1例家族性腺瘤性息肉病家系的遺傳學(xué)分析*

黃 超 閔 寒 張金坤 楊 柳 周春曉 凌 鑫 余 強(qiáng)&

南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蘇州分中心1(215002)南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室2 南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院消化內(nèi)科3蘇州市腫瘤診療中心消化內(nèi)科4 蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科5

家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)是一種常染色體顯性遺傳病，由Bussey[1]首次發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行描述，其主要特征為患者結(jié)直腸存在大量腺瘤性息肉。FAP的全球發(fā)病率為1/7 000～1/10 000，具有遺傳性，息肉多于青少年時(shí)期出現(xiàn)，少數(shù)在幼兒時(shí)期開始生長，嬰兒時(shí)期未見息肉生長[2-3]。根據(jù)患病年齡以及結(jié)直腸內(nèi)的息肉數(shù)目，F(xiàn)AP可分為經(jīng)典型家族性腺瘤性息肉病(classical familial adenomatous polyposis, CFAP)和衰減型家族性腺瘤性息肉病(attenuated familial adenomatous polyposis, AFAP)，CFAP通常發(fā)病較早，息肉數(shù)目一般大于100枚；AFAP通常發(fā)病較晚，息肉數(shù)目少于100枚[4-5]。

隨著基因測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，F(xiàn)AP的發(fā)病機(jī)制越發(fā)明確，可能主要涉及腺瘤性結(jié)腸息肉病(adenomatous polyposis coli, APC)基因突變。據(jù)HGMD數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)，目前已發(fā)現(xiàn)1 400余種APC基因突變，且突變位點(diǎn)與表型輕重具有相關(guān)性[6]。此外，結(jié)直腸腺瘤息肉若不加以干預(yù)，則其惡變導(dǎo)致結(jié)直腸癌的概率接近100%[7]。因此，有長期便血、腹痛等FAP癥狀的患者應(yīng)及早接受結(jié)腸鏡檢查，有助于預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生，顯著改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量[8]。本研究通過采用新一代測(cè)序(NGS)技術(shù)對(duì)1例FAP家系進(jìn)行檢測(cè)分析，旨在探討其發(fā)病原因和機(jī)制。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

先證者沈某，女，23歲，因反復(fù)便血至南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院就診并接受結(jié)腸鏡檢查，詢問家族史并確認(rèn)家系圖(圖1)。先證者(Ⅲ7)父(Ⅱ3)母(Ⅱ4)非近親婚配，先證者與其母親、舅舅(Ⅱ5，結(jié)直腸癌已故)、表兄(Ⅲ8)均有不同程度的結(jié)直腸息肉表型，初步診斷為FAP，考慮行全結(jié)腸切除回腸直腸吻合術(shù)，術(shù)后樣本送病理切片檢查。

圖1 本例FAP患者家系圖

二、樣本采集

經(jīng)先證者及其家系成員同意并簽署知情同意書后，所有研究對(duì)象于清晨就餐后抽取靜脈外周血5 mL，EDTA-K2抗凝。EDTA-K2抗凝管混勻后吸取200 μL外周血，利用QIAamp?DNA Blood Mini Kit(250)(德國QIAGEN公司)提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，Nanodrop2000c分光光度計(jì)檢測(cè)樣本DNA濃度和純度，確保DNA質(zhì)量在合格范圍內(nèi)(1.8

三、目標(biāo)區(qū)域捕獲結(jié)合高通量測(cè)序

委托北京金準(zhǔn)基因科技有限責(zé)任公司進(jìn)行全外顯子測(cè)序。將每個(gè)樣本1.5 μg基因組DNA隨機(jī)打斷為大小為150～250 bp的片段，然后采用KAPA末端修復(fù)酶進(jìn)行DNA修復(fù)，經(jīng)磁珠純化后，DNA 3’端添加腺嘌呤堿基，將接頭連接至DNA片段，行文庫模板擴(kuò)增。DNA文庫構(gòu)建后采用SeqCap法與探針雜交，經(jīng)擴(kuò)增后富集至磁珠上純化并洗脫，最后行Qubit定量。取捕獲后的DNA樣本行Illumina HiSeq2500高通量測(cè)序。數(shù)據(jù)經(jīng)Illumina測(cè)序控制軟件(SCS)評(píng)估合格后，讀取數(shù)據(jù)并行生物信息學(xué)分析。經(jīng)BWA-0.7.12軟件比對(duì)至人類基因組參考序列(GRCh37)上，工具包去除重復(fù)序列，使用基因組分析工具包檢測(cè)單核苷酸變異和插入缺失變異，以ANNOVAR軟件對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行注釋，篩選致病突變。對(duì)可疑致病突變行Sanger測(cè)序驗(yàn)證、家系共分離檢測(cè)。

