多花黑麥草對磷脅迫的響應(yīng)及耐磷指標的篩選

徐彥紅 李斌 席溢 許鐘丹 左意才

摘要：對不同供磷水平下多花黑麥草（Lolium multiflorum）生長初期生長特性的變化進行分析，篩選耐磷指標，為多花黑麥草耐磷機制的研究和生產(chǎn)實踐提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。利用主成分分析和模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)分析6個不同供磷水平（0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/kg）對多花黑麥草生長特性的影響并進行綜合評價;用株高、葉寬、葉綠素a含量等8個指標的耐磷系數(shù)和綜合評價值（D）進行灰色關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，隨著磷水平的增加，株高、葉寬、葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量、脯氨酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，丙二醛含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢;多花黑麥草最適生長的磷水平為10.0 mg/kg;與耐磷性最相關(guān)的指標為超氧化物歧化酶活性、脯氨酸含量、株高、葉綠素a含量。

關(guān)鍵詞：多花黑麥草;磷脅迫;主成分分析;隸屬函數(shù);灰色關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號： Q945.78;S543+.601? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0176-05

多花黑麥草（Lolium multiflorum）為一年生（越年生）禾本科牧草，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)高、適于飼喂等優(yōu)點。大力發(fā)展多花黑麥草種植，能有效緩解人畜爭糧問題，促進節(jié)糧型畜牧業(yè)發(fā)展，并能發(fā)揮其生態(tài)功能。磷是植物生長的必需營養(yǎng)元素，同時也是土壤中普遍缺乏的元素。喀斯特地區(qū)土壤瘠薄，保水保肥能力差，且貴州省氣候溫暖，雨量充沛[1]，是極易造成營養(yǎng)元素淋溶流失的地區(qū)之一。因此，探討磷素對多花黑麥草生長特性的影響，確定其適宜種植的磷水平、篩選其耐磷指標對指導(dǎo)多花黑麥草生產(chǎn)種植和研究多花黑麥草耐磷機制有重要意義。

植物各生長指標對營養(yǎng)元素的響應(yīng)差異較大，僅用單項指標來反映植物對某一營養(yǎng)元素的響應(yīng)效果局限性較大。因此，探討元素對植物的處理效果，應(yīng)用盡可能多的指標來綜合評定，從而可以減少單項指標對處理效果評價所造成的片面性。此外，目前關(guān)于植物耐磷指標篩選的研究較少[2]，多集中于抗旱、耐鹽等指標的篩選[3-7]，關(guān)于多花黑麥草耐磷指標篩選的研究也較少。因此，設(shè)置不同的供磷水平，研究其對多花黑麥草形態(tài)和生理指標的影響，利用主成分分析和模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對各指標進行綜合評價，旨在確定多花黑麥草適合生長的磷水平，為多花黑麥草的種植提供理論依據(jù);用灰色關(guān)聯(lián)分析法對株高、葉寬、葉綠素a含量等8個指標進行排序，旨在為耐磷指標的篩選提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2017年3月開始，在貴州大學(xué)南校區(qū)校內(nèi)進行。

1.2 試驗設(shè)計

以多花黑麥草安格斯1號為材料，采用砂培法進行種植。

石英砂用水浸泡，除去黏土和有機質(zhì)，至洗滌的水呈無色透明為止;再用3%鹽酸浸泡7 d;然后用霍格蘭營養(yǎng)液浸泡，每天2次，至pH值穩(wěn)定為止。將處理好的石英砂裝入直徑29.5 cm、深21.5 cm的花盆中，每盆裝9.0 kg。

挑選均勻飽滿的黑麥草種子，將其置于2% H2O2溶液中浸泡10 min進行消毒，再用蒸餾水沖洗6遍，晾干備用，將處理后的種子置床培養(yǎng)。待種子發(fā)芽，苗長7 cm以上時，選擇高度近似、生長情況相近的幼苗移栽花盆中，移栽深度為 2 cm。為確保植株有足夠的養(yǎng)分，每周定期為植株澆灌霍格蘭營養(yǎng)液。

共設(shè)置6個磷水平（0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/kg），分別用CK、P2.5、P5.0、P10.0、P25.0、P50.0表示，磷源為NaH2PO4，試驗開始時溶解在水中，施入石英砂中。每個磷水平有3盆重復(fù)，每盆定苗3株黑麥草。

1.3 指標測定

從3月31號開始，每周測量1次株高和最寬葉寬，直到4月底結(jié)束。收割多花黑麥草，測定其他生理指標。

光合色素的測定參照高俊鳳的方法[8];丙二醛（MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法;脯氨酸（Pro）含量的測定采用酸性茚三酮法[9];超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用氮藍四唑（NBT）光化還原法[10]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)所得數(shù)據(jù)，求各指標的相對值，具體見公式（1）。加權(quán)隸屬函數(shù)相關(guān)公式見式（2）～式（5）。

