響應(yīng)面法優(yōu)化甜米酒酸菜發(fā)酵工藝

康 嬌，薛橋麗，李 靜，楊從緒，程鎮(zhèn)朝，王 富，胡永金*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 學(xué)報編輯部，云南 昆明 650201）

酸菜是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，但傳統(tǒng)自然發(fā)酵的酸菜產(chǎn)品存在不穩(wěn)定、發(fā)酵時間長、亞硝酸鹽含量高等諸多問題，嚴(yán)重的制約著酸菜的工業(yè)化發(fā)展[1-4]。

乳酸菌（lactic acid bacteria）是泡菜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群，對酸菜風(fēng)味的形成具有重要意義[5-7]。果蔬中的亞硝酸鹽對人體的健康有潛在影響，在低鹽泡菜發(fā)酵過程中，乳酸菌分泌的有機酸及細(xì)菌素可抑制病原菌生長[8-9]。一些乳酸菌作為益生菌，對人體健康有益，如明串珠菌（Leuconostoc）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）等，特別是植物乳桿菌，很可能明顯降低泡菜中N-亞硝基二甲胺及其前體物質(zhì)（亞硝酸鹽、二甲胺、生物胺等）的含量[10-12]。

在酸菜的制作過程中加入甜米酒后，可增強酸菜的口感及風(fēng)味[13-14]，從傳統(tǒng)優(yōu)良酸菜中分離的優(yōu)勢乳酸菌株，通過響應(yīng)面設(shè)計制作出低亞硝酸鹽含量、品質(zhì)穩(wěn)定且風(fēng)味俱佳的甜米酒酸菜，為傳統(tǒng)酸菜的改造及甜米酒酸菜的加工提供一定理論和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）FY1、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）FY2：分離自云南富源酸菜，本實驗室4℃斜面保存。

1.1.2 原料

青菜、甜米酒（酒精度0.5%vol）、白蘿卜、食鹽、白砂糖、紅辣椒粉、茴香粉：市售。

1.1.3 試劑

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液：廣州威佳科技有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

種子培養(yǎng)基：500 g白蘿卜加入200 mL水榨汁，4層紗布過濾取濾液，濾液加入5%的蔗糖，121℃滅菌15 min，得種子培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

AE100S電子分析天平：梅特勒托利多儀器有限公司；722s分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸菜的工藝流程及操作要點

操作要點：

清洗、晾曬：去除老葉、爛葉，清水洗凈青菜，并晾曬至失水率40%左右即可。

切碎：將處理好的青菜切為2 cm寬。

菌種活化：將FY1與FY2分別各挑取兩環(huán)至MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)48 h后活化。

種子液：兩株乳酸菌分別按3%的接種量接入種子培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)48 h得到種子液。將種子液含菌量分別調(diào)至4.0×107～5.0×107CFU/mL于4℃冷藏備用。

調(diào)味：將切好的青菜與配料（食鹽、白砂糖、甜米酒等）混合攪拌均勻。

裝瓶、發(fā)酵：將瓶子煮沸5 min進行殺菌消毒，裝瓶時將材料壓實，室溫條件下進行厭氧發(fā)酵。

1.3.2 甜米酒酸菜發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

分別考察乳酸菌添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、乳酸菌添加比例（FY1∶FY2=1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1）、發(fā)酵時間（3 d、6 d、9 d、12 d、15 d）、食鹽添加量（0、2%、4%、6%、8%）、白砂糖添加量（0、2%、4%、6%、8%）、甜米酒添加量（0、5%、10%、15%、20%）6個因素對甜米酒酸菜中總酸含量、亞硝酸鹽含量及感官評分的影響。

1.3.3 Plackett-Burman試驗設(shè)計

Plackett-Burman（PB）設(shè)計，用于中心組合試驗前挑選優(yōu)化因素。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻[15]，進行PB設(shè)計（N=12），以感官評分為評價指標(biāo)，考察發(fā)酵時間（A）、食鹽添加量（B）、白砂糖添加量（C）、甜米酒添加量（D）4個因素對甜米酒酸菜感官評分的影響，PB試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

