血紅鉚釘菇子實(shí)體化學(xué)成分GC-MS分析及石油醚萃取物抗腫瘤活性組分篩選

都君 張紅 陳屏

摘要：為了分析血紅鉚釘菇子實(shí)體的化學(xué)成分并對其石油醚萃取物進(jìn)行抗腫瘤活性篩選。試驗(yàn)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS），通過硅膠柱層析對石油醚萃取物進(jìn)行組分分離，采用CCK-8法測定各組分對人肺癌細(xì)胞（NCI-H460）和人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）的增殖抑制作用。結(jié)果表明，從血紅鉚釘菇子實(shí)體中共鑒定出60個(gè)化合物，占提取物總量的96.074%。主要以烷烴類、醛酮類、酯類、脂肪酸類為主，分別占13.503%、17.317%、17.777%、25.738%。石油醚萃取物經(jīng)硅膠柱層析分離共得8個(gè)組分（A、B、C、D、E、F、G、H），其中組分（A、B、C、H）對人肺癌細(xì)胞（NCI-H460）有增殖抑制作用，組分（A、B、C、F、H）對人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）有增殖抑制作用，并均呈濃度依賴性。組分（A、B、C、H）對人肺癌細(xì)胞（NCI-H460）的IC50分別為790.46、842.05、876.12、1 479.55 μg/mL，組分（A、B、C、F、H）對人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）的IC50分別為619.29、465.45、1 137.88、1 096.11、754.48 μg/mL。說明通過對血紅鉚釘菇子實(shí)體GC-MS分析及抗腫瘤活性篩選，石油醚萃取物組分（A、B、C、F、H）具有一定的抗腫瘤活性，可能含有抗腫瘤活性的單體化合物。

關(guān)鍵詞：血紅鉚釘菇;氣相色譜-質(zhì)譜;細(xì)胞增殖;脂肪酸;硅膠柱色譜;癌細(xì)胞

中圖分類號： O657.63? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0197-04

血紅鉚釘菇[Chroogomphus rutilus （Schaeff.） O. K. Mill.]屬擔(dān)子菌亞門牛肝菌目鉚釘菇科（Gomphidiaceae）鉚釘菇屬（Chroogomphus），分布于中國（吉林、黑龍江、遼寧、河北、山西、云南、四川、西藏、廣東、湖南等地區(qū)）、日本、歐洲及北美等地[1]，主要生長于北溫帶[2]。其子實(shí)體呈鉚釘狀且菌肉為酒紅色，故名血紅鉚釘菇。在我國東北地區(qū)俗稱松樹傘、松蘑、紅蘑、松樹釘、肉蘑、雞血蘑[3]，其營養(yǎng)價(jià)值極高，深受人們喜愛，是現(xiàn)今仍不能人工馴養(yǎng)的野生食用菌珍品[4]。此外，血紅鉚釘菇具有很好的藥理活性，具有神經(jīng)元保護(hù)作用，抗氧化、抗病原菌作用，促生長等功效，還具有降血糖和抗癌等作用[5-6]。因此，血紅鉚釘菇具有很大的開發(fā)價(jià)值。本試驗(yàn)通過氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對血紅鉚釘菇化學(xué)成分進(jìn)行分析研究及抗腫瘤活性的篩選，為血紅鉚釘菇的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗(yàn)于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部食藥用菌工程研究中心（2015年12月至2017年12月）進(jìn)行。血紅鉚釘菇干品由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院包海鷹教授鑒定。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-5210（上海亞榮生化儀器廠），循環(huán)水式多用真空泵S-B95A（湖南省鞏義市英峪儀器廠）、電子天平AL-104[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、恒溫水浴鍋HH4（金壇市江南儀器廠）、CO2培養(yǎng)箱 BPN-80CH型（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、680型酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀（美國Bio Rad公司）、離心機(jī)TD4ZWS（上海安亭科學(xué)儀器制造廠）、XD-101型倒置顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司）。

細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性試劑盒CCK-8（廣州貝博生物科技有限公司）、0.25%胰蛋白酶（上海索萊寶生物科技有限公司）、乙醇和石油醚（分析級，北京化工廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件 （1）氣相色譜條件。色譜柱：DB-5型石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 nm）;升溫程序：起始溫度8 ℃，升溫速率1 ℃/min，升溫至15 ℃，升溫速率至3 ℃/min，升溫達(dá)到250 ℃，升溫速率達(dá)到 10 ℃/min，待溫度升高到280 ℃時(shí)持續(xù)5 min;氮?dú)饬魉贋?.0 mL/min;分流比為50 ∶ 1。（2）質(zhì)譜條件。質(zhì)量掃描范圍：質(zhì)荷比20～880;電子轟擊離子源;電子能為70 eV;電壓為 0.75 kV;電子源溫度為2 ℃。

