固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質譜法同時測定保健品中5種生物堿

王 強，汪晨霞*，江藍藍，尋知慶，郭新東，黃金鳳

（廣州質量監(jiān)督檢測研究院，廣東 廣州 511447）

生物堿（alkaloids）是一類存在于多種植物體內，由植物次生代謝產生的含氮有機化合物，種類繁多，具有顯著的藥理活性[1]，如阿托品為抗膽堿藥，可用于鎮(zhèn)靜、止痛；茶堿具有抗炎、抗過敏的作用；毛果蕓香堿與毒扁豆堿均為膽堿酯酶抑制藥；同時它們也對生物機體具有毒性，會引起惡心、嘔吐、心悸等癥狀，嚴重時可能對神經系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等造成損害導致死亡。如阿托品可能會引起中樞神經毒性[2]；煙堿會引起植物神經系統(tǒng)麻痹；毛果蕓香堿和毒扁豆堿會引起惡心、腹痛等不良反應；茶堿中毒會引起心律失常、昏迷等癥狀。

保健品是一類具有營養(yǎng)性、食品性天然藥品性質，能調節(jié)人體機能的功能性食品。近年來，隨著人們生活水平的提高，大家越來越關注自身的健康狀況，使得保健品具有極其廣闊的市場前景，但有一些不法商家在利益驅使下一味追求功效，向保健品中非法添加藥物，如在減肥產品中非法添加麻黃堿或茶堿[3-4]；添加阿托品用于緩解胃潰瘍[5]等，這些所謂的保健品雖然功效顯著，但若使用不當，將對消費者的健康和生命造成威脅，因此，人們在關注保健品顯著保健功效的同時，其安全性問題也引起了廣泛關注。國家食品藥品監(jiān)督管理總局于2012年發(fā)布了《保健食品中可能非法添加的物質名單（第一批）》[6]，其中就有麻黃堿；衛(wèi)生部印發(fā)的《保健食品禁用物品名單》[7]明確列出中草藥顛茄，其抗膽堿功效就來自于植物體內存在的阿托品、顛茄堿以及東莨菪堿等生物堿。但目前針對保健品中生物堿的檢驗方法缺失嚴重，生物堿檢測方面的研究主要集中在體液[8]、植物飲料[9]和中草藥[10]等幾個領域，由于保健品成分復雜，這些方法并不能完全適用于保健品中生物堿的檢測，因此，建立一個高效靈敏的針對保健品中生物堿的檢測方法對于嚴格控制保健品質量，保證消費者的健康安全具有非常重要的研究意義。

目前，應用于生物堿檢測的主要方法包括毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）[11]、薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）[12]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[13]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[14]和高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[15-20]等，如LIN A H等[21]通過LC-MS/MS測定了拳血漿中5種雷公藤多苷生物堿的含量以及研究其藥代動力學行為；姜昕易等[22]建立了一種HPLC同時測定黃柏中5種生物堿含量的方法。生物堿類化合物大部分沸點高、氣化難，適用于用液相色譜法進行分離，在HPLC的基礎上發(fā)展起來的超高效液相色譜法（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）儀器性能更優(yōu)、檢測速度更快；電噴霧質譜技術是目前應用最廣泛的“軟電離”質譜技術，具有靈敏度高、專屬性強、操作簡便的優(yōu)點，因此，選用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜（ultra-high performance liquid chromatographyelectrospray ionization-tandem mass spectrometry，UPLC-ESIMS/MS）可更好地滿足保健品中生物堿分析檢測的高要求。本研究采用超聲快速提取樣品、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）技術凈化，建立了一種同時測定保健品中5種生物堿（煙堿、毛果蕓香堿、茶堿、毒扁豆堿、阿托品）的UPLC-MS/MS方法，5種生物堿的結構式如下：

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

煙堿（CAS：54-11-5）、硫酸阿托品（CAS：55-48-1）、茶堿（CAS：58-55-9）、毒扁豆堿（CAS：57-47-6）：上海Anpel實驗科技股份有限公司；毛果蕓香堿（CAS：92-13-7）：美國Pharmacopeical Convention公司；所有標準品的純度均＞98%。乙腈、甲酸、氨水、甲醇（均為色譜級）：美國Merck公司；HLB固相萃取柱（500 mg、6 mL）、乙酸銨：上海Anpel實驗科技股份有限公司；Cleanert PCX（500 mg、6 mL）和Cleanert PEP（500 mg、6 mL）：天津Agela Technologies公司。

1.2 儀器與設備

Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀、TSQ Endura三重四級桿質譜儀：美國Thermo公司；Milli-Q超純水器：美國Millipore公司；MS3渦旋儀：德國IKA公司；KQ-250DV數控超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司；3K15離心機：德國Sigma公司；TurboVap LV氮吹儀：美國Caliper公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

