獼猴桃皮中6種多酚類化合物的HPLC檢測法建立

劉曉燕,尚 霞,馬立志,周笑犁

(貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,貴州省果品加工技術(shù)研究中心,貴州貴陽 550005)

我國獼猴桃資源豐富、種類繁多,近年來其種植面積和產(chǎn)量都在不斷遞增[1]。獼猴桃皮是獼猴桃加工產(chǎn)業(yè)中的廢料,獼猴桃在加工過程約中有20%～30%的物質(zhì)以皮渣的形式被丟棄,而獼猴桃果皮中含有豐富的多酚類化合物,其含量遠(yuǎn)高于果肉[2]。

多酚是具有苯環(huán)并結(jié)合多個羥基化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)總稱,包括黃酮類、單寧類、酚酸類以及花色苷類等[3]。多酚作為一類具有生物活性的天然化合物越來越受到人們的重視,其主要具有清除自由基、預(yù)防心腦血管病、抗癌、美容、抗衰老等作用,對便秘、潰瘍有一定的防治作用[4-10]。植物多酚廣泛存在于植物體內(nèi),許多水果都含有一定量的多酚物質(zhì)。水果中多酚物質(zhì)的組成十分復(fù)雜,各種多酚物質(zhì)在不同種水果中的分布與含量存在著很大差異[11]。

目前酚類化合物含量的測定方法主要有Folin-Ciocalteau法、HPLC、氣相色譜法、LC-MS分析等,其中HPLC是測定多酚類化合物含量的常用方法[12-16]。張春梅等[17]建立了HPLC同時測定檳榔花中9種多酚類化合物的方法;鄧佩欣等[18]建立了同時測定石榴皮中4種多酚含量的HPLC法;鄧俊琳等[19]建立了同時檢測油橄欖鮮果中6種多酚化合物含量的HPLC法。目前利用HPLC檢測獼猴桃多酚的研究甚少,本研究也旨在建立一種HPLC同時分離多酚的方法,為今后獼猴桃皮多酚的研究提供一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

獼猴桃 陜西省周至縣,果實放軟清洗后剝皮備用;根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品 均為HPLC級,純度≥99%,合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品、4-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%) 均為分析標(biāo)準(zhǔn)品,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇為色譜醇 美國Tedia公司;乙醇、磷酸、鹽酸、磷酸二氫鉀等試劑 均為分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;AB-8大孔吸附樹脂 一級級別,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

LC-15C高效液相色譜儀、UV-2770型紫外可見分光光度計、AUW-120D 電子天平 日本島津公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器有限公司;HJ-200-SD噴霧干燥機 重慶榮凱機械;FDL-5200D超聲波清洗器 江蘇省昆侖山儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液制備 分別精確稱取各對照品:表兒茶素0.0030 g、綠原酸0.0044 g、根皮苷0.0051 g、原兒茶酸0.0055 g、咖啡酸0.0045 g、4-香豆酸0.0082g,加入60%甲醇,超聲溶解并定容得到濃度分別為0.30、0.44、0.51、0.22、0.45、0.82 mg/mL各標(biāo)準(zhǔn)儲備液,4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们斑m當(dāng)稀釋,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾進樣。

1.2.2 獼猴桃果皮多酚溶液制備

1.2.2.1 猴桃果皮多酚的提取 取獼猴桃果皮,55 ℃熱風(fēng)干燥12 h至恒重,使用高速多功能粉碎機粉碎過40目篩備用。采用乙醇提取法:溫度60 ℃、時間60 min、液料比1∶10 mL/g,乙醇濃度70%。重復(fù)提取2次,合并濾液后在60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏。再經(jīng)大孔吸附樹脂純化(上樣流速1.0 mL/min,洗脫劑為70%的乙醇,洗脫流速1.0 mL/min),收集洗脫液減壓濃縮,噴霧干燥(65 ℃)后即得獼猴桃果皮多酚粉末備用。

