紅茶菌發(fā)酵馬鈴薯醋工藝研究

胡曉磊，吳 迅，馬永輝，張惠玲*

（1.寧夏大學(xué) 寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

馬鈴薯是我國當(dāng)前最具發(fā)展前景的高產(chǎn)糧食作物之一，近年來國家一直提倡增加馬鈴薯深加工產(chǎn)品，提高馬鈴薯附加值[1-2]，快速推動(dòng)我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。馬鈴薯是寧夏優(yōu)勢(shì)特色農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)中的重點(diǎn)支持產(chǎn)業(yè)，具有品種優(yōu)良、加工風(fēng)味好、淀粉含量高等優(yōu)勢(shì)[3-6]。其包含了人體所需的各種營養(yǎng)素（如蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維、礦物質(zhì)元素等），具有預(yù)防腸胃疾病、抗衰老、抗氧化、降低膽固醇、防止動(dòng)脈硬化、減少白內(nèi)障、角膜炎等相關(guān)炎癥、排毒、解毒等功能性作用[7]。

紅茶菌是由多種醋酸菌、酵母菌和乳酸菌組成的共生體，俗稱“海寶”、“胃寶”[8]，具有抵抗癌癥、提高消化能力、刺激免疫系統(tǒng)、減少發(fā)炎、清理腸胃、幫助消化、預(yù)防和治療便秘和痔瘡、預(yù)防“三高”、結(jié)石及一些心血管疾病、排毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等作用[9-12]。到目前為止，從各種紅茶菌中分離到的醋酸菌有薩克塔堤查仁桿菌（Tanticharoenia sakaeratensis）、羅旺醋酸桿菌（Acetobacter lovaniensis）、過氧化醋酸桿菌（Acetobacter peroxydans）、蒲桃醋酸桿菌（Acetobactersyzygii）、沖繩醋酸桿菌（Acetobacterokinawensis）、熱帶醋酸桿菌（Acetobacter tropicalis）、醋化醋桿菌（Acetobacter liquefy aciens）等；酵母菌有釀酒酵母（Saccha romyces cerevisiae）、克魯斯假絲酵母（Candiada krusei）、弗洛接合有孢圓酵母（Zygotorulaspora florentina）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、博伊丁假絲酵母（Candida boidinii）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）等[13]；乳酸菌有保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）等。

國內(nèi)現(xiàn)在對(duì)紅茶菌的研究主要集中于發(fā)酵條件優(yōu)化，且都僅局限于搖瓶試驗(yàn)，在發(fā)酵罐發(fā)酵方面的優(yōu)化少有涉及[14]。同時(shí)，馬鈴薯醋多為運(yùn)用酵母菌和醋酸菌進(jìn)行發(fā)酵而成。目前，國內(nèi)關(guān)于利用紅茶菌發(fā)酵馬鈴薯醋的研究尚未報(bào)道。人們對(duì)紅茶菌作用機(jī)理的研究寥寥無幾，且紅茶菌功能性食品品種極少，市場化程度低[15]。

本研究以馬鈴薯（青薯9號(hào)）為原料，利用紅茶菌進(jìn)行馬鈴薯醋發(fā)酵，并以陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量為響應(yīng)值，初始糖度、紅茶菌接種量及發(fā)酵溫度為考察因素，采用響應(yīng)面法優(yōu)化馬鈴薯醋發(fā)酵工藝。加深對(duì)紅茶菌的研究，拓寬馬鈴薯加工渠道，發(fā)展馬鈴薯加工業(yè)，實(shí)現(xiàn)增值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

馬鈴薯（青薯9號(hào)）：寧夏黃土地農(nóng)業(yè)食品有限公司提供（淀粉含量15.1%，粗蛋白含量2.08%，維生素C含量18.6 mg/100 g鮮薯）[16]；紅茶菌：寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

α-淀粉酶（≥3 700 U/g）、糖化酶（≥10 000 U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；紅茶、白砂糖、檸檬酸（均為食用級(jí)）：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

HH.S21-6型電熱恒溫水浴鍋、BSP-250型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PB-10型酸度計(jì)：北京賽多利斯公司；WYT-4型手持糖度計(jì)：泉州中友光學(xué)儀器有限公司；T-1000型電子天平：美國雙杰兄弟（集團(tuán)）有限公司；H-1650型臺(tái)式高速離心機(jī)：上海趙迪生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅茶菌的活化與培養(yǎng)