混合標準中間液：分別稱取適量5種生物堿標準品用乙腈配制成單標儲備液（1 000μg/mL）；然后分別吸取適量的單標儲備液，用乙腈稀釋成質量濃度均為20μg/mL的混合標準溶液。再用該標準溶液稀釋成質量濃度為100μg/L混合標準中間液。

混合標準工作液：吸取適量的混合標準中間液用空白基質提取液稀釋定容，得到質量濃度分別為0.2μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L、10μg/L、20μg/L的系列混合標準工作溶液。所有標準溶液均需于4℃冰箱里保存。

1.3.2 樣品制備及前處理

片劑、膠囊：取20片/粒樣品置于粉碎機中，研磨均勻成粉末狀，室溫保存。稱取0.5 g（精確至0.001 g）于10 mL具塞比色管中，邊渦旋邊加入4 mL 0.1%甲酸水-乙腈（3∶1，V/V）將樣品混勻，超聲（1 000 W、40 kHz）萃取20 min，待樣品溫度降至室溫時用0.1%甲酸水-乙腈（3∶1，V/V）定容至5.0 mL。吸取適量提取液于高速離心管中，10 000 r/min離心5 min，取1.0 mL上清液待凈化。

1.3.3 樣品凈化

Cleanert PEP固相萃取柱依次用5 mL甲醇和5 mL水活化待用；取1.0 mL上清液上樣，待樣品全部通過小柱用5 mL水淋洗小柱，最后用5 mL甲醇洗脫樣品，收集全部洗脫液，50℃氮吹至近干，用0.1%甲酸水-乙腈（9∶1，V/V）定容至1.0 mL，渦旋混勻，過0.22μm濾膜待UPLC-MS/MS分析。

1.3.4 檢測條件

超高效液相色譜條件：Waters ACQUITY HSS T3液相色譜柱（2.1 mm×100 mm×1.8μm）；流動相：A為0.1%甲酸水（含10 mmol/L乙酸銨），B為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫程序：0～1 min，90%A；1～4 min，90%～50%A；4～5 min，50%～90%A；5～6 min，90%A；柱溫30℃；進樣量5μL；流速0.3 mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization source，ESI），正模式；數據采集：多反應監(jiān)測（multireaction monitoring，MRM）；電噴霧電壓3 500 V；離子化溫度300℃，輔助氣流速12 L/min；噴霧器溫度350℃，鞘氣流速40 L/min；碰撞氣為氬氣，1.5 mTorr；各組分的出峰時間、質譜信息、碰撞能壓及射頻電壓見表1。

表1 5種生物堿的質譜參數Table 1 MS parameters of five alkaloids

2 結果與分析

2.1 檢測條件的優(yōu)化

2.1.1 質譜條件的優(yōu)化

采用TSQ Endura三重四級桿質譜儀，在多反應監(jiān)測模式下，對5種生物堿的質譜條件進行優(yōu)化。將5種生物堿單標標準溶液，在ESI+和ESI-兩種模式下進行掃描。結果得出，5種生物堿易在ESI+模式下得到[M+H]+準分子離子峰，質譜信號響應較強。可能因為生物堿的N原子上含有孤對電子，容易加H+形成正電荷離子，然后選擇該特征準分子離子峰為母離子進行二級質譜分析，以響應值最大的碎片離子定為定量離子，次級響應最大的碎片離子定為定性離子，優(yōu)化射頻電壓及碰撞能等質譜參數。最佳質譜條件如表1，在此條件下5種生物堿的MRM色譜圖如圖1所示。

圖1 5種生物堿的多反應監(jiān)測色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatogram of five alkaloids

2.1.2 色譜柱的選擇

本次實驗考察了WatersACQUITYUPLCBEH（2.1 mm×100 mm×1.7 μm）、Waters ACQUITY HSS T3（2.1 mm×100 mm×1.8μm）和Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm×1.8μm）三種液相色譜柱對5種生物堿的分離效果。結果發(fā)現(xiàn)，Agilent Eclipse Plus C18和Waters ACQUITY UPLC BEH對這5種生物堿保留能力較差，毛果蕓香堿在Agilent Eclipse Plus C18柱上峰形分叉，毒扁豆堿在Waters ACQUITY UPLC BEH柱上拖尾嚴重；而所有目標化合物在Waters ACQUITY HSS T3柱上均能實現(xiàn)有效分離、保留效果好。這是因為ACQUITY UPLC HSS T3采用高強度硅膠基質，特有的C18烷基鍵合以及有效的端基封尾技術，可以兼容純水流動相，并提高了對水溶性好、極性大的化合物的保留能力。因此，本實驗選用Waters ACQUITY HSS T3分析生物堿類化合物，可改善目標化合物峰形以及保留穩(wěn)定性。