1.3.4 甜米酒酸菜發(fā)酵工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗

試驗采用Box-Behnken設(shè)計，研究食鹽添加量（X1）、白砂糖添加量（X2）、甜米酒添加量（X3）對甜米酒酸菜感官評分的影響，選取最優(yōu)配方。響應(yīng)面試驗因素與水平如表2。

表2 甜米酒酸菜工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology for fermentation technology optimization of pickle with sweet rice wine

1.3.5 測定方法

（1）感官評定

酸菜成熟后，請10名專業(yè)人員對甜米酒酸菜從4個方面進行感官評分，滿分100分，結(jié)果取平均值，感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表3。

表3 甜米酒酸菜感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standard of pickle with sweet rice wine

（2）理化指標(biāo)的測定

亞硝酸鹽含量：參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[17]中的方法進行測定；總酸含量：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[18]中酸堿滴定法測定。

總砷、無機砷、鉛、糖精鈉、山梨酸、苯甲酸、合成著色劑：根據(jù)GB/T 5009.54—2003《醬腌菜衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[19]中的方法測定。

（3）微生物指標(biāo)的測定

大腸菌群、致病菌（金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌）：根據(jù)GB 2714—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)醬腌菜》[20]進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜米酒酸菜發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 乳酸菌添加量對甜米酒酸菜感官及理化指標(biāo)的影響

將乳酸菌添加量分別設(shè)定為1%、2%、3%、4%、5%，乳酸菌添加比例為1∶1，食鹽添加量4%，白砂糖添加量6%，甜米酒添加量10%，自然條件下發(fā)酵10 d，得到成熟的酸菜后，考察不同乳酸菌添加量對甜米酒酸菜的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同乳酸菌添加量對甜米酒酸菜品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of different lactic acid bacteria addition on the quality ofpickle with sweet rice wine

由圖1可看出，隨著乳酸菌添加量的增加，甜米酒酸菜的亞硝酸鹽含量呈下降的趨勢，從添加量為1%時的6.28 mg/kg降至添加量為3%時的1.52 mg/kg，之后趨于穩(wěn)定，雖然乳酸菌添加量為1%～3%時亞硝酸鹽含量有顯著性差異（P＜0.05），但均低于我國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（20 mg/kg）；不同乳酸菌添加量條件下甜米酒酸菜的總酸含量基本穩(wěn)定，添加量為2%時總酸含量最低，為2.12 g/100 g，添加量為5%時總酸含量最高，為3.58 g/100 g；甜米酒酸菜的感官評分隨著乳酸菌添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，乳酸菌添加量為3%時感官評分達到最高，為87.5分；因此，選擇最適乳酸菌添加量為3%。

2.1.2 乳酸菌添加比例對甜米酒酸菜感官及理化指標(biāo)的影響

將乳酸菌添加比例（FY1∶FY2）分別設(shè)定為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，乳酸菌添加量3%，其他條件同2.1.1，結(jié)果見圖2。

圖2 不同乳酸菌添加比例對甜米酒酸菜品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of different lactic acid bacteria ratio on the quality of pickle with sweet rice wine

由圖2可看出，甜米酒酸菜的亞硝酸鹽含量在FY1∶FY2為1∶2時最低為1.59 mg/kg，F(xiàn)Y1∶FY2為2∶1時亞硝酸鹽含量最高為4.22 mg/kg；不同乳酸菌添加比例條件下甜米酒酸菜的總酸含量沒有明顯變化，均處于3.02～3.32 g/100 g；甜米酒酸菜感官評分在FY1∶FY2為1∶2時最高，為88.4分，總體變化差異不顯著（P＞0.05）。兩種乳酸菌混合發(fā)酵可以增加酸菜風(fēng)味，乳酸菌添加比例（FY1∶FY2）為1∶2時，甜米酒酸菜的感官評分最高，亞硝酸鹽含量最低，因此，選擇最適乳酸菌添加比例（FY1∶FY2）為1∶2。

