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    養(yǎng)心通脈方對(duì)心肌梗死后大鼠缺血心肌血管新生及相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

    2019-07-09 07:54:46楊清華王慶高潘朝鋅張振千張以昆邢俊娥李瑜欣
    廣西中醫(yī)藥 2019年3期
    關(guān)鍵詞:保心丸通脈麝香

    楊清華,王慶高,潘朝鋅,張振千,張以昆,邢俊娥,李瑜欣

    (廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023)

    心肌梗死屬于中醫(yī)的“胸痹”“心痛”范疇,中醫(yī)多從氣虛血瘀病機(jī)論治,具有較好療效。本研究主要觀察養(yǎng)心通脈方對(duì)心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生的影響,通過(guò)檢測(cè)心肌梗死面積和左室面積比,大鼠邊緣區(qū)心肌微血管數(shù)(MVC)、微血管密度(MVD)、梗死邊緣區(qū)心肌組織的血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)及胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)的表達(dá)來(lái)探討其作用機(jī)制,以期為臨床治療提供依據(jù),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 動(dòng)物 健康雌性SD大鼠(清潔級(jí))120只,體重為230±20 g,購(gòu)自鄭州大學(xué)動(dòng)物中心(合格證號(hào):410116)。

    1.2 藥物與試劑 養(yǎng)心通脈方(由人參10 g、黃芪15 g、麥冬10 g、五味子10 g、當(dāng)歸10 g、丹參15 g、川芎10 g、白芍10 g、木香6 g、甘草6 g組成),中藥由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一購(gòu)入,并煎制成膏劑,1 ml相當(dāng)于生藥1 g;麝香保心丸(由上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào)A040214,每丸22.5 mg)。PDGF、IGF-1免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限責(zé)任公司提供,BAD顯色試劑盒由北京中山公司提供。

    1.3 儀器 江西特力麻醉呼吸設(shè)備公司的小動(dòng)物呼吸機(jī)(TKR-200C);日本YMPUS光學(xué)有限公司的顯微鏡(CH20BIMF200);德國(guó)蔡司公司的石蠟切片機(jī)(HM340E);成都泰盟科技有限公司的BT 2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)(3.6 BuiId 0211)。

    2 方法

    2.1 動(dòng)物模型制備 參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》心肌梗死的動(dòng)物模型制作方法[1],采用1%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射以麻醉大鼠,背位固定后行氣管插管術(shù),并連接小動(dòng)物呼吸機(jī)行人工呼吸。開(kāi)胸后結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈根部,結(jié)扎點(diǎn)定在左冠狀動(dòng)脈主干位于主動(dòng)脈圓錐與左心耳之間的連線下0.1 cm處,即刻心臟表面顏色變化和記錄的體表心電圖Ⅰ、aVL導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高提示造模成功;縫合胸壁觀察大鼠狀態(tài)平穩(wěn)后停止呼吸機(jī)人工呼吸,術(shù)后預(yù)防感染注射青霉素3天。將存活動(dòng)物按隨機(jī)表隨機(jī)分為5組:模型組、麝香保心丸組、養(yǎng)心通脈方高劑量組、養(yǎng)心通脈方中劑量組及養(yǎng)心通脈方低劑量組;正常對(duì)照組手術(shù)方法同上,但只在冠脈下穿線打一松結(jié);6周后立即處死,進(jìn)行各指標(biāo)的檢測(cè)。

    2.2 動(dòng)物分組與給藥方法 將120只清潔級(jí)健康雌性SD大鼠,體重在200±20g,按隨機(jī)表隨機(jī)分為6組,每組20只:A正常對(duì)照組;B模型組;C麝香保心丸組;D養(yǎng)心通脈方低劑量組(藥量1 ml/d);E養(yǎng)心通脈方中劑量組(藥量2 ml/d);F養(yǎng)心通脈方高劑量組(藥量4 ml/d),用藥劑量分別按動(dòng)物體表面積換算。用藥組造模成功后次日開(kāi)始于每天上午8時(shí)灌胃給藥,正常對(duì)照組和模型組予等量生理鹽水灌胃,每日1次,分籠飼養(yǎng),自由飲食,共觀察6周后立即處死。