2.1.3 流動相的優(yōu)化

在電噴霧質譜正離子模式下流動相中加入酸性介質，有利于被測組分的離子化，從而提高其質譜響應和檢測靈敏度。本實驗分別考察了甲醇-0.1%甲酸（V/V）、乙腈-0.1%甲酸（V/V）、甲醇-0.1%三氟乙酸（V/V）和乙腈-0.1%三氟乙酸（V/V）四種混合溶劑體系，包括兩種有機相、兩種酸性介質作為流動相對5種生物堿的色譜分離效果和離子化程度的影響。結果表明，有機相為甲醇時質譜響應值低且保留重現(xiàn)性差；水相為0.1%三氟乙酸時茶堿和毛果蕓香堿的響應比0.1%甲酸的低50%。流動相為乙腈-0.1%甲酸水（V/V）時，色譜信號響應高但目標物峰形拖尾嚴重、有的化合物會出現(xiàn)峰分叉現(xiàn)象，色譜分離效率低。這可能是因為生物堿這一類堿性化合物的陰離子會與反相液相色譜柱固定相上裸露的硅膠基質相互作用，從而導致該類化合物在柱上保留過強、峰形拖尾，增加了分離難度，可以通過在流動相中加入乙酸銨可以改善生物堿類化合物的峰形和分離效果[22]。將10 mmol/L乙酸銨中加入0.1%甲酸水溶液，實驗表現(xiàn)出明顯的改善效果：峰展寬變小，峰拖尾現(xiàn)象得到明顯改善，峰形尖銳、色譜分離度得到了提高，這可能是因為乙酸銨防止了固定相中硅醇活性基團與目標物組分相互作用。因此，本實驗采用乙腈與0.1%甲酸水（含10 mmol/L乙酸銨）（V/V）混合的溶液作流動相進行梯度洗脫。

2.2 實驗方法的優(yōu)化

2.2.1 樣品提取溶劑

目標物的極性差異較大，因此，適合采用混合溶劑來進行分離提取。生物堿通常有兩種提取方式：一種是酸水提取法，大部分生物堿一般以鹽的形式存在，用酸水提取使得生物堿酸化，最大程度轉化成鹽增大其在水中的溶解度；第二種是堿水提取法，用堿水堿化可將生物堿游離出來，再用有機溶劑提取。由于酸化前處理操作簡單，因此，選用0.1%甲酸水-乙腈（V/V）混合溶劑對樣品進行提取，結果見圖2。

圖2 不同提取溶劑對回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction solvents on recovery rates

由圖2可知，5種生物堿隨著混合溶劑體系中水相的增大，提取回收率在逐漸增加，這說明5種生物堿在0.1%甲酸的作用下酸化效果好，水溶性增大，增強了提取效率。因此，選用0.1%甲酸水∶乙腈=3∶1（V/V）為保健品中目標物的提取溶劑。

2.2.2 樣品提取方式

保健品的形態(tài)多樣，有口服液、片劑、膠囊等。片劑與膠囊樣品在提取溶劑中不易分散且保健品前處理所用的樣品量和提取溶劑量都較少，而超聲萃取法是利用超聲波的空化作用、機械效應和熱效應等加速樣品中各組分的釋放、幫助其擴散和溶解于提取溶劑中，可以顯著改善提取效果的一種有效的提取方法。因此，適合用于保健品的前處理過程，操作簡單，可幫助樣品分散均勻、縮短提取時間，提高提取效率。本實驗研究了不同超聲時間對保健品中目標物提取效率的影響，結果見圖3。

圖3 不同超聲時間對回收率的影響Fig.3 Effect of different ultrasonic time on recovery rates

由圖3可知，隨著超聲時間的延長，提取溶劑與樣品接觸的越充分，目標物的提取回收率逐漸增加，到20 min后開始變化不大，這說明超聲時間＞20 min后，樣品的萃取過程趨于一定的平衡，從節(jié)約時間和能源的角度考慮，選擇提取效果已經能滿足分析要求的20 min為實驗的超聲時間。

