草莓抗枯萎病分子標(biāo)記初定位

史芳芳

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，烏魯木齊 830088）

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要漿果之一，隨著草莓設(shè)施栽培產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，草莓連作病害日趨嚴(yán)重。草莓枯萎病就是連作病害中的主要病害之一，可導(dǎo)致草莓產(chǎn)量和品質(zhì)的大幅度降低，嚴(yán)重危及草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。草莓枯萎病是由尖孢鐮刀菌草莓?；停‵usarium oxysporum f.sp.fragariae）寄生引起的一種真菌土傳病害，通過(guò)侵染根部在維管束內(nèi)蔓延，然后堵塞其導(dǎo)管并分泌有毒物質(zhì)，最后造成葉片萎蔫直至植株枯萎死亡［1］。病菌通過(guò)種苗、土壤、灌溉水和農(nóng)具等方式傳播，可在苗期或開花至收獲期發(fā)病，植株一旦發(fā)病會(huì)造成結(jié)果減少，果實(shí)不能正常膨大，品質(zhì)變劣，產(chǎn)量大幅度降低等，嚴(yán)重影響草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［2，3］。 近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)草莓設(shè)施栽培面積的不斷擴(kuò)大，草莓枯萎病在中國(guó)的一些主要種植區(qū)均有發(fā)生，危害也有逐年加重的趨勢(shì)［4］。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)枯萎病等真菌病害的防治主要依賴于化學(xué)藥劑，這無(wú)疑會(huì)給廣大消費(fèi)者的食品安全帶來(lái)威脅，而且常常防治效果不佳。另一方面，長(zhǎng)期大量使用農(nóng)藥會(huì)對(duì)環(huán)境造成不良影響。改變這種不利局面的最直接、經(jīng)濟(jì)有效的措施就是培育抗枯萎病草莓新品種。定位相關(guān)的抗病基因是培育草莓抗病新品種的基礎(chǔ)，在番茄、西瓜、棉花、黃瓜等農(nóng)作物中有枯萎病相關(guān)抗性基因定位的報(bào)道，對(duì)草莓抗性基因研究較多的主要有草莓白粉病、灰霉病、炭疽病等抗病基因［5-8］，而目前對(duì)于草莓枯萎病抗性基因的遺傳特性及其相關(guān)基因分子標(biāo)記的研究仍較少。為此，試驗(yàn)在前人對(duì)草莓中SSR分子標(biāo)記的研究基礎(chǔ)上，對(duì)草莓抗枯萎病的相關(guān)基因進(jìn)行初步定位，期望能夠找到與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，為未來(lái)的分子標(biāo)記輔助育種，篩選優(yōu)良抗病品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)中草莓親本紅顏、甜查理、紫金四季、寧玉、紫金香玉、章姬由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所草莓種苗繁育基地提供，后代優(yōu)系由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。抗病鑒定所用草莓枯萎病病原菌經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定分析為鐮刀菌。親本及優(yōu)系后代均種植于新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育苗網(wǎng)室冷棚。

1.2 方法

1.2.1 苗期枯萎病抗性分析 按照文獻(xiàn)［9］中抗病性鑒定方法，采用苗期人工灌根接種鑒定法和葉片離體培養(yǎng)法。試驗(yàn)接種所用病原菌分離自草莓感病根部，樣本采自新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所草莓育苗基地有典型癥狀的感病植株，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和柯赫法則驗(yàn)證為草莓枯萎病病原菌。

于草莓子苗有3片完全展開葉片時(shí)采用灌根法，慢慢灌根接種，每一營(yíng)養(yǎng)缽接種孢子懸浮液50 mL。接種后在25℃、高濕環(huán)境條件下培養(yǎng)。每一株系重復(fù)4次，每重復(fù)5株，計(jì)20株。接種后12～15 d進(jìn)行調(diào)查，根據(jù)植株感病癥狀對(duì)病株進(jìn)行病情分級(jí)。按感病葉片數(shù)占調(diào)查總?cè)~片數(shù)的百分率分感病等級(jí)。感病等級(jí)劃分為0～6級(jí)（圖1），等級(jí)0、1、2、3 級(jí)劃為抗病類型， 等級(jí) 4、5、6 級(jí)劃為感病類型。

圖1 枯萎病抗性鑒定等級(jí)

1.2.2 抗病基因的獲得 參考草莓抗病基因相關(guān)文獻(xiàn)，合成抗病相關(guān)基因引物NBS-1F：5′-CCCCCTCA ACACCTTTCCTTTTCT-3′，NBS-1R：5′-CAATCCCTG CGAGACAGAGATGAA-3′。提取父本、母本及后代優(yōu)系DNA，采用25 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，其中包括 1μL（約 50ng）模板 DNA、12.5 μL PCR buffer mix（含 Mg2+）、0.4 μmol／L 引物（上、下引物各 1 μL）、Taq DNA 聚合酶 0.4 μL、ddH2O 9.1 μL。 PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 4 min；94℃變性 30 s，55℃退火45s，72℃延伸 1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證能否擴(kuò)增出抗病全長(zhǎng)基因。

