養(yǎng)心通脈方對(duì)心肌梗死后大鼠缺血心肌血管新生及相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

楊清華，王慶高，潘朝鋅，張振千，張以昆，邢俊娥，李瑜欣

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

心肌梗死屬于中醫(yī)的“胸痹”“心痛”范疇，中醫(yī)多從氣虛血瘀病機(jī)論治，具有較好療效。本研究主要觀察養(yǎng)心通脈方對(duì)心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生的影響，通過(guò)檢測(cè)心肌梗死面積和左室面積比，大鼠邊緣區(qū)心肌微血管數(shù)（MVC）、微血管密度（MVD）、梗死邊緣區(qū)心肌組織的血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）及胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-1）的表達(dá)來(lái)探討其作用機(jī)制，以期為臨床治療提供依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 健康雌性SD大鼠（清潔級(jí)）120只，體重為230±20 g，購(gòu)自鄭州大學(xué)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：410116）。

1.2 藥物與試劑 養(yǎng)心通脈方（由人參10 g、黃芪15 g、麥冬10 g、五味子10 g、當(dāng)歸10 g、丹參15 g、川芎10 g、白芍10 g、木香6 g、甘草6 g組成），中藥由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一購(gòu)入，并煎制成膏劑，1 ml相當(dāng)于生藥1 g；麝香保心丸（由上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)A040214，每丸22.5 mg）。PDGF、IGF-1免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限責(zé)任公司提供，BAD顯色試劑盒由北京中山公司提供。

1.3 儀器 江西特力麻醉呼吸設(shè)備公司的小動(dòng)物呼吸機(jī)（TKR-200C）；日本YMPUS光學(xué)有限公司的顯微鏡（CH20BIMF200）；德國(guó)蔡司公司的石蠟切片機(jī)（HM340E）；成都泰盟科技有限公司的BT 2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)（3.6 BuiId 0211）。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備 參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》心肌梗死的動(dòng)物模型制作方法［1］，采用1%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射以麻醉大鼠，背位固定后行氣管插管術(shù)，并連接小動(dòng)物呼吸機(jī)行人工呼吸。開(kāi)胸后結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈根部，結(jié)扎點(diǎn)定在左冠狀動(dòng)脈主干位于主動(dòng)脈圓錐與左心耳之間的連線下0.1 cm處，即刻心臟表面顏色變化和記錄的體表心電圖Ⅰ、aVL導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高提示造模成功；縫合胸壁觀察大鼠狀態(tài)平穩(wěn)后停止呼吸機(jī)人工呼吸，術(shù)后預(yù)防感染注射青霉素3天。將存活動(dòng)物按隨機(jī)表隨機(jī)分為5組：模型組、麝香保心丸組、養(yǎng)心通脈方高劑量組、養(yǎng)心通脈方中劑量組及養(yǎng)心通脈方低劑量組；正常對(duì)照組手術(shù)方法同上，但只在冠脈下穿線打一松結(jié)；6周后立即處死，進(jìn)行各指標(biāo)的檢測(cè)。

2.2 動(dòng)物分組與給藥方法 將120只清潔級(jí)健康雌性SD大鼠，體重在200±20g，按隨機(jī)表隨機(jī)分為6組，每組20只：A正常對(duì)照組；B模型組；C麝香保心丸組；D養(yǎng)心通脈方低劑量組（藥量1 ml/d）；E養(yǎng)心通脈方中劑量組（藥量2 ml/d）；F養(yǎng)心通脈方高劑量組（藥量4 ml/d），用藥劑量分別按動(dòng)物體表面積換算。用藥組造模成功后次日開(kāi)始于每天上午8時(shí)灌胃給藥，正常對(duì)照組和模型組予等量生理鹽水灌胃，每日1次，分籠飼養(yǎng)，自由飲食，共觀察6周后立即處死。

