康艾注射液和苦參素注射液對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效果評(píng)價(jià)

任德偉 李先鋒 馮麗娜 張淑娟

康艾注射液是我國(guó)研制的新型抗惡性腫瘤中成藥，組方為人參、黃芪、苦參素三味中藥，對(duì)直腸癌、婦科腫瘤、原發(fā)性肝癌等均有較好療效[1]?？鄥⑺刈⑸湟褐饕煞譃檠趸鄥A(oxymatrin，OMT)，是純化的草藥中有效成分，又稱“苦參素”，OMT及其活性代謝物苦參堿(matfine，MT)被研究證實(shí)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和表達(dá)[2]。因此，猜測(cè)復(fù)方康艾注射液的抗腫瘤作用可能與之有關(guān)，但其主要成分及作用機(jī)制尚未明確。因此為深入探討康艾注射液抗腫瘤作用機(jī)制，本研究對(duì)比了康艾注射液和苦參素注射液對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，旨在為康艾注射液作用機(jī)制明確提供一定參考。

1 儀器與材料

1.1儀器德國(guó)heraeus HERA Ceil 細(xì)胞培養(yǎng)箱，德國(guó)Heraes Biofuge Stratos 離心機(jī)，奧地利Tecan GeNios DNA Expen 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，新華安得YXQG02 蒸汽消毒器，德國(guó)Millipore Milli-Q SYNTHESIS 超純水制造系統(tǒng)，日本OLYMPUS PM-lOAD 顯微鏡。

1.2材料人胃癌SGC-7901細(xì)胞、人大腸癌細(xì)胞株HCT-8、人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910、人白血病細(xì)胞株K-562(中科院上海細(xì)胞所)，磷酸鹽緩沖液(美國(guó)賽默飛)，10%胎牛血清(四季青公司)，HyQ RPMt 1640培養(yǎng)基(?？寺」?，胰酶(Amerseo公司)，注射用青霉素鈉(山東濰坊制藥廠)，硫酸鏈霉素(大連美羅大藥廠)，康艾注射液(長(zhǎng)白山制藥股份有限公司)，苦參素注射液(山東方明藥業(yè)股份有限公司)，氯丁膠新型交聯(lián)劑(Sigma公司)，二甲基亞砜(天津瑞金特化學(xué)品有限公司)，NY 1483 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

2 方法

2.1復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)細(xì)胞株解凍SGC-7901細(xì)胞凍存管，應(yīng)用吸管吸取細(xì)胞液至無菌離心管，應(yīng)用離心機(jī)離心5 min(1500 rpm)，棄去上清液。加入磷酸鹽緩沖液后離心5 min(1500 rpm)，棄去上清液，重復(fù)2次。向凍存管中加入RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，應(yīng)用吸管輕輕吹打細(xì)胞，得到懸濁液，將其移入培養(yǎng)瓶，加適量1%雙抗及10%胎牛血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)瓶放培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37 ℃，5%CO2)1 d，觀察細(xì)胞貼壁情況，據(jù)情況換液。培養(yǎng)2～3 d后對(duì)生長(zhǎng)良好HO-8910細(xì)胞，用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，據(jù)貼壁細(xì)胞傳代要求分瓶傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。HCT-8、HO-8910同上法處理，K-562最后則按照懸浮細(xì)胞復(fù)蘇及傳代要求培養(yǎng)。

2.2瘤株藥敏試驗(yàn)取SGC-7901細(xì)胞懸液(5×104個(gè)/ml)100 μl接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)箱孵育24 h(5%CO2)，分別加苦參素注射液，濃度為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 g/L，加RPMt 1640培養(yǎng)基至200 μl，另外設(shè)置只加RPMt 1640培養(yǎng)基200 μl空白孔和只加細(xì)胞懸濁液200 μl對(duì)照孔。培養(yǎng)箱孵育72 h(5%CO2)，加5 mg/ml氯丁膠新型交聯(lián)劑20 μl，培養(yǎng)箱孵育4 h(5%CO2)后棄去上清液，每孔加二甲基亞砜200 μl。中速振蕩5 min，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A值)。計(jì)算生長(zhǎng)抑制率(inhibition ratio，IR)，IR(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A至/對(duì)照組平均A值)。同法測(cè)定其他細(xì)胞IR。

2.3抑瘤活性比較取SGC-7901細(xì)胞懸液(5×104個(gè)/ml)100 μl接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)箱孵育24 h(5%CO2)，分別加苦參素注射液和康艾注射液，濃度為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 g/l，加RPMt 1640培養(yǎng)基至200 μl，另設(shè)空白孔、對(duì)照孔。據(jù)2.2方法處理后計(jì)算IR，并應(yīng)用IC50計(jì)算軟件計(jì)算IC50。