2.1.3 發(fā)酵時間對甜米酒酸菜的感官及理化指標(biāo)的影響

將乳酸菌添加量設(shè)定為3%，添加比例（FY1∶FY2）為1∶2，其他條件同2.1.1，自然條件下分別發(fā)酵3 d、6 d、9 d、12 d、15 d，考察不同發(fā)酵時間對甜米酒酸菜品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同發(fā)酵時間對甜米酒酸菜品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of different fermentation time on the quality of pickle with sweet rice wine

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，亞硝酸鹽含量先上升，第6天達到最高，為8.45 mg/kg，隨后顯著下降，9 d后趨于穩(wěn)定；總酸在整個發(fā)酵過程中呈緩慢上升趨勢，從2.37 g/100 g增加至3.88 g/100 g，但總體變化不顯著（P＞0.05）；感官評分隨發(fā)酵時間的延長而上升，從第3天的65.8分顯著上升（P＜0.05）至第9天的88.4分，之后雖然有些許下降但差異不顯著。發(fā)酵至第9天時，亞硝酸鹽含量相對較低，感官評分最高，因此，選擇最適發(fā)酵時間為9 d。

2.1.4 食鹽添加量對甜米酒酸菜感官及理化指標(biāo)的影響

將食鹽添加量分別設(shè)定為0、2%、4%、6%、8%，乳酸菌添加量3%，乳酸菌添加比例（FY1∶FY2）為1∶2，白砂糖添加量6%，甜米酒添加量10%，自然條件下發(fā)酵9 d，考察不同食鹽添加量對甜米酒酸菜品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，發(fā)酵過程中，小部分的鹽可能會轉(zhuǎn)化成為亞硝酸鈉而增加亞硝酸鹽的含量，隨著食鹽添加量的增加，甜米酒酸菜的亞硝酸鹽含量整體呈先上升后下降趨勢，從1.13 mg/kg升至2.02 mg/kg，最后降至1.84 mg/kg，但總體變化無顯著性差異（P＞0.05）；總酸隨著食鹽添加量的增加緩慢增加，從3.07 g/100 g升至3.58 g/100 g，總體變化不顯著（P＞0.05）；感官評分隨食鹽添加量的增加急劇上升后急劇下降，最高達到85.9分；因此，選擇最適食鹽添加量為4%。

圖4 不同食鹽添加量對甜米酒酸菜品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of different salt addition on the quality of pickle with sweet rice wine

2.1.5 白砂糖添加量對甜米酒酸菜感官及理化指標(biāo)的影響

將白砂糖添加量分別設(shè)定為0、2%、4%、6%、8%，乳酸菌添加量3%，乳酸菌添加比例（FY1∶FY2）為1∶2，食鹽添加量4%，甜米酒添加量10%，自然條件下發(fā)酵9 d，考察白砂糖添加量對甜米酒酸菜品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同白砂糖添加量對甜米酒酸菜品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of different sugar addition on the quality of pickle with sweet rice wine

由圖5可看出，甜米酒酸菜中的亞硝酸鹽含量及總酸含量均趨于穩(wěn)定，無顯著性差異（P＞0.05）；感官評分隨白砂糖添加量的增加而顯著上升（P＜0.05），從60.1分上升至88.5分后顯著下降至76.2分（P＜0.05），因此，選擇最適白砂糖添加量為6%。

2.1.6 甜米酒添加量對甜米酒酸菜感官及理化指標(biāo)的影響

將甜米酒添加量分別設(shè)定為0、5%、10%、15%、20%，乳酸菌添加量3%，乳酸菌添加比例（FY1∶FY2）為1∶2，食鹽添加量4%，白砂糖添加量6%，自然條件下發(fā)酵9 d，考察甜米酒添加量對甜米酒酸菜品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可看出，甜米酒酸菜的亞硝酸鹽含量及總酸含量變化無顯著性差異（P＞0.05）；感官評分隨著甜米酒添加量的增加而顯著上升（P＜0.05），從62.3分上升至82.0分后顯著下降至78.6分（P＜0.05），故選取15%為最適添加量。

