微小RNA-497在麝香保心丸治療AMI后心室重構(gòu)中的作用研究

鐘春榮，符傳藝，張捷君，符武島

(海南省人民醫(yī)院 1.醫(yī)療保健中心四區(qū)，2.神經(jīng)介入科，3.醫(yī)療保健中心三區(qū)，海南 ?？?570311)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠狀動(dòng)脈急性缺血缺氧引起的心肌壞死，臨床表現(xiàn)為劇烈而持久的胸骨后疼痛、血清肌鈣蛋白Ⅰ(troponin I，TnI)、肌紅蛋白(myoglobin，MB)、肌酸激酶同功酶(creatine kinase isoenzyme，CKMB)等心肌酶活性增高，以及心電圖進(jìn)行性改變，可累及消化、呼吸、心血管系統(tǒng)，并發(fā)心律失常、心臟破裂、心力衰竭、血管栓塞、心源性休克等，危及生命[1]。AMI后心室重構(gòu)是引起心力衰竭的主要原因，目前臨床尚無(wú)治愈心力衰竭的方法，因此探索AMI后心室重構(gòu)的新治療方法成為當(dāng)務(wù)之急[2]。麝香保心丸是一種具有改善血流動(dòng)力學(xué)、緩解心絞痛、改善心肌缺血作用的中成藥，已成功應(yīng)用于心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的治療[3]。微小RNA-497(Microrna-497，miRNA-497)是一種單鏈非編碼小RNA分子，可參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控[4]。有研究顯示[5]miRNA-497對(duì)AMI后心室重構(gòu)具有調(diào)控作用。麝香保心丸對(duì)AMI后心室重構(gòu)具有改善作用已有文獻(xiàn)報(bào)道[6]，但麝香保心丸改善AMI后心室重構(gòu)的分子學(xué)基礎(chǔ)是否為miRNA-497尚不清楚。本研究就miRNA-497在麝香保心丸改善AMI后心室重構(gòu)中的作用進(jìn)行了探討，以期明確miRNA-497與麝香保心丸改善AMI后心室重構(gòu)的關(guān)系，鑒定麝香保心丸改善AMI后心室重構(gòu)的分子基礎(chǔ)，為AMI后心室重構(gòu)的治療提供新的可能方案，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SD大鼠90只，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量(320±20)g,購(gòu)于上海抗體藥物國(guó)家工程研究中心有限公司，生產(chǎn)許可：SYXK(滬)2018-0041。將90只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、miRNA-497激動(dòng)劑+麝香保心丸組、麝香保心丸組、miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組、miRNA-497抑制劑組，每組15只(注：miRNA-497激動(dòng)劑是模擬生物體內(nèi)源的miRNA-497，運(yùn)用化學(xué)合成的方法合成，能夠增強(qiáng)內(nèi)源性miRNA-497的功能，而miRNA-497抑制劑是化學(xué)修飾的專門針對(duì)細(xì)胞中特異的靶miRNA-497的抑制劑)。

1.2 造模及干預(yù)方法

采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支法制備急性心肌梗死大鼠模型，方法如下：腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉溶液(天津蘭洪新能源科技有限公司)麻醉大鼠，剪去胸部被毛并消毒，于胸骨左緣第2肋～4肋開胸，結(jié)扎冠脈左前降支，當(dāng)結(jié)扎區(qū)域變白，心電圖ST段弓背上抬為造模成功。假手術(shù)組僅分離前室間支，不結(jié)扎。模型組、miRNA-497激動(dòng)劑+麝香保心丸組、麝香保心丸組、miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組造模成功后，模型組給予等量生理鹽水(上海艾研生物科技有限公司)，miRNA-497激動(dòng)劑+麝香保心丸組尾靜脈注射miRNA-497激動(dòng)劑[4](15 mg/kg，每天1次，連續(xù)3天，廣州銳博生物有限公司)和灌胃麝香保心丸(15 mg/kg，每天1次，連續(xù)6周，上海和黃藥業(yè)有限公司)，麝香保心丸組給予麝香保心丸(15 mg/kg，每天1次，連續(xù)6周，上海和黃藥業(yè)有限公司)灌胃，miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組尾靜脈注射miRNA-497抑制劑[4](15 mg/kg，1次/天，連續(xù)3天，廣州銳博生物有限公司)和灌胃麝香保心丸(15 mg/kg，1次/天，連續(xù)6周，上海和黃藥業(yè)有限公司)，miRNA-497抑制劑組尾靜脈注射miRNA-497抑制劑(15 mg/kg，每天1次，連續(xù)3天，廣州銳博生物有限公司)。

