微生物法測定發(fā)酵食品中維生素B12含量的研究

曲勤鳳，徐 瓊，張娜娜，劉 洋*，竇同海，鐘 江

（1.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233；2.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433）

維生素B12（vitamin B12，VB12）又稱為鈷胺素（cobalamin），是一類含鈷的咕啉類化合物的總稱，羥基鈷胺素（hydroxycobalamin）、氰鈷胺素（cyanocobalamin）、脫氧腺苷鈷胺素（deoxyadenosylcobalamin）和甲基鈷胺素（methylcobalamin）是維生素B12主要存在形式[1]。

天然維生素B12存在于動物產(chǎn)品中，包括魚、肉、雞蛋和牛奶等，一般由微生物代謝合成，植物和高等動物無法合成維生素B12[2]。2016年對上海地區(qū)素食人群膳食營養(yǎng)攝入調(diào)查發(fā)現(xiàn)，素食者維生素B12的每日攝入量遠(yuǎn)低于中國居民膳食維生素B12適宜攝入量[3]。許多學(xué)者開始關(guān)注到缺乏維生素B12對人體的影響，研究表明，維生素B12對糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用；母親的維生素B12缺乏或者攝入不足，可能會因?yàn)槿橹芯S生素B12含量低導(dǎo)致嬰兒的維生素B12缺乏[4]，人體血清中維生素B12濃度還與帕金森病患者周圍神經(jīng)損害程度呈負(fù)相關(guān)性[5]。

樸相哲等[6]對韓國某地區(qū)百歲老人長壽原因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，血清中穩(wěn)定的維生素B12含量是長壽的一個重要因素。通過對當(dāng)?shù)乩先孙嬍车恼{(diào)查發(fā)現(xiàn)，韓國傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品及泡菜和某些種類的海藻中發(fā)現(xiàn)大量維生素B12，這些食物的攝入對以蔬菜為主的營養(yǎng)不均衡的膳食結(jié)構(gòu)起到互補(bǔ)作用，從而提高韓國人壽命。

越來越多的天然發(fā)酵食品被報(bào)道含有豐富的維生素B12，如韓國泡菜（kimchi）、大豆發(fā)酵食品[7]、丹貝（Tempe）[8-9]等。雖然王緒卿等[10-11]在1981年建立維生素B12生物自顯譜面積定量法，用于測定豆類發(fā)酵食品中維生素B12含量。但中國食物維生素B12含量的數(shù)據(jù)依舊匱乏，國內(nèi)幾個廣泛使用的營養(yǎng)計(jì)算軟件中均不包含維生素B12項(xiàng)目。為彌補(bǔ)這個空白，顧婭楠等[12]收集國內(nèi)外現(xiàn)有維生素B12食物數(shù)據(jù)庫，整理分析成中國常見食物的維生素B12數(shù)據(jù)表。

目前，能夠用于測定維生素B12的方法有很多，如儀器法[12-13]、酶聯(lián)免疫法[14]、化學(xué)發(fā)光分析法[15-16]、微生物法[17-18]等。由于發(fā)酵食品基質(zhì)成分復(fù)雜，發(fā)酵產(chǎn)物干擾較大，一般儀器法難以滿足定量要求，微生物法是經(jīng)典的維生素測定方法，可靈敏地檢測出基質(zhì)中存在可被微生物吸收具有生物學(xué)活性的維生素B12，這是微生物法區(qū)別于其他方法的最大特點(diǎn)。

發(fā)酵食品由于微生物的發(fā)酵作用使得除了食品本身的營養(yǎng)外，具備了由微生物發(fā)酵過程中代謝所積累的益生物質(zhì)，而食品中的維生素B12也主要由微生物代謝產(chǎn)生。本研究以維生素B12為指標(biāo)，采用微生物法進(jìn)行檢測，對市場上常見的發(fā)酵食品進(jìn)行含量測定，了解發(fā)酵食品中維生素B12的潛在價(jià)值。同時為完善食品膳食成分表提供食品中維生素B12含量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)樣品采購于當(dāng)?shù)丶Q(mào)市場和超市，詳見表1。