2.3 大鼠心肌取材方法 麻醉大鼠后立即迅速摘取大鼠心臟，剪除主動(dòng)脈弓及右側(cè)心室、心房、心耳，在乳頭肌橫切面切取大鼠心肌組織（其中包括梗死區(qū)、移行區(qū)、健存區(qū)），用10%中性緩沖福爾馬林液固定標(biāo)本，石蠟包埋，制備成厚度4 μm的組織切片。

2.4 觀察指標(biāo)及方法

2.4.1 心肌梗死面積的測(cè)定 心臟標(biāo)本切片進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察心肌情況。用高清晰彩色病理圖像分析儀測(cè)量系統(tǒng)（Noesis S.A France）檢測(cè)大鼠急性心肌梗死面積與左室面積，梗死面積（%）=梗死心肌面積/左室面積×100%。

2.4.2 大鼠邊緣區(qū)心肌微血管數(shù)（MVC）、微血管密度（MVD）測(cè)定 用免疫組化SP法染色，染色后組織切片血管內(nèi)皮細(xì)胞被染成黃色、棕色。微血管判斷標(biāo)準(zhǔn)：以染成棕黃色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為一個(gè)血管進(jìn)行計(jì)數(shù)，如管腔大于8個(gè)紅細(xì)胞大小、帶有較厚肌層血管區(qū)域的血管均不能進(jìn)行計(jì)數(shù)，注意不以出現(xiàn)紅細(xì)胞、是否有管腔出現(xiàn)來(lái)計(jì)數(shù)血管。具體方法:首先在光鏡高倍視野（×40）下定位大鼠心肌梗死邊緣區(qū)，然后在高倍視野（×400）下進(jìn)行梗死邊緣區(qū)微血管計(jì)數(shù)，在每張切片中隨機(jī)抽取5個(gè)視野并計(jì)數(shù)每個(gè)視野的MVC，取均值作為MVC值；由于MVD是以毛細(xì)胞血管個(gè)數(shù)/視野表示，因此MVC值即MVD值。

2.4.3 大鼠MI邊緣區(qū)PDGF、IGF-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化SP法，PDGF-β、IGF-1蛋白的表達(dá)陽(yáng)性反應(yīng)是以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為標(biāo)準(zhǔn)。采取病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)算MI邊緣區(qū)心肌每視野（×100）中的平均灰度值（MOD），在每張切片中隨機(jī)測(cè)定6個(gè)視野，取平均值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用Ridit分析。P＜0.05為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心肌梗死面積比較 治療后養(yǎng)心通脈方各劑量組大鼠梗死面積（%）和模型組相比明顯減低，有顯著性差異（P＜0.05）；與麝香保心丸組相似（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 養(yǎng)心通脈方各劑量組對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響

表1 養(yǎng)心通脈方各劑量組對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響

注：與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與麝香保心丸組比較，③P＞0.05

images/BZ_80_490_1927_602_1965.pngimages/BZ_80_452_1998_640_2035.pngimages/BZ_80_490_2069_602_2106.pngimages/BZ_80_434_2140_659_2177.pngimages/BZ_80_377_2211_715_2248.pngimages/BZ_80_377_2281_715_2319.pngimages/BZ_80_377_2352_715_2390.pngimages/BZ_80_950_1927_969_1965.pngimages/BZ_80_941_1998_978_2035.pngimages/BZ_80_941_2069_978_2106.pngimages/BZ_80_941_2140_978_2177.pngimages/BZ_80_941_2211_978_2248.pngimages/BZ_80_941_2281_978_2319.pngimages/BZ_80_941_2352_978_2390.pngimages/BZ_80_1200_1927_1350_1965.pngimages/BZ_80_1182_1998_1369_2035.pngimages/BZ_80_1182_2069_1369_2106.pngimages/BZ_80_1182_2140_1369_2177.pngimages/BZ_80_1182_2211_1369_2248.pngimages/BZ_80_1182_2281_1369_2319.pngimages/BZ_80_1182_2352_1369_2390.pngimages/BZ_80_1576_1927_1801_1965.pngimages/BZ_80_1574_1998_1741_2035.pngimages/BZ_80_1574_2069_1762_2106.pngimages/BZ_80_1574_2140_1783_2177.pngimages/BZ_80_1574_2211_1804_2248.pngimages/BZ_80_1574_2281_1804_2319.pngimages/BZ_80_1574_2352_1804_2390.pngimages/BZ_80_2001_1927_2203_1965.pngimages/BZ_80_1997_1998_2164_2035.pngimages/BZ_80_1978_2069_2185_2106.pngimages/BZ_80_1997_2140_2206_2177.pngimages/BZ_80_1997_2211_2226_2248.pngimages/BZ_80_1997_2281_2226_2319.pngimages/BZ_80_1997_2352_2226_2390.png