結(jié) 果

一、先證者內(nèi)鏡檢查和病理學(xué)結(jié)果

先證者接受結(jié)腸鏡檢查以觀察整個(gè)結(jié)直腸，結(jié)果示全結(jié)腸多發(fā)大小不等的息肉共百余枚(圖2)，以圈套電凝切除后送病理檢查，提示腺瘤性息肉為管狀腺瘤，同時(shí)伴有低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，未發(fā)生惡變(圖3)。

圖2 先證者結(jié)腸鏡檢查結(jié)果

二、高通量測(cè)序和Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)先證者結(jié)直腸疾病panel基因各外顯子進(jìn)行測(cè)序，其中目標(biāo)區(qū)覆蓋度99.9%，目標(biāo)區(qū)平均深度112.11，目標(biāo)區(qū)平均深度>20×比例99.2%，經(jīng)分析后未發(fā)現(xiàn)明確與疾病相關(guān)的大片段拷貝數(shù)變異致病的情況。APC基因第15號(hào)外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)一處雜合突變，即c.2800_2803delACTT(p.T934fs)，HGMD數(shù)據(jù)庫檢索此突變位點(diǎn)為已報(bào)道的致病突變，為移碼突變，對(duì)蛋白功能的影響較大。

為進(jìn)一步驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)正向引物：5’-ACG CGG AAT TGG TCT AGG C-3’；反向引物：5’-GGT CGG CTG GGT ATT GAC C-3’，對(duì)先證者及其家系成員行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果顯示有結(jié)直腸息肉表型的家系成員APC基因確實(shí)存在雜合缺失突變c.2800_2803delACTT(p.T934fs)，無結(jié)直腸息肉表型的成員則無此突變，與高通量測(cè)序結(jié)果一致(圖4)。且先證者APC基因的雜合突變來自于其母，其表兄存在相同的突變位點(diǎn)，其父和舅母此位點(diǎn)無突變(表1)。

討 論

FAP是一種極易導(dǎo)致結(jié)直腸惡性腫瘤的疾病，目前其公認(rèn)的致病基因?yàn)锳PC基因。APC基因編碼一種作為Wnt信號(hào)通路拮抗劑的腫瘤抑制蛋白，可參與細(xì)胞遷移、黏附、轉(zhuǎn)錄激活、細(xì)胞凋亡等過程[9]。APC基因定位于染色體5q21～22，全長108 kb，共含15個(gè)外顯子，編碼2 843個(gè)氨基酸殘基，其中15號(hào)外顯子是該基因編碼區(qū)最大的外顯子，全長6 577 bp，亦是人類基因組中最大的外顯子區(qū)域，突變也多發(fā)生于15號(hào)外顯子[10-11]。APC基因突變類型以無義突變和移碼突變?yōu)橹?>95%)，突變可導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)從而形成截?cái)嗟鞍?，破壞蛋白功能和結(jié)構(gòu)的完整性[12]。CFAP患者中APC基因突變檢出率為80%～93%，無義突變、缺失、插入或可變剪接較為多見，大片段缺失和重復(fù)較為少見[13]；與FAP相關(guān)的突變通常聚集于突變簇區(qū)域(MCR)，突變熱點(diǎn)集中于密碼子213(3%)、密碼子1061(7%)、密碼子1068(2%)、密碼子1309(11%)[14-16]。

圖3 先證者腺瘤切除后病理檢查結(jié)果(HE染色，×40)

圖4 FAP家系Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

家系成員高通量測(cè)序結(jié)果Sanger測(cè)序驗(yàn)證Ⅱ3未做無突變Ⅱ4未做APC:c.2800_2803del chr5:112174091 p.T934fs雜合突變Ⅱ6未做無突變Ⅲ7APC:c.2800_2803del chr5:112174091p.T934fs雜合突變APC:c.2800_2803del chr5:112174091p.T934fs雜合突變Ⅲ8未做APC:c.2800_2803del chr5:112174091 p.T934fs雜合突變