表1 市售大豆發(fā)酵食品樣品Table 1 Commercially available samples of fermented soybean foods

1.1.2 菌株

萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）。

1.1.3 試劑

維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：美國Sigma-Aldrich公司；無水磷酸氫二鈉、無水偏重亞硫酸鈉、檸檬酸（含一個結(jié)晶水）（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基、維生素B12測定用培養(yǎng)基：美國BD公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GI6-2型電熱恒溫培養(yǎng)箱：美國SHELLAB公司；MS204S電子天平、Seven Easy酸度計(jì)：美國METTLER TOLEDO公司；Infinite M200全波長多功能微孔板分析系統(tǒng)：瑞士Tecan公司；Milli-Q超純水機(jī)：德國Merck公司；GZ99/JP-C100B型超聲波振蕩器：北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

樣品處理參考GB5413.14—2010《嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定》[19]并稍做修改，固體粉碎均質(zhì)后稱取一定質(zhì)量的樣品，加入10 mL維生素B12前處理液（維生素B12前處理液：稱取無水磷酸氫二鈉1.3 g，無水偏重亞硫酸鈉1.0 g，檸檬酸1.2 g，用100 mL水溶解）混合后再加150 mL水，經(jīng)超聲波振蕩器處理30 min后于121℃水解10 min，冷卻后調(diào)pH值至4.5±0.2，再用水定容至250 mL，過濾。移取濾液5 mL，加入水20～30 mL，調(diào)pH值至6.8±0.2，用水定容至100 mL，作為試樣溶液。

1.3.2 接種菌懸液的制備

將保存的萊士曼氏乳酸桿菌轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基中，在36℃培養(yǎng)18～24 h，再將其接種于乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)24 h。將乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)液4 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入10 mL生理鹽水，混勻，再4 000 r/min離心5 min，棄去上清液，重復(fù)清洗3次。最后加10 mL生理鹽水，混勻，制成菌懸液。以生理鹽水作空白，于波長550 nm處測定菌懸液的透光率，調(diào)節(jié)菌懸液的透光率為60%～80%用于維生素B12含量的測定。

1.3.3 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

維生素B12標(biāo)準(zhǔn)貯備液的制備：精確稱取1 mg維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)25%的乙醇溶液溶解，稀釋并定容至維生素B12質(zhì)量濃度為100 ng/mL。從中吸取5 mL，用體積分?jǐn)?shù)25%的乙醇定容至維生素B12質(zhì)量濃度為1 ng/mL，再分別吸取5 mL用水定容至250 mL和500 mL容量瓶中，作為高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.02 ng/mL）和低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01 ng/mL）。

按表2順序加入水、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液和維生素B12測定用培養(yǎng)基于培養(yǎng)管中，平行配制3份。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制Table 2 Preparation of standard solution mL

1.3.4 樣品待測液的制備

按表3順序加水、樣品溶液和維生素B12測定用培養(yǎng)基于培養(yǎng)管內(nèi)，平行配制3份。每份樣品需帶樣品空白試管一支，管內(nèi)分別加入5 mL待測液和5 mL維生素B12測定用培養(yǎng)基。

表3 樣品待測液的配制Table 3 Preparation of sample solutionmL

1.3.5 接種培養(yǎng)

將標(biāo)準(zhǔn)曲線培養(yǎng)管和樣品管于121℃滅菌5 min，取出后將試管迅速冷卻。接種菌懸液50μL至上述各試管中，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線1號管和樣品空白管除外。將試管放入培養(yǎng)箱，36℃培養(yǎng)19～20 h。

1.3.6 結(jié)果測定和計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)曲線培養(yǎng)管2號為空白，在波長550 nm處測定各試管吸光度值（A）。以維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)VB12標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中維生素B12含量，其計(jì)算公式如下：