3.2 各組大鼠梗死邊緣區(qū)MVC、MVD比較 各組均可見(jiàn)到新生微血管，與正常對(duì)照組比較，模型組與各治療組大鼠MI邊緣區(qū)MVC和MVD明顯增高（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組均比模型組明顯增高（P＜0.05）；與麝香保心丸組比較，養(yǎng)心通脈方高、中劑量組比麝香保心丸組顯著增高（P＜0.05），養(yǎng)心通脈方低劑量組與麝香保心丸組相似（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠梗死邊緣區(qū)MVC、MVD比較

表2 各組大鼠梗死邊緣區(qū)MVC、MVD比較

注：與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與麝香保心丸組比較，③P＜0.05

images/BZ_80_1490_2652_1602_2689.pngimages/BZ_80_1452_2706_1640_2744.pngimages/BZ_80_1490_2760_1602_2798.pngimages/BZ_80_1433_2815_1658_2852.pngimages/BZ_80_1377_2869_1715_2907.pngimages/BZ_80_1377_2923_1715_2961.pngimages/BZ_80_1377_2978_1715_3015.pngimages/BZ_80_1851_2652_1870_2689.pngimages/BZ_80_1842_2706_1879_2744.pngimages/BZ_80_1842_2760_1879_2798.pngimages/BZ_80_1842_2815_1879_2852.pngimages/BZ_80_1842_2869_1879_2907.pngimages/BZ_80_1842_2923_1879_2961.pngimages/BZ_80_1842_2978_1879_3015.pngimages/BZ_80_2034_2652_2209_2689.pngimages/BZ_80_2002_2706_2188_2744.pngimages/BZ_80_2002_2760_2228_2798.pngimages/BZ_80_2002_2815_2230_2852.pngimages/BZ_80_2002_2869_2235_2907.pngimages/BZ_80_2002_2923_2250_2961.pngimages/BZ_80_1993_2978_2250_3015.png

3.3 各組大鼠MI邊緣區(qū)PDGF-β、IGF-1比較 模型組與各治療組大鼠MI邊緣區(qū)PDGF-β、IGF-1明顯增高，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。與模型組比較，養(yǎng)心通脈方各劑量組與麝香保心丸組PDGF-β、IGF-1明顯增高（P＜0.05）；養(yǎng)心通脈方高、中劑量組比麝香保心丸組增高更顯著（P＜0.05）；養(yǎng)心通脈方低劑量組與麝香保心丸組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠MI邊緣區(qū)PDGF、IGF-1比較