圖6 不同甜米酒添加量對甜米酒酸菜品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of different sweet rice wine addition on the quality of pickle with sweet rice wine

2.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計

按PB試驗設(shè)計進行試驗，PB試驗設(shè)計與結(jié)果見表4，各因素主效應(yīng)分析試驗結(jié)果如表5所示。

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Design and results of Plackett-Burman experiments

表5 Plackett-Burman試驗的效應(yīng)分析Table 5 Effect analysis of Plackett-Burman experiments

由表4、表5可知，4個因素中重要性最大的3個因素分別是食鹽添加量（B）、甜米酒添加量（D）和白砂糖添加量（C），其中食鹽添加量對感官評分影響極顯著（P＜0.01），甜酒添加量、白砂糖添加量對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。因此，選擇食鹽添加量、白砂糖添加量和甜米酒添加量作為主要影響因素進行進一步的響應(yīng)面分析。

2.3 酸菜最佳配方的篩選

2.3.1 甜米酒酸菜發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

以感官評分（Y）為評價指標(biāo)，選取食鹽添加量（X1）、白砂糖添加量（X2）、甜米酒添加量（X3）3個影響顯著的因素，采用Box-Behnken設(shè)計進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，試驗設(shè)計與結(jié)果見表6，回歸模型的方差分析結(jié)果見表7。

表6 甜米酒酸菜發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of response surface experiments for fermentation technology optimization of pickle with sweet rice wine

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

使用Design-Expert8.0.6進行回歸擬合分析，得到二次回歸擬合方程為：

由表7可知，模型差異極顯著（P＜0.01），失擬不顯著（P＞0.05），說明所得模型擬合度良好。相關(guān)系數(shù)R2=0.986 3，調(diào)整決定系數(shù)R2adj為0.968 6，說明此模型能較準(zhǔn)確且真實地模擬、預(yù)測甜米酒酸菜的發(fā)酵工藝條件。

2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果分析與驗證

食鹽添加量（X1）、白砂糖添加量（X2）、甜米酒添加量（X3）交互作用對甜米酒酸菜感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線如圖7所示。

圖7 食鹽添加量、白砂糖添加量、甜米酒添加量交互作用對甜米酒酸菜感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interactions between salt addition,sugar addition,sweet rice wine addition on sensory evaluation score of pickle with sweet rice wine

由圖7可知，各因素間交互作用的響應(yīng)面均呈拋物面，開口均向下，有極大值點；其中交互作用X1X2、X1X3的等高線呈橢圓形，對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。

通過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計分析，確定甜米酒酸菜的最適宜發(fā)酵工藝為食鹽添加量4.01%，白砂糖添加量6.23%，甜米酒添加量15.55%，感官評分預(yù)測值為91.62分。為便于操作，對優(yōu)化后試驗條件適當(dāng)調(diào)整為食鹽添加量4.0%，白砂糖添加量6.2%，甜米酒添加量15.6%；在此條件下進行驗證試驗，感官評分為92.3分，與預(yù)測結(jié)果相近，具有參考價值。

2.4 甜米酒酸菜質(zhì)量評價

甜米酒酸菜亞硝酸鹽含量為1.34 mg/kg，總酸含量（以乳酸計）為3.23 g/100 g，總砷及無機砷、鉛、糖精鈉、山梨酸、苯甲酸、合成著色劑均未檢測出。細(xì)菌總數(shù)為5.4×105CFU/g，大腸菌群為0 MPN/g，致病菌未檢出。理化及衛(wèi)生指標(biāo)均符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

通過單因素試驗、PB試驗及Box-Behnken設(shè)計，得出甜米酒酸菜發(fā)酵工藝的最優(yōu)條件為食鹽添加量4.0%，白砂糖添加量6.2%，甜米酒添加量15.6%，在室溫條件下發(fā)酵9 d。按照優(yōu)化所得配方制作出的甜米酒酸菜成品感官評分為92.3分；清香味美，解膩開胃，品質(zhì)穩(wěn)定，更便于工業(yè)生產(chǎn)。