1.2.2.2 獼猴桃果皮多酚溶液配制 精確稱取制備好的獼猴桃果皮多酚粉末(0.100±0.005) g,加入60%甲醇,超聲溶解定容得濃度為10 mg/mL的猴桃果皮多酚溶液,4 ℃保存。進樣前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.2.3 色譜條件

1.2.3.1 檢測波長的選擇 用紫外分光光度計對各對照品進行掃描,結(jié)果顯示掃描波長范圍為200～400 nm,在此范圍內(nèi)選取4個波長:260、270、280 nm,在各個波長下進樣,根據(jù)基線穩(wěn)定性和目標(biāo)組分分離度確定最佳波長。

1.2.3.2 梯度洗脫程序的選擇 設(shè)置六種不同的梯度洗脫程序進樣,對6種多酚化合物進行分離,確定最適合的梯度洗脫程序。

1.2.3.3 柱溫的選擇 選取4個常用溫度:25、30、40、45 ℃,在各個溫度下分別進樣,根據(jù)目標(biāo)組分分離度確定最佳色譜柱溫度。

1.2.3.4 進樣量的確定 選取5、10、15 μL進樣,確定最佳進樣體積。

1.2.3.5 最佳色譜條件 色譜柱:InertSustain C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相:10 mmoL/L的KH2PO4水溶液(pH2.0)(A)-甲醇(B),流速1 mL/min,柱溫、進樣量、檢測波長、梯度洗脫程序為1.2.3的優(yōu)選條件。

1.2.4 方法學(xué)的考察

1.2.4.1 方法的回歸方程 將6種對照品儲備液按適宜的濃度梯度進行稀釋(至少五個梯度),在1.2.3.5色譜條件下對各對照品設(shè)置的至少五個梯度濃度分別進樣三次,記錄每次測定結(jié)果的峰面積,并求出三次峰面積的平均值作為縱坐標(biāo),再以對應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)繪出各標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系圖,建立線性回歸方程。

1.2.4.2 精密度實驗 將6種對照品按1.2.3.5色譜條件分別連續(xù)進樣6次,計算出各色譜峰峰面積的RSD值,考察精密度。

1.2.4.3 重復(fù)性實驗 平行稱取獼猴桃皮樣品5份,在1.2.2的方法下制備獼猴桃果皮多酚溶液,在1.2.3.5色譜條件分五次進樣分析,以5次進樣測出的結(jié)果計算各自色譜峰峰面積的RSD值,考察重復(fù)性。

1.2.4.4 穩(wěn)定性實驗 將獼猴桃果皮多酚溶液在提取后的0、2、4、6、8、10、12 h時分別按1.2.3.5色譜條件進樣分析,再計算出各色譜峰峰面積的RSD值,考察穩(wěn)定性。

1.2.4.5 加樣回收率實驗 平行稱取已知各多酚類化合物含量的獼猴桃皮粉末6份,一份空白,另5份分別加入6種對照品適量,在1.2.2方法下制備獼猴桃果皮多酚溶液,按1.2.3.5色譜條件進樣測定,以5次進樣測定的結(jié)果計算回收率平均值。

1.2.5 含量測定 按照1.2.2的方法制備獼猴桃果皮多酚溶液3份,按1.2.3.5色譜條件下進樣分析,根據(jù)峰面積計算出獼猴桃果皮多酚中的原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、4-香豆酸和根皮苷6種多酚類化合物的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗重復(fù)3次,數(shù)據(jù)計算均在Microsoft Excel 2013中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長 通過各波長下色譜圖的對比分析(圖1～圖3),結(jié)果表明當(dāng)檢測波長為280 nm時,基線較平穩(wěn)且各目標(biāo)峰之間分離更明顯,故選取280 nm為檢測波長。

圖1 樣品圖(波長260nm)Fig.1 Sample diagram(wavelength 260 nm)注:1、原兒茶酸 2、綠原酸 3、咖啡酸 4、表兒茶素 5、 4-香豆酸 6、根皮苷,圖2～圖19同。