2.2.3 樣品凈化方法

由于保健品基質復雜、干擾物多，若超聲萃取后直接進行分析檢測，基體干擾大。因此，需要根據被測目標物的性質，選擇合適的凈化方式，排除基體干擾，分離和富集樣品中的目標物。固相萃取法利用選擇性吸附與選擇性洗脫的色譜分離原理，以達到富集、分離、凈化的目的，可用于降低樣品基質干擾、提高目標物的選擇性和檢測的靈敏度，在食品、化工等領域得到了越來越廣泛的應用。常用的萃取柱包括HLB、C18、NH2不同屬性的填料等，由于生物堿極性較大，不適合用反相固相萃取凈化；而PEP和HLB的填料均為一類兩由種不同性質的化合物組合而成的共聚物，可同時表現(xiàn)出親水親酯的特性，從而對極性和非極性化合物具有均衡的吸附作用；MCX作為陽離子交換柱，適合于離子型化合物的分析。因此，本研究分別考察了MCX、PEP和HLB固相萃取柱的凈化效果，結果見圖4。

圖4 不同固相萃取柱對回收率的影響Fig.4 Effect of different solid phase extraction columns on recovery rates

由圖4可知，加標樣品提取液上樣后，Cleanert PEP和Oasis HLB先用5 mL水淋洗再用5 mL甲醇洗脫，Cleanert PCX用5 mL甲醇淋洗再用5 mL 5%氨化甲醇（V/V）洗脫。結果表明，PEP柱對所有目標物能夠實現(xiàn)有效的分離富集；HLB對這5種生物堿的保留較差，目標物分別在上樣、淋洗和洗脫的過程中均有流出；MCX柱對毛果蕓香堿、毒扁豆堿和阿托品的的回收效果較好，但阿托品的回收率穩(wěn)定性差，可能是因為阿托品在用氨化甲醇洗脫時堿性條件下發(fā)生了水解，而煙堿和茶堿的回收率較低可能因為這兩種化合物堿性較強，洗脫所用的氨化甲醇堿性不足以將其置換下來。因此，本實驗選擇PEP固相萃取小柱凈化。

2.3 方法學技術指標考察

2.3.1 基質效應

基質效應是指樣品中除分析物以外的組分會對分析物的分析產生明顯的干擾，影響分析結果的準確性。在UPLCMS/MS中共流出的基質會與分析物在離子化過程中產生作用而影響目標物的離子化效率。所以基質效應可能會影響檢測方法的靈敏度、精密度和準確度。而不同類型的保健品，基質效應也存在一定的差異。本實驗采用空白基質提取液配制標準工作液，空白基質溶液的制備與樣品前處理過程一致，這樣標準工作溶液和樣品溶液都具有相似的基質環(huán)境，從而確保定量所用線性方程的適用性。

2.3.2 線性范圍及方法檢出限

在最佳UPLC-MS/MS儀器條件下測定0.2～20μg/L系列標準工作混合溶液，以目標物的質量濃度（x）為橫坐標，質譜響應（y）為縱坐標，得到線性回歸方程。以0.2μg/L標準工作混合溶液的信噪比（S/N=3）結合樣品前處理過程計算得出方法的檢出限（limit of detection，LOD），其線性方程、相關系數和方法檢出限見表2。由表2可知，在0.2～20μg/L范圍內5種生物堿線性回歸方程相關系數R2均≥0.999 0，方法檢出限為0.6～0.8 μg/kg。

表2 5種生物堿的線性方程、線性范圍、相關系數及檢出限Table 2 Linear regression equations,linear range,correlation coefficients and limit of detection of five alkaloids

2.3.3 方法精密度及回收率

表3 5種生物堿加標回收率及精密度實驗結果Table 3 Results of standard recovery rate and precisions tests of five alkaloids

在最優(yōu)的實驗條件下，選取膠囊、口服液、片劑3種基質的空白樣品進行添加回收實驗，分別添加3個加標濃度，每個加標濃度平行測定6次，計算回收率及其相對標準偏差，結果見表3。由表3可知，3個添加濃度的回收率為87.9%～99.1%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.2%～5.7%。結果表明，該方法精密度和準確度良好。

2.4 實際樣品測定

隨機購買了本市市售的口服液、片劑和膠囊共30種不同類型的保健品采用本方法進行檢測，均未檢出5種生物堿。

3 結論

本研究選用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術，針對保健品中可能出現(xiàn)的非法添加成分，建立同時測定5種生物堿（煙堿、毛果蕓香堿、茶堿、毒扁豆堿、阿托品）的方法。通過優(yōu)化色譜條件和質譜參數得到了最優(yōu)的檢測條件；優(yōu)化樣品提取時間及固相萃取凈化方法對目標物實現(xiàn)了較好的提取和富集。該方法樣品前處理操作簡單；對這幾種生物堿的檢測線性范圍寬、靈敏度高、檢出限低；所測結果準確度高、重現(xiàn)性好，可為保健品的質量安全監(jiān)管提供技術支持。