致，說明菌株構(gòu)建成功。

A：Strain-GM3、Strain-GM2、Strain-GM1 菌株構(gòu)建示意圖（斷裂箭頭表示敲除基因，實(shí)心箭頭表示引入基因，三角形表示啟動(dòng)子）。B：Strain-GM3菌液PCR驗(yàn)證 ，M：DNA Marker；1：neuA-cst片段PCR產(chǎn)物。C：Strain-GM2菌液PCR驗(yàn)證， M：DNA Marker；1：neuA-cst片段PCR產(chǎn)物；2：gne-cgtA片段PCR產(chǎn)物。D：Strain-GM1菌液PCR驗(yàn)證， M：DNA Marker；1：neuA-cst片段PCR產(chǎn)物；2：gne-cgtA片段PCR產(chǎn)物；3：cgtB 片段PCR產(chǎn)物。E：質(zhì)粒pUC18-neuA-cst-lacY-nanT的PCR驗(yàn)證，M：DNA Marker；1-2：neuA-cst-lacY-nanT片段PCR產(chǎn)物

2.2 寡糖定量檢測方法的建立

利用高效液相色譜建立了GM3、GM2、GM1氟化寡糖的定量檢測方法。3種產(chǎn)物檢出限均小于0.1 mg/L，GM3、GM2、GM1 氟化寡糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間分別為11.21 min、11.82 min、12.38 min。在0.5-100 mg/L檢測范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度和色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。工程菌株發(fā)酵液的檢測結(jié)果如圖4，LC-MS檢測顯示產(chǎn)物峰的m/z為634.2009、837.2798、999.3319，確定產(chǎn)物峰對應(yīng)的化合物為GM3、GM2、GM1氟 化 寡 糖。Strain-GM3、Strain-GM2、Strain-GM1菌株發(fā)酵液分別在11.24 min、11.83 min、12.39 min出現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物峰，與對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致。

2.3 工程菌株的發(fā)酵

Strain-GM3、Strain-GM2、Strain-GM1進(jìn) 行 搖瓶發(fā)酵。取樣時(shí)間為0、4、10、16、20、26、32、48、54、66、72、77和90 h。測定菌體的生長密度（OD600）并根據(jù)對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的濃度，菌株的生長及產(chǎn)量變化曲線如圖5，3種菌株在0-26 h期間均快速增長，26 h之后均逐漸趨于穩(wěn)定。GM3氟化寡糖在72 h左右產(chǎn)量最高達(dá)到約54.2 mg/L，GM2氟化寡糖在66 h左右產(chǎn)量最高達(dá)到約12.3 mg/L，GM1氟化寡糖在54 h左右產(chǎn)量最高達(dá)到約7.7 mg/L。

2.4 工程菌株的初步優(yōu)化

外源底物氟化乳糖和唾液酸分別在乳糖透酶lacY和唾液酸透酶nanT的作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，透酶過表達(dá)菌株的寡糖產(chǎn)量變化如圖6-A。以原菌株作對照，3種寡糖的產(chǎn)量均有20%左右的提升。不同啟動(dòng)子強(qiáng)度的菌株平行發(fā)酵結(jié)果如圖6-B-D）所示。以原Lac啟動(dòng)子作對照，GM3氟化寡糖合成菌株在利用pXET31啟動(dòng)子時(shí)產(chǎn)量提高約25%（圖6-B），GM2氟化寡糖合成菌株最適合的啟動(dòng)子仍為Lac，啟動(dòng)子更換的菌株產(chǎn)量均沒有提高（圖6-C），GM1氟化寡糖合成菌株在利用pXETa34啟動(dòng)子時(shí)產(chǎn)量增長約28%（圖6-D）。經(jīng)過優(yōu)化，GM3、GM2、GM1氟化寡糖的產(chǎn)量分別達(dá)到81.5 mg/L、18.1 mg/L和12.3 mg/L。

3 討論

本研究通過在Escherichia coliJM107中異源表達(dá)CMP-NeuAc合成酶，UDP-GlcNAc異構(gòu)酶和3種糖基轉(zhuǎn)移酶cst、cgtA和cgtB，在大腸桿菌體內(nèi)建立起神經(jīng)節(jié)苷脂GM3、GM2和GM1氟化寡糖的生物合成途徑。通過在大腸桿菌中表達(dá)兩種底物透酶lacY和nanT來提高底物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，可以有效促進(jìn)產(chǎn)物的生成。工程菌株啟動(dòng)子的優(yōu)化顯示，3種產(chǎn)物最適合的啟動(dòng)子強(qiáng)度均不相同。經(jīng)過初步改造，3種寡糖的產(chǎn)量均有所提升，但目前產(chǎn)量仍較低且兩種底物利用率不高，因此仍需要對人工合成途徑進(jìn)行更深入的解析和完善。

圖4 工程菌株發(fā)酵液HPLC檢測及LC-MS檢測結(jié)果

圖5 Strain-GM3（A）、Strain-GM2（B）、Strain-GM1（C）菌株生長及產(chǎn)量曲線

圖6 工程菌株的初步優(yōu)化

隨著代謝途徑的延長，GM3、GM2、GM1氟化寡糖的產(chǎn)量呈明顯下降趨勢，說明在代謝途徑中可能存在消耗寡糖產(chǎn)物的旁路途徑，或是外源表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶活性不足從而限制了下游產(chǎn)物的生成。使用更高效的同工酶有望進(jìn)一步提高寡糖的產(chǎn)量，如近來Klaudia等［20］發(fā)現(xiàn)并表征來源于Bibersteinia trehalosiand的一種新的α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶（BtST1），該酶在以乳糖為底物時(shí)，其催化活性是已報(bào)道同類酶中最高的，從而有利于唾液酸寡糖的合成。此外，也可以對代謝網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的中間代謝物建立系統(tǒng)的代謝組學(xué)分析方法，找到代謝途徑中的限速步驟，為合成途徑的優(yōu)化提供指導(dǎo)。如武漢大學(xué)劉天罡團(tuán)隊(duì)在利用鏈霉菌進(jìn)行多殺菌素的異源合成時(shí)，通過代謝組學(xué)的方法確定了多個(gè)多殺菌素鏈霉菌異源合成途徑中的限速步驟，經(jīng)過優(yōu)化后的產(chǎn)量相比于出發(fā)菌提高了約1 000倍［21］。

4 結(jié)論

本研究通過在Escherichia coliJM107中構(gòu)建神經(jīng)節(jié)苷脂GM3、GM2、GM1氟化寡糖的生物合成途徑。以氟化乳糖和唾液酸為底物，首次實(shí)現(xiàn)了3種神經(jīng)節(jié)苷脂GM3、GM2、GM1氟化寡糖在大腸桿菌中的生物合成。