按照糖∶紅茶∶水為1∶15∶100的比例[17]，將紅茶加入沸水中，于85～90℃保持25 min，過濾得茶汁，加入溶化的糖水，接入40%紅茶菌種母液，放入玻璃容器中，用單層紗布封口，于30℃靜置發(fā)酵7 d，待液面產(chǎn)生數(shù)層菌膜即可。

用消毒后的鑷子取出容器內(nèi)殘余的菌膜，去除菌膜上褐變的部分，用無菌水沖洗菌膜數(shù)遍。無菌水洗凈容器后，倒入成熟的紅茶菌菌液和新鮮的紅茶糖水及處理好的紅茶菌菌膜，再按上述方法繼續(xù)培養(yǎng)紅茶菌，直至擴(kuò)大培養(yǎng)到所需用量。

1.3.2 馬鈴薯醋工藝流程及操作要點(diǎn)

馬鈴薯預(yù)處理→蒸煮→打漿→酶解→滅酶→過濾→調(diào)糖、調(diào)酸→高溫滅菌→接紅茶菌→紅茶菌發(fā)酵→陳釀→過濾→灌裝→滅菌→成品

（1）原料預(yù)處理、蒸煮、打漿[18]：將馬鈴薯進(jìn)行清洗、去皮、切分，蒸熟晾涼后，加入馬鈴薯質(zhì)量4倍的水進(jìn)行打漿，制成馬鈴薯原液。

（2）酶解、滅酶、過濾：在馬鈴薯原液中加入0.23%α-淀粉酶、0.23%糖化酶，在60℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行液化、糖化4 h，90℃水浴10 min，滅酶并過濾，制成馬鈴薯糖化液。

（3）調(diào)糖、調(diào)酸：在馬鈴薯糖化液中加入白砂糖、檸檬酸，將糖度調(diào)至18.0%，pH調(diào)至3.80。

（4）高溫滅菌：馬鈴薯糖化液在121℃條件下高壓滅菌15 min，冷卻待用。

（5）紅茶菌接種與發(fā)酵：將冷卻后的馬鈴薯糖化液接入活化后的紅茶菌中，放入恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行紅茶菌發(fā)酵，測定總酸含量接近2.5 g/100 mL后結(jié)束發(fā)酵。

（6）陳釀、過濾：將發(fā)酵結(jié)束的原醋陳釀60 d，離心、過濾制得馬鈴薯醋。

（7）灌裝、滅菌：選擇合適的包裝瓶，將馬鈴薯醋液灌裝進(jìn)去，封好進(jìn)行巴氏殺菌。

1.3.3 馬鈴薯醋發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

初始糖度：馬鈴薯糖化液過濾后，分別加白砂糖調(diào)糖度至12.0%、14.0%、16.0%、18.0%、20.0%，接入20%培養(yǎng)好的紅茶菌液，于30℃恒溫生化培養(yǎng)箱中深層發(fā)酵，測定陳釀前發(fā)酵液的總酸含量。

紅茶菌接種量：馬鈴薯糖化液過濾后，調(diào)糖度至20%，分別接入5%、10%、15%、20%、25%紅茶菌液，在30℃恒溫生化培養(yǎng)箱中深層發(fā)酵，測定陳釀前發(fā)酵液的總酸含量。

發(fā)酵溫度：馬鈴薯糖化液過濾后，調(diào)糖度至20%，接入20%紅茶菌液，分別于28℃、30℃、32℃、34℃、36℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中深層發(fā)酵，測定陳釀前發(fā)酵液的總酸含量。

1.3.4 馬鈴薯醋發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以陳釀前馬鈴薯醋中的總酸含量（Y）為響應(yīng)值，考察初始糖度（A）、紅茶菌接種量（B）及發(fā)酵溫度（C）3個(gè)因素對(duì)馬鈴薯醋發(fā)酵的影響。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平見表1。

表1 馬鈴薯醋發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for potato vinegar fermentation process optimization

1.3.5 分析方法

總酸含量（以醋酸計(jì)）的測定：酚酞指示劑法[19]；糖度的測定（以葡萄糖計(jì)）：3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[20]；感官指標(biāo)的測定：參照GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》；細(xì)菌總數(shù)的測定：參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》；大腸菌群的測定：參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》；致病菌的測定：GB/T 4789.22—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)調(diào)味品檢驗(yàn)》；可溶性固形物含量的測定：參照NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定折射儀法》。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯醋發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 初始糖度對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響

初始糖度對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響結(jié)果見圖1。

圖1 初始糖度對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響Fig.1 Effect of initial sugar content on total acid content in potato vinegar before aging