2.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇抑制作用較強(qiáng)濃度，加入半數(shù)抑制濃度劑量，和腫瘤細(xì)胞作用48 h后，顯微鏡下觀察、攝片。用無藥的培養(yǎng)液作對(duì)照。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS18.0及Microsoft Excel軟件處理相關(guān)數(shù)據(jù)。組間IR比較行t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析采用線性回歸分析，r值越接近1表示正相關(guān)性越強(qiáng)。

3 結(jié)果

3.1藥物濃度和抑瘤效應(yīng)苦參素注射液和康艾注射液對(duì)SGC-7901、HCT-8、HO-8910、K-562細(xì)胞的IR隨濃度增高而增強(qiáng)，苦參素注射液和康艾注射液濃度與其對(duì)SGC-7901、HCT-8、HO-8910、K-562細(xì)胞的IR成正相關(guān)。同時(shí)相同濃度下苦參素注射液和康艾注射液對(duì)同種細(xì)胞IR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 康艾注射液和苦參素注射液對(duì)不同腫瘤細(xì)胞IR比較 (%)

3.2瘤株藥敏性差異不同腫瘤細(xì)胞對(duì)同一藥物的敏感性存在較大差異，苦參素和康艾對(duì)HO-8910細(xì)胞相對(duì)較為敏感。見表2。

表2 兩種藥物IC50比較 (例，%)

3.3細(xì)胞形態(tài)比較接種24 h后，對(duì)照組細(xì)胞在顯微鏡下觀察到SGC-7901、HCT-8、HO-8910細(xì)胞基本貼壁，K-562細(xì)胞飽滿，邊沿清晰。加苦參素注射液或康艾注射液后發(fā)現(xiàn)各腫瘤細(xì)胞逐漸變圓、體積變小，SGC-7901、HCT-8、HO-8910貼壁細(xì)胞減少，生長(zhǎng)受到抑制。

4 討論

不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性存在差異，且這種差異直接影響藥物作用效果，因此選擇敏感瘤株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)至關(guān)重要。王競(jìng)等[3]研究表明，苦參注射液對(duì)晚期胃癌患者具良好治療效果；蘇建偉等[4]研究表明，苦參素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具較好抑制作用；而曹晟丞等[5]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方苦參注射液可改善卵巢癌患者免疫功能，殺傷腫瘤細(xì)胞；同時(shí)吳迪炯等[6]研究發(fā)現(xiàn)，MT對(duì)白血病細(xì)胞株具有抑制效用。因此，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)后，分別選用人胃癌SGC-7901細(xì)胞、人大腸癌細(xì)胞株HCT-8、人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910、人白血病細(xì)胞株K-562進(jìn)行試驗(yàn)。據(jù)中藥配伍理論，不同中藥性質(zhì)不同，配伍后可發(fā)生各種變化，可能加強(qiáng)療效，亦可能降低療效[7]。康艾注射液除苦參素外，還含有黃芪、人參中提取的化學(xué)成分，目前關(guān)于各成分在該復(fù)方中的效應(yīng)機(jī)制尚不明確。但苦參素為該復(fù)方中的“君藥”，可能為其抑瘤作用的主要成分。本研究對(duì)兩種注射液對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的IR進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者抑瘤作用無顯著差別，故此推測(cè)苦參素可能為康艾注射液發(fā)揮抑瘤作用的主要物質(zhì)。復(fù)方中其他組分可能通過其他機(jī)制協(xié)助增強(qiáng)抗腫瘤作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪主要藥理成分黃芪皂苷、黃芪多糖、黃酮類等具有降血糖、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用，可促進(jìn)T細(xì)胞活化，提高機(jī)體免疫功能[8]；而人參具有抗炎、抗氧化、擴(kuò)血管、提高免疫力、增強(qiáng)造血功能等作用，可抑制癌細(xì)胞增值、侵襲及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[9]。MT可絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有學(xué)者認(rèn)為，MT可通過 p38 MAPK通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及遷移[10]；同時(shí)有學(xué)者認(rèn)為，MT可抑制 MAPK 信號(hào)通路中的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、應(yīng)激活化蛋白激酶及 p38 蛋白磷酸化，從而對(duì)髓系白血病細(xì)胞株起抑制作用[11]。同時(shí)MT還可通過另類激酶-轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase-signal transducerand activatorof transcription，JAK-STAT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減輕腫瘤炎癥反應(yīng)，通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路等抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[12，13]。

綜上所述，MT具有優(yōu)異抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用，且可能是康艾注射液中主要作用成分。