1.3 觀察項(xiàng)目

①各組大鼠一般情況：6周后觀察大鼠精神狀態(tài)、反應(yīng)、進(jìn)食、飲水、運(yùn)動(dòng)、死亡等一般情況并記錄。②各組大鼠心功能指標(biāo)：麻醉各組大鼠，行右側(cè)頸總動(dòng)脈插管(將連接壓力換能器的插管經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈逆行插入左心室)，通過(guò)PowerLab生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)(香港友誠(chéng)生物科技有限公司)，測(cè)定并記錄左室收縮末壓(left ventricular end systolic pressure，LVESP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(LV+dp/dtmax)、左室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左室內(nèi)壓最大下降速率(LV-dp/dtmax)。③各組大鼠急性心肌梗死面積：將各組大鼠處死，摘取心臟，左心室部分稱重后切成1～1.5 mm心肌薄片，將心肌薄片置于1% 2,3,5氯化三苯基四氮唑溶液(北京索萊寶科技有限公司)中，37 ℃避光孵育10 min，用濾紙吸干，稱重，梗死區(qū)域呈白色，非梗死區(qū)域呈紅色，切下梗死區(qū)稱重，急性心肌梗死面積=(急性心肌梗死重量/左心室重量)×100%[7]。④各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化：取各組大鼠心肌組織，固定，脫水，透明，包埋，切片，脫蠟，脫水，伊紅-蘇木素(eosin-hematoxylin，HE)染色試劑盒(上海威奧生物科技有限公司)染色，脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡(重慶奧特光學(xué)顯微鏡有限公司，型號(hào)：MDS400)下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。⑤各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率：取各組大鼠心肌組織，剪碎，勻漿，裂解，消化、傳代，取第3代心肌細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液的細(xì)胞計(jì)數(shù)為1×106個(gè)，取1支潔凈流式管，依次加入100 μL細(xì)胞懸液、5 μL異硫氰酸熒光素(天津希恩思生化科技有限公司)、5 μL碘化丙啶(武漢艾美捷科技有限公司)，充分混勻，25 ℃避光反應(yīng)15 min，采用流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司，型號(hào)：FACSCalibur)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。⑥各組大鼠心肌組織中miRNA-497表達(dá)量：取各組大鼠心肌組織，液氮研磨，提取總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增曲線讀取循環(huán)數(shù)(Ct)，將GAPDH作為內(nèi)參基因，采用相對(duì)定量法以2-△△Ct對(duì)miRNA-497表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析(圖1)。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖1：MarkerDL2000；2、3、4：內(nèi)參基因擴(kuò)增條帶；5、6、7：目的基因擴(kuò)增條帶

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，兩兩計(jì)量資料比較采用snk-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況

假手術(shù)組大鼠精神狀態(tài)、飲食活動(dòng)、毛發(fā)生長(zhǎng)等均良好，未出現(xiàn)死亡大鼠；模型組大鼠呈現(xiàn)病態(tài)特征，精神萎靡，被毛粗糙不整齊，不思飲食，捕捉無(wú)抵抗現(xiàn)象，4只大鼠死亡；麝香保心丸組大鼠精神狀態(tài)、飲食活動(dòng)、毛發(fā)生長(zhǎng)等較模型組明顯好轉(zhuǎn)，2只大鼠死亡；miRNA-497激動(dòng)劑+麝香保心丸組大鼠精神狀態(tài)、飲食活動(dòng)、毛發(fā)生長(zhǎng)等較麝香保心丸組明顯異常，3只大鼠死亡；miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組大鼠精神狀態(tài)、飲食活動(dòng)、毛發(fā)生長(zhǎng)等較麝香保心丸組明顯好轉(zhuǎn)，1只大鼠死亡；miRNA-497抑制劑組大鼠精神狀態(tài)、飲食活動(dòng)、毛發(fā)生長(zhǎng)等較miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組無(wú)明顯差別，1只大鼠死亡。