圖2 樣品圖(波長270nm)Fig.2 Sample diagram(wavelength 270 nm)

圖3 樣品圖(波長280nm)Fig.3 Sample diagram(wavelength 280 nm)

2.1.2 梯度洗脫程序 通過對各個梯度洗脫程序下色譜圖的對比分析(圖4～圖9),結(jié)果顯示,最合適的梯度洗脫程序為程序六,在此梯度洗脫程序下獼猴桃果皮多酚中各目標(biāo)組分能在50 min內(nèi)得到良好的分離(見圖10)。

圖4 樣品圖(梯度洗脫程序一)Fig.4 Sample diagram(gradient elution program 1)

圖5 樣品圖(梯度洗脫條件二)Fig.5 Sample diagram(gradient elution program 2)

圖6 樣品圖(梯度洗脫程序三)Fig.6 Sample diagram(gradient elution program 3)

圖7 樣品圖(梯度洗脫程序四)Fig.7 Sample diagram(gradient elution program 4)

圖8 樣品圖(梯度洗脫程序五)Fig.8 Sample diagram(gradient elution program 5)

圖9 樣品圖(梯度洗脫程序六)Fig.9 Sample diagram(gradient elution program 6)

2.1.3 柱溫 通過對各柱溫下色譜圖的對比分析(圖10～圖13),結(jié)果顯示柱溫對表兒茶素、綠原酸、咖啡酸、4-香豆酸4種多酚化合物的分離影響較大,對根皮苷、原兒茶酸2種多酚化合物的分離影響相對較小,總的來說當(dāng)柱溫為40 ℃時,獼猴桃果皮多酚中6種目標(biāo)組分的分離效果最好。

圖10 樣品圖(柱溫25℃)Fig.10 Sample diagram(column temperature 25 ℃)

圖11 樣品圖(柱溫30℃)Fig.11 Sample diagram(column temperature 30 ℃)

圖12 樣品圖(柱溫40℃)Fig.12 Sample diagram(column temperature 40 ℃)

圖13 樣品圖(柱溫45℃)Fig.13 Sample diagram(column temperature 45 ℃)

2.1.4 進樣量確定 通過對三個不同進樣量條件下所得色譜圖的對比分析(圖14～圖16),結(jié)果表明在此次實驗中進樣量對獼猴桃果皮多酚中6種多酚類化合物的分離效果影響相對較小,經(jīng)對比分析,最終選取進樣量為10 μL。

圖14 樣品圖(進樣量5μL)Fig.14 Sample diagram(Sampling quantity 5 μL)

圖15 樣品圖(進樣量10μL)Fig.15 Sample diagram(Sampling quantity 10 μL)

圖16 樣品圖(進樣量10μL)Fig.16 Sample diagram(Sampling quantity 10 μL)

2.1.5 最佳色譜條件 色譜柱:InertSustain C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相:10 mmoL/L的KH2PO4水溶液(pH2.0)(A)-甲醇(B),柱溫40 ℃,流速1 mL/min,進樣量10 μL,檢測波長為280 nm,梯度洗脫程序順序為0 min,90% A,10% B;5 min,88% A,12% B;15 min,80% A,20% B;25 min,70% A,30% B;32 min,60% A,40% B;40～50 min,50% A,50% B。

在該色譜條件下進樣,得混合標(biāo)準(zhǔn)品和獼猴桃果皮多酚樣品的HPLC色譜圖分別如圖17-圖18。

圖17 混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.17 Mixed HPLC map standard sample

圖18 樣品HPLC圖Fig.18 Sample HPLC diagram

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 方法的回歸方程 各對照品建立的線性回歸方程,見表2。

表2 6種多酚化合物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear regression equation and correlation coefficient of 6 polyphenols

2.2.2 精密度 通過精密度實驗的考察,6種多酚類化合物的平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在1.62%～1.85%之間,表明此方法有較高的精密度。