式中：X為試樣中維生素B12的含量，μg/100 g；Cx為試樣管中每毫升測定液中維生素B12含量的平均值，ng；m為試樣的質(zhì)量，g；f為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)曲線

以維生素B12含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制VB12標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，維生素B12含量為0.001～0.010 ng/mL時，回歸方程為y=3.884x+0.045，R2=0.995，線性關(guān)系良好，達(dá)到檢測要求。

圖1 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of vitamin B12

2.2 市售發(fā)酵食品中維生素B12含量的檢測分析

本研究共采集了樣品種類及數(shù)量分別是發(fā)酵豆制品（3種類型腐乳27批次[20]、納豆2批次、韓國大醬2批次、豆汁（熟）1批次）和發(fā)酵乳制品（奶酪7批次），利用本研究建立的微生物法對樣品中維生素B12的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果見表4。

由表4可知，不同廠家生產(chǎn)的同一類型腐乳維生素B12含量不同：紅腐乳各批次間維生素B12含量為0.26～0.79μg/100 g，變異系數(shù)（coefficient of variance，CV）為42.7%，白腐乳各批次間維生素B12含量為0.18～0.66μg/100 g，CV為40.4%，臭腐乳各批次間維生素B12含量為2.41～5.35μg/100 g，CV為30.2%。說明各個獨(dú)立腐乳樣品之間維生素B12的含量差別很大，同一類型腐乳維生素B12含量最大值是最小值的3.6倍（白腐乳）、3倍（紅腐乳）和2.2倍（臭腐乳）。

同時發(fā)現(xiàn)雖然同為腐乳但不同類型腐乳維生素B12含量差別較大：臭腐乳9個批次間平均維生素B12含量為（3.57±1.08）μg/100 g，紅腐乳和白腐乳中分別為（0.48±0.21）μg/100g和（0.41±0.16）μg/100 g，雖然不同廠家產(chǎn)品維生素B12的含量有較大的差異性，但是臭腐乳這一類型產(chǎn)品維生素B12含量顯著高于紅腐乳和白腐乳（P＜0.01）。同一個生產(chǎn)企業(yè)不同腐乳類型維生素B12具有顯著差異：如樣品H-1、B-1、C-1和H-2、B-2、C-2分別來源于浙江省和北京市某生產(chǎn)廠家，但是臭腐乳（C-1、C-2）顯示出更高含量的維生素B12，推測臭腐乳中高含量的維生素B12可能是有別于紅腐乳和白腐乳的生產(chǎn)工藝所引起的。

表4 腐乳樣品維生素B12的含量Table 4 Contents of vitamin B12 in sufu sample

除腐乳外其他發(fā)酵豆制品及奶酪樣品的維生素B12含量見表5。由表5可知，納豆（ND-1：0.50μg/100 g，ND-2：0.20μg/100 g）、韓國大醬（DJ-1：0.97μg/100 g，DJ-2：0.10μg/100 g）和豆汁（熟）（0.52μg/100 g）的維生素B12含量均低于臭腐乳，說明同為大豆發(fā)酵食品，使用不同的發(fā)酵菌種、發(fā)酵過程對于維生素B12含量有著顯著性差異。奶酪樣品NL-1和NL-10的維生素B12含量分別為1.24μg/100 g和1.54μg/100 g，相比較其他發(fā)酵產(chǎn)品的維生素B12含量高，但其總體維生素B12的分布及含量也均低于臭腐乳。

表5 其他發(fā)酵食品維生素B12的含量Table 5 Contents of vitamin B12 in other fermented foods

3 結(jié)論

本研究建立的微生物法可用于食品中維生素B12含量的測定。以腐乳、納豆、韓國大醬、豆汁以及奶酪為研究對象，利用微生物法對其維生素B12含量進(jìn)行了測定。發(fā)現(xiàn)臭腐乳所含維生素B12的含量顯著高于白腐乳和紅腐乳。其他發(fā)酵豆制品維生素B12的含量均低于臭腐乳。通過本研究明確了發(fā)酵食品維生素B12的含量及分布，為完善食品膳食成分表提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。