表3 各組大鼠MI邊緣區(qū)PDGF、IGF-1比較

注：與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與麝香保心丸組比較，③P＜0.05

images/BZ_81_482_612_594_649.pngimages/BZ_81_967_612_985_649.png images/BZ_81_1313_612_1448_649.pngimages/BZ_81_1927_612_2025_649.pngimages/BZ_81_444_683_632_720.pngimages/BZ_81_957_683_995_720.pngimages/BZ_81_1105_683_1451_720.pngimages/BZ_81_1701_683_2056_720.pngimages/BZ_81_482_753_594_791.pngimages/BZ_81_426_824_651_862.pngimages/BZ_81_369_895_707_933.pngimages/BZ_81_369_966_707_1004.pngimages/BZ_81_957_753_995_791.pngimages/BZ_81_957_824_995_862.pngimages/BZ_81_957_895_995_933.pngimages/BZ_81_957_966_995_1004.pngimages/BZ_81_1105_753_1472_791.pngimages/BZ_81_1105_824_1493_862.pngimages/BZ_81_1105_895_1493_933.pngimages/BZ_81_1247_966_1514_1004.pngimages/BZ_81_1872_753_2079_791.pngimages/BZ_81_1853_824_2099_862.pngimages/BZ_81_1853_895_2099_933.pngimages/BZ_81_1842_966_2109_1004.pngimages/BZ_81_369_1037_707_1074.pngimages/BZ_81_957_1037_995_1074.pngimages/BZ_81_1247_1037_1514_1074.pngimages/BZ_81_1842_1037_2109_1074.png

4 討論

冠心病屬于中醫(yī)的“胸痹”“心痛”范疇，屬“臟氣虛于內(nèi)，痰瘀痹于中”的本虛標(biāo)實(shí)證，氣虛血瘀始終貫穿疾病的不同病理階段。中醫(yī)藥治療心血管相關(guān)病證有悠久歷史，有不少關(guān)于“氣血互根”“脈為血之府”“補(bǔ)氣活血”“行氣通脈”“活血化瘀”“活血生肌”的理論，這就為中醫(yī)藥促血管生成作用奠定了理論基礎(chǔ)。養(yǎng)心通脈方是全國(guó)名老中醫(yī)李錫光主任治療冠心病心絞痛的經(jīng)驗(yàn)方，主要由人參、黃芪、麥冬、五味子、當(dāng)歸、丹參、川芎、白芍、木香、甘草等組成，方中人參大補(bǔ)元?dú)?，為君藥；黃芪助人參以加強(qiáng)補(bǔ)氣的作用，為臣藥；參芪合用，則心氣、元?dú)饨酝?；而麥冬、五味子合人參即生脈飲之意，所謂生脈者，正氣旺，血脈充，血脈充則瘀血自散，當(dāng)歸、丹參、川芎活血化瘀，通脈止痛，白芍合甘草，有酸甘化陰、緩急止痛之功效，木香既可芳香溫通，又可行氣止痛，增強(qiáng)活血化瘀之功，共為佐藥，甘草調(diào)和諸藥為使藥，全方共奏大補(bǔ)元?dú)狻⒁鏆怵B(yǎng)陰、活血化瘀的功效，正切合病機(jī)?，F(xiàn)代藥理研究表明，方中君藥人參的有效成分人參皂苷有促進(jìn)血管生成的作用，其他單味中藥丹參、當(dāng)歸、黃芪、川芎等均對(duì)冠心病有不同程度的促血管生成作用［2-5］。

促血管生成作用機(jī)制是由血管生成生長(zhǎng)因子及一系列細(xì)胞生長(zhǎng)因子通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，誘導(dǎo)和／或促進(jìn)血管新生，從而促進(jìn)其相關(guān)組織的修復(fù)和生長(zhǎng)。本研究通過(guò)對(duì)養(yǎng)心通脈方促心肌梗死后大鼠缺血心肌血管新生及對(duì)相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響，探討?zhàn)B心通脈方促血管新生作用機(jī)制，結(jié)果表明養(yǎng)心通脈方各劑量組大鼠心肌梗死范圍明顯減小，心肌梗死邊緣區(qū)MVC、MVD明顯升高，PDGF-β、IGF-1蛋白表達(dá)明顯增高，提示養(yǎng)心通脈方能縮小大鼠心肌梗死面積，并能促進(jìn)梗死后大鼠缺血心肌的血管新生，對(duì)心肌梗死大鼠缺血心肌具有保護(hù)作用，而上調(diào)心肌梗死邊緣區(qū)PDGF-β、IGF-1表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。