1.2.2 CCK-8法抗腫瘤活性組分篩選 （1）樣品制備 血紅鉚釘菇干品粉碎，95%乙醇按1 ∶ 4（體積分?jǐn)?shù)）量回流提取2次，每次3 h，合并提取液，減壓濃縮得乙醇浸膏。乙醇浸膏揮干后加蒸餾水混懸，加入石油醚按1 ∶ 1（體積分?jǐn)?shù)）量萃取，石油醚萃取物減壓濃縮得石油醚浸膏。將石油醚浸膏用丙酮溶解，與硅膠（100～200目）按1 ∶ 2伴樣，干法上硅膠柱（73 mm×305 mm），流動相為石油醚-乙酸乙酯[A（9 ∶ 1）、B（8 ∶ 2）、C（7 ∶ 3）]，四氯甲烷-甲醇[D（10 ∶ 0）、E（9 ∶ 1）、F（8 ∶ 2）、G（7 ∶ 3）、H（0 ∶ 10）]，合并相同比例組分，減壓濃縮，共得8個(gè)組分（A、B、C、D、E、F、G、H）。（2）抗腫瘤活性篩選 采用CCK-8法，以人肺癌細(xì)胞（NCI-H460）和人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）為受試對象。取2種細(xì)胞的對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)，分別配成細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加細(xì)胞懸液100 μL（細(xì)胞密度分別為 6.00×103、3.25×104個(gè)/mL），置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后試驗(yàn)組分別加入配制好的8個(gè)組分（A、B、C、D、E、F、G、H）10 μL，濃度梯度分別為400.000 0、200.000 0、100.000 0、50.000 0、25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5 μg/mL。每個(gè)梯度設(shè)6個(gè)重復(fù)?？瞻捉M為100 μL培養(yǎng)液，對照組為100 μL細(xì)胞。置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑盒，培養(yǎng)3 h后，用海標(biāo)儀在 450 nm 波長下測定D值。抑制率計(jì)算公式為抑制率=1-[（實(shí)驗(yàn)組-空白組）/（對照組-空白組）]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 血紅鉚釘菇子實(shí)體GC-MS分析結(jié)果

對血紅鉚釘菇子實(shí)體進(jìn)行GC-MS分析，其總離子流圖如圖1所示，通過NIST庫進(jìn)行自動檢索與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖進(jìn)行對比分析，并結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律確定其化學(xué)成分。從血紅鉚釘菇子實(shí)體中分析出60個(gè)化合物（表1），且以烴類，醛酮類、酯類、脂肪酸類為主，分別占13.503%、17.317%、17.777%、25.738%，占檢識出總量74.335%。血紅鉚釘菇子實(shí)體中以脂肪酸為主要成分，含量較多的是正戊酸（11.236%）、十六烷酸（4.020%）、十四烷酸（2.055%）、十五烷酸（1.388%）。

2.2 抗腫瘤活性組分篩選

2.2.1 血紅鉚釘菇石油醚萃取物各組分對人肺癌細(xì)胞（NCI-H460）增殖的抑制作用 由表2可知，血紅鉚釘菇石油醚萃取物8個(gè)組分中，組分A、B、C、H對人肺癌細(xì)胞 NCI-H460 的增殖具有明顯的抑制作用，在濃度 400 μg/mL 時(shí)抑制率最大，分別為38.99%、31.52%、29.72%、23.37%。且組分A、B、C、H的抑制率隨劑量的增加而提高，具有良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。通過SPSS計(jì)算其IC50分別為790.46、84205、876.12、1 479.55 μg/mL。而組分D、E、F、G沒有明顯的增殖抑制作用。

2.2.2 血紅鉚釘菇石油醚萃取物各組分對人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）增殖的抑制作用 由表3可知，血紅鉚釘菇石油醚萃取物8個(gè)組分中，組分A、B、H對人胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖具有明顯的抑制作用，在濃度為 400 μg/mL 時(shí)，抑制率最大，分別為43.27%、47.74%、41.22%。組份C、F也具有一定的增殖抑制作用，在濃度為400 μg/mL時(shí)，抑制率分別為29.19%、33.49%。且組份A、B、C、F、H的增殖抑制作用均隨劑量的增加而提高，具有良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。通過SPSS計(jì)算其IC50分別為619.29、465.45、1 137.88、1 096.11、754.48 μg/mL，而組份D、E、G并沒有明顯的抑制作用。

3 討論

本試驗(yàn)通過GC-MS分析了血紅鉚釘菇子實(shí)體中的揮發(fā)性成分，共鑒定出60個(gè)化合物，以烷烴類、醛酮類、酯類、脂肪酸類為主，分別占13.503%、17.317%、17.777%、25.738%，占檢識出總量74.335%。其主要成分為正十七烷（2.594%）、甲基庚烯酮（2.835%）、硬酯酸異丁酯（7.563%）、正戊酸（11.236%）、十六烷酸（2.844%）。有研究表明脂肪酸具有抗炎、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗氧化等作用[7]。血紅鉚釘菇具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、促生長、神經(jīng)元保護(hù)等多種藥理活性，而這些生物活性與其具有豐富的脂肪酸類化合物可能有著一定的聯(lián)系[8-12]。

采用硅膠柱層析對血紅鉚釘菇石油醚提取物進(jìn)行分離，得到8個(gè)組分。通過CCK-8法測定各組分對人肺癌細(xì)胞（NCI-H460）和人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）的增殖抑制作用，其中組分A（石油醚 ∶ 乙酸乙酯=9 ∶ 1）、B（石油醚 ∶ 乙酸乙酯=8 ∶ 2）、C（石油醚 ∶ 乙酸乙酯=7 ∶ 3） 、H（四氯甲烷 ∶ 甲醇=0 ∶ 1）對2種腫瘤細(xì)胞均具有比較明顯的增殖抑制作用，組分F（四氯甲烷 ∶ 甲醇=8 ∶ 2）對人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）具有一定的增殖抑制作用，而對人肺癌細(xì)胞（NCI-H460）無明顯效果。組分D（四氯甲烷 ∶ 甲醇=1 ∶ 0）、E（四氯甲烷 ∶ 甲醇=9 ∶ 1）、G（四氯甲烷 ∶ 甲醇=7 ∶ 3）對2種細(xì)胞均無明顯抑制效果?？梢哉f明組分A、B、C、F、H為抗腫瘤活性組分，可能含有抗腫瘤活性的單體化合物，有待進(jìn)一步開發(fā)研究。

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