本研究采用NGS技術(shù)檢測(cè)1例FAP家系發(fā)現(xiàn)，APC基因存在雜合缺失突變c.2800_2803delACTT(p.T934fs)，該突變可造成15號(hào)外顯子5’端區(qū)域4個(gè)堿基的缺失，導(dǎo)致發(fā)生移碼突變，形成結(jié)構(gòu)異常的功能蛋白。APC蛋白包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)區(qū)域，包括N-末端的七價(jià)重復(fù)區(qū)(密碼子6～57)、犰狳重復(fù)區(qū)(密碼子453～767)、3個(gè)15-氨基酸重復(fù)區(qū)(密碼子1020～1169)、7個(gè)20-氨基酸重復(fù)區(qū)(密碼子 1262～2033)、SAMP重復(fù)區(qū)、兩個(gè)核定位信號(hào)區(qū)(密碼子1767～1772和密碼子2048～2053)、堿性區(qū)(密碼子2200～2400)、EB1區(qū)(密碼子2560～2843)和DLG區(qū)域[17-20]。本研究中家系A(chǔ)PC基因突變位點(diǎn)導(dǎo)致EB1蛋白功能區(qū)域發(fā)生變化并可能累及DLG區(qū)域。EB1區(qū)是EB1與MDia形成復(fù)合物的區(qū)域，有利于微管穩(wěn)定性并促進(jìn)細(xì)胞遷移；DLG區(qū)域可阻斷G0/G1期至S期的細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖過程，故DLG區(qū)域在控制細(xì)胞周期信號(hào)和細(xì)胞增殖中起有重要作用。由此可見，該家系中所涉及的APC基因突變位點(diǎn)與細(xì)胞增殖過程密切相關(guān)，該突變引起的APC蛋白變化會(huì)影響β-catenin的降解功能，使其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)過多堆積，并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而激活Wnt通路下游靶基因，促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂增殖從而造成較為嚴(yán)重的FAP臨床癥狀，家族成員中結(jié)直腸腺瘤發(fā)生癌變的概率也會(huì)增大。

目前臨床主要根據(jù)腺瘤病理檢查結(jié)果和內(nèi)鏡下結(jié)直腸息肉數(shù)目來診斷FAP，但某些消化道息肉疾病如Peutz-Jegher綜合征、Lynch綜合征、MYH相關(guān)性息肉病、遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌、幼年性息肉綜合征等[21]與FAP難以區(qū)別，給臨床診斷帶來了一定的困難，因此依靠基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分子診斷，可輔助臨床及早準(zhǔn)確地進(jìn)行診斷和治療。

基于Illumina平臺(tái)的NGS方法是一種與經(jīng)典的Sanger鏈終止法截然不同的測(cè)序方法。其以高通量并行的模式，實(shí)現(xiàn)了邊合成邊測(cè)序的測(cè)序技術(shù)，當(dāng)DNA鏈復(fù)制時(shí)即可追蹤標(biāo)記寡核苷酸的添加。因此，NGS可產(chǎn)生大量DNA序列數(shù)據(jù)，與Sanger測(cè)序相比，NGS技術(shù)的數(shù)據(jù)更豐富、更完整，且Sanger測(cè)序需設(shè)計(jì)特定引物，材料重復(fù)利用率低，測(cè)序模板質(zhì)量要求高，極大增加了成本[22]?；诿?xì)管電泳的Sanger測(cè)序已用于人類基因組計(jì)劃，NGS技術(shù)使大規(guī)模全基因組測(cè)序變得切實(shí)可行。本研究利用NGS技術(shù)對(duì)FAP家系行全外顯子組檢測(cè)分析，耗時(shí)短、成本低、數(shù)據(jù)量足，檢測(cè)結(jié)果經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證可靠。此外，先證者APC基因外顯子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)多處同義突變和錯(cuò)義突變(p.T1475T、p.G1660G、p.S1738S、p.V1804D、p.P1942P)，與數(shù)據(jù)庫對(duì)比發(fā)現(xiàn)，這些位點(diǎn)均為多態(tài)性位點(diǎn)。

在臨床診治過程中，許多FAP患者青春期即出現(xiàn)反復(fù)便血、腹瀉等癥狀，但多未引起重視而延誤治療。本研究中，先證者就診時(shí)結(jié)直腸已存在大量息肉樣腺瘤，必須接受手術(shù)治療。詢問家族史時(shí)發(fā)現(xiàn)，其家族中也有類似表型的患者，但由于年代和技術(shù)限制，并未引起重視。因此，當(dāng)家族成員中有相似表型時(shí)，應(yīng)考慮遺傳病的可能，及時(shí)行結(jié)腸鏡檢查，并結(jié)合基因檢測(cè)，對(duì)于攜帶突變而尚無臨床表型的家庭成員及早進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以預(yù)防結(jié)直腸癌變，對(duì)于未攜帶突變的成員可按正常人群進(jìn)行篩查。

綜上所述，隨著FAP臨床表型與APC基因相關(guān)性認(rèn)識(shí)的深入研究和進(jìn)展，臨床工作者可利用更先進(jìn)的遺傳篩查技術(shù)更早、更準(zhǔn)確地對(duì)患者進(jìn)行診斷和治療，基因檢測(cè)結(jié)果與臨床決策可相輔相成。