    2.3 大鼠心肌取材方法 麻醉大鼠后立即迅速摘取大鼠心臟,剪除主動(dòng)脈弓及右側(cè)心室、心房、心耳,在乳頭肌橫切面切取大鼠心肌組織(其中包括梗死區(qū)、移行區(qū)、健存區(qū)),用10%中性緩沖福爾馬林液固定標(biāo)本,石蠟包埋,制備成厚度4 μm的組織切片。

    2.4 觀察指標(biāo)及方法

    2.4.1 心肌梗死面積的測(cè)定 心臟標(biāo)本切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色,在光鏡下觀察心肌情況。用高清晰彩色病理圖像分析儀測(cè)量系統(tǒng)(Noesis S.A France)檢測(cè)大鼠急性心肌梗死面積與左室面積,梗死面積(%)=梗死心肌面積/左室面積×100%。

    2.4.2 大鼠邊緣區(qū)心肌微血管數(shù)(MVC)、微血管密度(MVD)測(cè)定 用免疫組化SP法染色,染色后組織切片血管內(nèi)皮細(xì)胞被染成黃色、棕色。微血管判斷標(biāo)準(zhǔn):以染成棕黃色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為一個(gè)血管進(jìn)行計(jì)數(shù),如管腔大于8個(gè)紅細(xì)胞大小、帶有較厚肌層血管區(qū)域的血管均不能進(jìn)行計(jì)數(shù),注意不以出現(xiàn)紅細(xì)胞、是否有管腔出現(xiàn)來(lái)計(jì)數(shù)血管。具體方法:首先在光鏡高倍視野(×40)下定位大鼠心肌梗死邊緣區(qū),然后在高倍視野(×400)下進(jìn)行梗死邊緣區(qū)微血管計(jì)數(shù),在每張切片中隨機(jī)抽取5個(gè)視野并計(jì)數(shù)每個(gè)視野的MVC,取均值作為MVC值;由于MVD是以毛細(xì)胞血管個(gè)數(shù)/視野表示,因此MVC值即MVD值。

    2.4.3 大鼠MI邊緣區(qū)PDGF、IGF-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化SP法,PDGF-β、IGF-1蛋白的表達(dá)陽(yáng)性反應(yīng)是以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為標(biāo)準(zhǔn)。采取病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)算MI邊緣區(qū)心肌每視野(×100)中的平均灰度值(MOD),在每張切片中隨機(jī)測(cè)定6個(gè)視野,取平均值。

    2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),等級(jí)資料采用Ridit分析。P<0.05為有顯著性差異。

    3 結(jié)果

    3.1 各組大鼠心肌梗死面積比較 治療后養(yǎng)心通脈方各劑量組大鼠梗死面積(%)和模型組相比明顯減低,有顯著性差異(P<0.05);與麝香保心丸組相似(P>0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 養(yǎng)心通脈方各劑量組對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響

    表1 養(yǎng)心通脈方各劑量組對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響

    注:與正常對(duì)照組比較,①P<0.05;與模型組比較,②P<0.05;與麝香保心丸組比較,③P>0.05

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    3.2 各組大鼠梗死邊緣區(qū)MVC、MVD比較 各組均可見(jiàn)到新生微血管,與正常對(duì)照組比較,模型組與各治療組大鼠MI邊緣區(qū)MVC和MVD明顯增高(P<0.05);與模型組比較,各治療組均比模型組明顯增高(P<0.05);與麝香保心丸組比較,養(yǎng)心通脈方高、中劑量組比麝香保心丸組顯著增高(P<0.05),養(yǎng)心通脈方低劑量組與麝香保心丸組相似(P>0.05)。見(jiàn)表2。