2.2 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化

假手術(shù)組大鼠心肌組織排列整齊，橫紋清晰，無(wú)變性壞死，未見纖維化，間質(zhì)無(wú)充血腫脹，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠心肌組織排列紊亂，橫紋不清，心肌細(xì)胞肥大，有大量點(diǎn)狀壞死灶，成纖維細(xì)胞大量增生，大量膠原纖維取代心肌細(xì)胞，纖維化明顯，間質(zhì)明顯充血腫脹，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；麝香保心丸組心肌組織病理改變較模型組明顯改善；miRNA-497激動(dòng)劑+麝香保心丸組心肌組織病理改變較麝香保心丸組明顯加重；miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組心肌組織病理改變較麝香保心丸組明顯改善；miRNA-497抑制劑組心肌組織病理改變較miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組無(wú)明顯差別(圖2)。

圖2 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，200×)A：假手術(shù)組；B：模型組；C：miRNA-497激動(dòng)劑+麝香保心丸組；D：麝香保心丸組；E：miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組；F：miRNA-497抑制劑組

2.3 各組大鼠急性心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡率

模型組大鼠急性心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；麝香保心丸組大鼠急性心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組(P<0.05)；miRNA-497激動(dòng)劑+麝香保心丸組大鼠急性心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于麝香保心丸組(P<0.05)；miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組大鼠急性心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于麝香保心丸組(P<0.05)；miRNA-497抑制劑組大鼠急性心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡率較miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組無(wú)顯著差異(圖3，表1)。

表1 各組大鼠急性心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡率 (%)

圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況A：假手術(shù)組；B：模型組；C：miRNA-497激動(dòng)劑+麝香保心丸組；D：麝香保心丸組；E：miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組；F：miRNA-497抑制劑組注：橫坐標(biāo)表示Annexin V/FITC染色，縱坐標(biāo)表示PI染色，Q1象限表示機(jī)械性死亡細(xì)胞，Q2象限表示凋亡晚期的細(xì)胞，Q4象限表示正?；罴?xì)胞，Q3象限表示凋亡早期的細(xì)胞

2.4 各組大鼠心功能指標(biāo)

模型組大鼠LVEDP顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)；麝香保心丸組大鼠LVEDP顯著低于模型組(P<0.05)，LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax顯著高于模型組(P<0.05)；miRNA-497激動(dòng)劑+麝香保心丸組大鼠LVEDP顯著高于麝香保心丸組(P<0.05)，LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax顯著低于麝香保心丸組(P<0.05)；miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組大鼠LVEDP顯著低于麝香保心丸組(P<0.05)，LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax顯著高于麝香保心丸組(P<0.05)；miRNA-497抑制劑組大鼠LVEDP、LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax較miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組無(wú)顯著差異(P>0.05，表2)。

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)

2.5 各組大鼠心肌組織中miRNA-497表達(dá)量

模型組大鼠心肌組織中miRNA-497表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；麝香保心丸組大鼠心肌組織中miRNA-497表達(dá)量顯著低于模型組(P<0.05)；miRNA-497激動(dòng)劑+麝香保心丸組大鼠心肌組織中miRNA-497表達(dá)量顯著高于麝香保心丸組(P<0.05)；miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組大鼠心肌組織中miRNA-497表達(dá)量顯著低于麝香保心丸組(P<0.05)；miRNA-497抑制劑組大鼠心肌組織中miRNA-497表達(dá)量較miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組無(wú)顯著差異(P>0.05，表3)。