1.2.3 SSR標(biāo)記分析 試驗(yàn)選取20對(duì)薔薇科SSR引物，引物序列參考已發(fā)表的文獻(xiàn)［7，8］，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用25 μL PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系，其中包括 1 μL（約 50 ng）模板DNA、12.5 μL PCR buffer mix（含 Mg2+）、0.4 μmol／L引物（上、下引物各 1 μL）、Taq DNA 聚合酶 0.4 μL、ddH2O 9.1 μL。

1.2.4 多態(tài)性分子標(biāo)記篩選 20對(duì)引物以親本為模板，篩選出兩親本之間表現(xiàn)多態(tài)性的引物，再對(duì)8個(gè)后代優(yōu)系進(jìn)行分析。在后代產(chǎn)生差異且在兩親本間（高抗和高感親本）也存在差異條帶的引物組合即初步認(rèn)為是與抗枯萎病基因連鎖的SSR分子標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病性鑒定與遺傳分析

采用人工灌根法和葉片培養(yǎng)法進(jìn)行抗病試驗(yàn)，調(diào)查枯萎病的發(fā)病情況，結(jié)果見(jiàn)表1。灌根法和葉片培養(yǎng)法試驗(yàn)顯示，后代13-52-407和13-53-100具有很強(qiáng)的枯萎病抗性，抗性較強(qiáng)的兩個(gè)后代的親本均為章姬和甜查理，這可能遺傳了親本甜查理抗病性較強(qiáng)的特性，而13-65-265抗病性較差，其親本為紫金香玉與紅顏，可能后代遺傳了親本紅顏抗病性較差的特性，抗病性表現(xiàn)如圖2和圖3所示。

2.2 抗病基因NBS的擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)NBS引物首先對(duì)親本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，紫金四季和甜查理擴(kuò)增獲得一條約2 500 bp的特異條帶，對(duì)此擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果表明NBS全長(zhǎng)2 434 bp，基因組 DNA 包括 3 個(gè)外顯子，依次長(zhǎng) 629、780、682 bp，2個(gè)內(nèi)含子分別長(zhǎng)240 bp和103 bp。接著對(duì)父本和母本為紫金四季和甜查理的優(yōu)系進(jìn)行后代抗病性遺傳分析，優(yōu)系13-53-100、13-52-407也擴(kuò)增到此條帶，如圖4所示。結(jié)果表明抗病性基因篩選結(jié)果與“2.1”的抗病性試驗(yàn)結(jié)果一致。

表1 親本及后代材料抗感鑒定結(jié)果

圖2 葉片抗病性試驗(yàn)

圖3 灌根法抗病性試驗(yàn)

2.3 STR微衛(wèi)星分析

用20對(duì)引物對(duì)父本和母本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其中10對(duì)引物表現(xiàn)出多態(tài)性，分別為引物FSS6、FSS8、FSS50、FSS61、FSS65、FSS121、FSS128、FSS139、FSS143、UFFxa01H05，具體見(jiàn)表2。將這些篩選出的10對(duì)引物再對(duì)其優(yōu)系后代進(jìn)行分析，其中引物FSS121在后代13-52-407中擴(kuò)增出與母本甜查理一致的多態(tài)性條帶，條帶大小為193 bp和202 bp，其他引物擴(kuò)增出雜合帶，即出現(xiàn)與父本和母本不一致的條帶。通過(guò)微衛(wèi)星分析初步判斷，后代13-52-407遺傳了親本甜查理的抗病性（圖5）。

圖4 抗病性基因擴(kuò)增結(jié)果

表2 SSR引物序列

3 小結(jié)

草莓抗病育種已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)國(guó)際草莓育種人的育種目標(biāo)之一，抗病性篩選的方法最初為人工噴霧和灌根等方法，最近幾年利用抗病基因和抗病分子標(biāo)記篩選成為抗病性鑒定的主要手段。通過(guò)分子輔助育種能夠快速培育出持久抗性品種，該方法是加快草莓育種和提高育種水平的措施之一。國(guó)內(nèi)對(duì)草莓抗病相關(guān)分子標(biāo)記及抗病基因的研究主要集中在草莓白粉病［7，10］、灰霉?。?，8］及炭疽?。?1］等病害上，鮮有關(guān)于枯萎病抗病性鑒定的研究，所以本研究對(duì)于草莓抗枯萎病的研究具有重要的參考價(jià)值。

本研究通過(guò)人工抗病試驗(yàn)篩選，結(jié)合抗病基因檢測(cè)，初步確定了草莓優(yōu)系后代13-52-407和13-53-100具有較強(qiáng)的抗病性，驗(yàn)證了篩選出的這2個(gè)優(yōu)系遺傳了親本甜查理的抗病性，這與其他對(duì)于高抗 親本甜查理 的研究一致［6-8，10，11］，充分 證 明了甜查理可作為草莓抗病育種的首選高抗親本。分子標(biāo)記（微衛(wèi)星）分析結(jié)果只顯示優(yōu)系后代13-52-407遺傳了親本甜查理的抗性，而未顯示13-53-100的抗性標(biāo)記，這可能與分子標(biāo)記引物篩選范圍不廣泛有關(guān)，后續(xù)將繼續(xù)開展此項(xiàng)工作。對(duì)于其他甜查理作為親本的后代優(yōu)系沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的抗病性，分析原因可能是因?yàn)槊系聽栆?guī)律，性狀在后代發(fā)生了分離。

圖5 分子標(biāo)記引物FSS121擴(kuò)增甜查理（a）和子代13-52-407（b）的結(jié)果