由圖1可以看出，在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，隨著初始糖度的增大，陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量呈先增大后減小的變化趨勢(shì)。當(dāng)初始糖度為18.0%時(shí)，陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量最高，為2.34 g/100 mL。因此，確定最佳初始糖度為18.0%。

2.1.2 紅茶菌接種量對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響

紅茶菌接種量對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響結(jié)果見圖2。

圖2 紅茶菌接種量對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響Fig.2 Effect of kombucha inoculum on total acid content in potato vinegar before aging

由圖2可以看出，在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，隨著紅茶菌接種量的增大，陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量呈先增大后減小的變化趨勢(shì)。當(dāng)紅茶菌接種量為20%時(shí)，陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量最高，為2.32 g/100 mL。因此，確定紅茶菌最佳接種量為20%。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響

發(fā)酵溫度對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on total acid content in potato vinegar before aging

由圖3可以看出，在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，發(fā)酵溫度在28～36℃的范圍內(nèi)，陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量隨發(fā)酵溫度的升高呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度為32℃時(shí)，陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量最高，為2.33 g/100 mL。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為32℃。

2.2 馬鈴薯醋發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量（Y）為響應(yīng)值，利用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察初始糖度（A）、紅茶菌接種量（B）及發(fā)酵溫度（C）3個(gè)因素對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響，結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Benhnken tests

續(xù)表

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到總酸含量（Y）與初始糖度（A）、紅茶菌接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）的回歸方程：

由表3可知，模型P＜0.000 1，極顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，表明回歸模型的擬合度較好，可以用該方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。各因素對(duì)結(jié)果影響的主次順序?yàn)锳＞C＞B，即初始糖度＞發(fā)酵溫度＞紅茶菌接種量。由方差分析可知，因素一次項(xiàng)A、B、C和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

通過軟件繪制響應(yīng)面圖進(jìn)行可視化分析，初始糖度、紅茶菌接種量、發(fā)酵溫度間交互作用的響應(yīng)面和等高線見圖4。由圖4可知，拋物面開口均向下，有極大值點(diǎn)；等高線均呈圓形，表明交互作用對(duì)結(jié)果影響不顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖4 各因素交互作用對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on total acid content in potato vinegar before aging

運(yùn)行軟件的期望函數(shù)優(yōu)化程序，以陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量達(dá)到最大值為目標(biāo)，獲得優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)為初始糖度18.62%、紅茶菌接種量20.56%、發(fā)酵溫度33.65℃，預(yù)測總酸含量可達(dá)到2.55 g/100 mL?？紤]到實(shí)際操作的局限性，將最優(yōu)發(fā)酵條件調(diào)整為初始糖度19%、紅茶菌接種量21%、發(fā)酵溫度34℃，在該條件下重復(fù)試驗(yàn)5次，獲得陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量為2.48 g/100 mL，與預(yù)測值基本符合，充分證明了該模型的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。綜上所述，紅茶菌發(fā)酵馬鈴薯醋的最優(yōu)發(fā)酵條件為初始糖度19%、紅茶菌接種量21%、發(fā)酵溫度34℃。

2.3 馬鈴薯醋的質(zhì)量指標(biāo)

2.3.1 感官指標(biāo)

色澤：淺黃色；香氣：醇香，醋香香味協(xié)調(diào)；味道：酸中帶甜，無不良?xì)馕?；體態(tài)：澄清透亮，無沉淀，無浮膜。

2.3.2 理化指標(biāo)

馬鈴薯醋陳釀后總酸含量（以乙酸計(jì)）為3.60 g/100 mL；可溶性固形物含量為10.50%，符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18187—2000《釀造食醋》具體要求。

2.3.3 微生物指標(biāo)

細(xì)菌總數(shù)≤500 CFU/mL；大腸桿菌未檢出；其他致病菌未檢出。符合GB 2719—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》具體要求。

3 結(jié)論

以新鮮馬鈴薯（青薯9號(hào)）為原料，利用紅茶菌中豐富的酵母菌、醋酸菌、乳酸菌組成的共生菌系對(duì)馬鈴薯糖化汁進(jìn)行發(fā)酵，制備馬鈴薯醋。馬鈴薯醋的最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵液初始糖度19%，紅茶菌接種量21%，發(fā)酵溫度34℃。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量為2.48 g/100 mL，較優(yōu)化前提高20.4%。經(jīng)陳釀后總酸可達(dá)3.60 g/100 mL，馬鈴薯醋澄清透亮，無沉淀，無浮膜；呈淺黃色；醋香香味協(xié)調(diào)；酸中帶甜，無不良?xì)馕丁Ｎ⑸镏笜?biāo)和理化指標(biāo)均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。