表3 6種多酚類化合物的精密度Table 3 The precision of 6 kinds of polyphenols

表4 6種多酚類化合物的重復(fù)性Table 4 The reproducibility of 6 polyphenols

表5 6種多酚類化合物的穩(wěn)定性Table 5 Stability of 6 polyphenols

表6 6種多酚類化合物的回收率Table 6 Recovery rate of 6 polyphenols

2.2.3 重復(fù)性 通過重復(fù)性實驗的考察,6種多酚類化合物的平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在0.31%～1.40%之間,表明此方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性 通過穩(wěn)定性實驗的考察,除綠原酸的RSD值為2.86%,其余5種多酚類化合物的平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在0.90%～1.75%之間,表明此方法有較強的穩(wěn)定性。

2.2.5 加樣回收率 通過回收率實驗的考察,除綠原酸的平均回收率為84.90%、RSD值為2.88%外,其余5種多酚類化合物的平均回收率均在92.77%～108.78%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.61%～1.70%之間,表明此方法有較好的回收率。

2.3 獼猴桃果皮多酚含量測定

將在獼猴桃果皮多酚中測得各目標(biāo)組分的峰面積帶入各對照品的回歸方程中,計算得到獼猴桃皮樣品中原兒茶酸、表兒茶素、綠原酸、咖啡酸、4-香豆酸、根皮苷6種多酚類化合物的含量分別為22.18±0.20、6.39±0.16、5.44±0.10、3.99±0.10、4.42±0.06、3.61±0.05 μg/mg。

3 結(jié)論與討論

本實驗以乙醇為溶劑提取獼猴桃皮中的多酚,再經(jīng)大孔吸附樹脂純化后,用InertSustain C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,10 mmoL/L的KH2PO4水溶液(pH2.0)(A)-甲醇(B)作流動相,40 ℃柱溫,流速1 mL/min,進樣量10 μL,檢測波長280 nm,采用梯度洗脫的方式,能較好的將6種目標(biāo)組分在50 min內(nèi)完全分離。且經(jīng)方法學(xué)實驗考察,表明此方法重復(fù)性良好(RSD≤1.40%)、穩(wěn)定性較強(RSD≤2.86%)、精密度較高(RSD≤1.85%)、回收率在84.90%～108.78%之間。樣品測得6種目標(biāo)組分原兒茶酸、表兒茶素、綠原酸、咖啡酸、4-香豆酸、根皮苷6種多酚類化合物的含量分別為(22.18±0.20)、(6.39±0.16)、(5.44±0.10)、(3.99±0.10)、(4.42±0.06)、(3.61±0.05) μg/mg,其中原兒茶酸相對含量較高。與高振鵬[20]從獼猴桃皮渣中鑒定出的13種成分相比,本研究得到的6種獼猴桃皮渣中多酚單體有原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素四種單體是一致的。與杜麗娟等[21]測定的獼猴桃果酒中的13種成分相比,有原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、香豆酸五種單體是一致的。與左麗麗[8]從狗棗獼猴桃多酚中鑒定出的10種成分相比,有香豆酸、綠原酸二種單體是一致的。說明不同產(chǎn)地、不同品種、不同部位提取的多酚成分都有一定的差異。與石榴皮[18]、蘋果皮[22]中測定的多酚類化合物比較,獼猴桃皮多酚物質(zhì)種類豐富,含量高。

本文建立的HPLC法同時檢測獼猴桃皮中原兒茶酸、表兒茶素、綠原酸、咖啡酸、4-香豆酸、根皮苷6種多酚類化合物的含量,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,操作簡便、快速。

農(nóng)產(chǎn)品廢棄物綜合利用是目前研究的熱點,本研究也旨在為獼猴桃皮及多酚進一步開發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。本研究由于未串聯(lián)質(zhì)譜進行分析,故還有些成分未鑒定出來,在下一步的工作開展中將進一步研究。