    表2 各組大鼠梗死邊緣區(qū)MVC、MVD比較

    表2 各組大鼠梗死邊緣區(qū)MVC、MVD比較

    注:與正常對(duì)照組比較,①P<0.05;與模型組比較,②P<0.05;與麝香保心丸組比較,③P<0.05

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    3.3 各組大鼠MI邊緣區(qū)PDGF-β、IGF-1比較 模型組與各治療組大鼠MI邊緣區(qū)PDGF-β、IGF-1明顯增高,與正常對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)。與模型組比較,養(yǎng)心通脈方各劑量組與麝香保心丸組PDGF-β、IGF-1明顯增高(P<0.05);養(yǎng)心通脈方高、中劑量組比麝香保心丸組增高更顯著(P<0.05);養(yǎng)心通脈方低劑量組與麝香保心丸組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

    表3 各組大鼠MI邊緣區(qū)PDGF、IGF-1比較

    表3 各組大鼠MI邊緣區(qū)PDGF、IGF-1比較

    注:與正常對(duì)照組比較,①P<0.05;與模型組比較,②P<0.05;與麝香保心丸組比較,③P<0.05

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    4 討論

    冠心病屬于中醫(yī)的“胸痹”“心痛”范疇,屬“臟氣虛于內(nèi),痰瘀痹于中”的本虛標(biāo)實(shí)證,氣虛血瘀始終貫穿疾病的不同病理階段。中醫(yī)藥治療心血管相關(guān)病證有悠久歷史,有不少關(guān)于“氣血互根”“脈為血之府”“補(bǔ)氣活血”“行氣通脈”“活血化瘀”“活血生肌”的理論,這就為中醫(yī)藥促血管生成作用奠定了理論基礎(chǔ)。養(yǎng)心通脈方是全國(guó)名老中醫(yī)李錫光主任治療冠心病心絞痛的經(jīng)驗(yàn)方,主要由人參、黃芪、麥冬、五味子、當(dāng)歸、丹參、川芎、白芍、木香、甘草等組成,方中人參大補(bǔ)元?dú)?,為君藥;黃芪助人參以加強(qiáng)補(bǔ)氣的作用,為臣藥;參芪合用,則心氣、元?dú)饨酝?;而麥冬、五味子合人參即生脈飲之意,所謂生脈者,正氣旺,血脈充,血脈充則瘀血自散,當(dāng)歸、丹參、川芎活血化瘀,通脈止痛,白芍合甘草,有酸甘化陰、緩急止痛之功效,木香既可芳香溫通,又可行氣止痛,增強(qiáng)活血化瘀之功,共為佐藥,甘草調(diào)和諸藥為使藥,全方共奏大補(bǔ)元?dú)狻⒁鏆怵B(yǎng)陰、活血化瘀的功效,正切合病機(jī)?,F(xiàn)代藥理研究表明,方中君藥人參的有效成分人參皂苷有促進(jìn)血管生成的作用,其他單味中藥丹參、當(dāng)歸、黃芪、川芎等均對(duì)冠心病有不同程度的促血管生成作用[2-5]。

    促血管生成作用機(jī)制是由血管生成生長(zhǎng)因子及一系列細(xì)胞生長(zhǎng)因子通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移,誘導(dǎo)和/或促進(jìn)血管新生,從而促進(jìn)其相關(guān)組織的修復(fù)和生長(zhǎng)。本研究通過(guò)對(duì)養(yǎng)心通脈方促心肌梗死后大鼠缺血心肌血管新生及對(duì)相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響,探討?zhàn)B心通脈方促血管新生作用機(jī)制,結(jié)果表明養(yǎng)心通脈方各劑量組大鼠心肌梗死范圍明顯減小,心肌梗死邊緣區(qū)MVC、MVD明顯升高,PDGF-β、IGF-1蛋白表達(dá)明顯增高,提示養(yǎng)心通脈方能縮小大鼠心肌梗死面積,并能促進(jìn)梗死后大鼠缺血心肌的血管新生,對(duì)心肌梗死大鼠缺血心肌具有保護(hù)作用,而上調(diào)心肌梗死邊緣區(qū)PDGF-β、IGF-1表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。

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