表3 各組大鼠心肌組織中miRNA-497表達(dá)量

3 討 論

心肌梗死屬于中醫(yī)“胸痹”、“厥心痛”“心痛”、“卒心痛”等范疇，心室重構(gòu)在中醫(yī)中無(wú)相同病名，但就其心悸、頭暈、喘憋、咳嗽、胸悶、胸痛、咯痰、乏力、惡心、腹脹、水腫等心衰癥狀來(lái)說(shuō)，當(dāng)屬中醫(yī)“心悸”、“喘證”、“胸痹”、“水腫”等范疇[8-9]。中醫(yī)藥治療為一種多靶點(diǎn)、多途徑的治療方式，臨床逐漸應(yīng)用于AMI治療。麝香保心丸是一種中成藥，由人工麝香、人工牛黃、蟾酥、冰片、蘇合香脂、肉桂、人生提取物組成，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善血流動(dòng)力學(xué)、緩解心絞痛、降低血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ)、穩(wěn)定易損斑塊、調(diào)節(jié)心肌間質(zhì)膠原表達(dá)、減少梗死心肌面積、抑制血管壁炎性、預(yù)防心室重構(gòu)、改善心肌缺血作用，現(xiàn)已成功應(yīng)用于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CAHD)、AMI等CVD的治療，被列為全國(guó)中醫(yī)醫(yī)院急診科室首批必備中成藥[10-11]。本研究顯示模型組大鼠一般情況、心肌組織形態(tài)變化較假手術(shù)組明顯異常，提示造模成功。本研究顯示麝香保心丸組大鼠一般情況、心肌組織病理學(xué)改變、LVEDP、LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax、急性心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡率較模型組顯著改善，這與楊波等[6]研究結(jié)果一致，提示麝香保心丸能夠改善急性心肌梗死后心室重構(gòu)，可能是由于心肌梗死后心室重構(gòu)多見氣虛血瘀，多屬本虛標(biāo)實(shí)，這與麝香保心丸的溫通胸陽(yáng)、活血化瘀、益氣養(yǎng)心方證相合。

miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的單鏈非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約為20～25個(gè)核苷酸，能夠通過(guò)靶向結(jié)合特定mRNA的3′端非編碼區(qū)(3′UTR)，促使mRNA降解，抑制mRNA進(jìn)一步翻譯蛋白，從而對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控。miRNA-497為miRNA中的一種，已有研究證實(shí)miRNA-497在疾病組織中表達(dá)異常，且具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡的作用[12]。有研究發(fā)現(xiàn)[13]miRNA-497可通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(B cell leukemia-2，Bcl-2)而發(fā)揮促進(jìn)缺血性神經(jīng)元調(diào)亡的作用。有研究報(bào)道[14]miRNA-497在缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury，IRI)過(guò)程中異常表達(dá)。既往資料顯示[15]miRNA-497在AMI大鼠心臟中表達(dá)明顯上調(diào)，敲低miRNA-497可減少AMI大鼠心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)自噬(autophagy)流。上述研究[13,15]在本研究中也得到了證實(shí)，本研究顯示miRNA-497抑制劑組各項(xiàng)指標(biāo)較miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組無(wú)顯著差異，提示miRNA-497是麝香保心丸改善急性心肌梗死后心室重構(gòu)中的關(guān)鍵分子。本研究顯示miRNA-497激動(dòng)劑+麝香保心丸組各項(xiàng)指標(biāo)較麝香保心丸組明顯異常，miRNA-497抑制劑+麝香保心丸組各項(xiàng)指標(biāo)較麝香保心丸組有顯著改善，麝香保心丸可能通過(guò)抑制miRNA-497表達(dá)而改善大鼠急性心肌梗死后心室重構(gòu)，這可為急性心肌梗死后心室重構(gòu)發(fā)掘出新藥研發(fā)靶點(diǎn)。

綜上所述，miRNA-497是麝香保心丸改善急性心肌梗死后心室重構(gòu)中的關(guān)鍵分子，這為急性心肌梗死后心室重構(gòu)提供新的研究方向。