各指標相對值（X）=磷處理各指標測定值對照各指標測定值;

利用Excel 13.0軟件整理數(shù)據(jù)和繪制圖像，SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷水平處理對多花黑麥草形態(tài)的影響

株高和葉寬是反映禾本科植物生物性狀的重要指標。由表1可知，在3月31日、4月21日和4月28日時，各磷水平處理對株高的影響沒有顯著性差異;隨著磷水平的增加，株高整體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢;在4月21日時，磷水平為5、10 mg/kg時，株高相對較高;同一磷水平處理，生長后期株高顯著高于生長前期（P<0.05），如P50.0處理在4月28日、4月21日所測株高顯著高于4月14日、4月7日和3月31日。

由表2可知，不同磷水平處理在同一時間和同一磷水平處理在不同時間對葉寬的影響差異都顯著?？傮w來說，磷水平5、10 mg/kg對葉寬的促進作用最顯著。

2.2 不同磷水平處理對多花黑麥草生理特性的影響

從圖1可知，磷水平為2.5 mg/kg，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均為最高，顯著高于對照及其他處理，與其他處理間存在顯著性差異（P<0.05）;隨著磷水平的增加，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量整體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。

從圖2可知，磷水平為50.0 mg/kg時，丙二醛含量與對照組相比沒有顯著性差異（P>0.05），但顯著高于其他處理。

由圖3可知，磷水平為5.0 mg/kg時，脯氨酸含量最高，與磷水平為10.0 mg/kg時相比沒有顯著性差異（P>0.05），但均高于其他處理。在磷水平為<5.0 mg/kg時，脯氨酸含量呈現(xiàn)上升的趨勢。

從圖4可知，磷水平為25.0 mg/kg時，超氧化物歧化酶活性最大，顯著大于磷水平為2.5、50.0 mg/kg時的活性（P<0.05）。當磷水平為5.0～25.0 mg/kg時，隨著磷水平的增加，超氧化物歧化酶活性增強。

2.3 不同磷水平處理對多花黑麥草生長特性的綜合評價

不同磷水平處理對多花黑麥草8個評價指標（株高、葉寬、葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性，其相對值分別用X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8表示）的影響存在不一致性（表3），僅利用單一指標評價不同磷水平處理對多花黑麥草的影響存在片面性。因此，通過對所有評價指標進行系統(tǒng)分析，篩選出最合適的綜合指標是十分必要的。對8個評價指標進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，有些評價指標間相關(guān)性顯著或極顯著（表4），如X5與X3之間相關(guān)性極顯著（r=0.978，P<0.01），可認為X5與X3的耐磷性共同信息量為97.8%，且其余具有相關(guān)性的評價指標間也存在信息重疊現(xiàn)象。因此，篩選出既能有效代表所有單項評價指標，又彼此獨立且沒有信息重疊的綜合指標來評價多花黑麥草對磷的脅迫響應(yīng)是十分必要的。

對8個評價指標進行主成分分析，結(jié)果如表5所示。根據(jù)特征值大于1及累積貢獻率大于85%的原則，選取前2個主成分作為綜合指標，可有效反映8個評價指標87.332%的信息。在第1主成分（PC1）中，X1、X2、X3、X5、X7、X8指標的構(gòu)成載荷較大;在第2主成分（PC2）中，X4、X6指標的構(gòu)成載荷較大?？梢娚鲜鲨b定指標與多花黑麥草的耐磷性存在一定關(guān)系。利用2個綜合指標的特征向量建立綜合指標與原單項指標的線性組合方程，見式（9）～式（10）。

根據(jù)各指標的相對值（表3）和綜合指標的線性組合方程，得到綜合指標的值，根據(jù)式（2）～式（5）計算多花黑麥草2個綜合指標的隸屬函數(shù)值U（Zj）、權(quán)重和綜合評價值（D），結(jié)果見表6。根據(jù)D的大小，評價不同磷水平對多花黑麥草的影響效果為P10.0>P5.0>P2.5>P50.0>P25.0。在磷水平為10.0 mg/kg時，隸屬函數(shù)值最高，從前面的分析中也可以看出，除了丙二醛含量較低外，其余各項指標均比較適宜，綜合考慮多花黑麥草最適宜種植的磷水平為10.0 mg/kg。

2.4 多花黑麥草生長初期耐磷指標的篩選

按灰色系統(tǒng)理論要求，將D和8個指標視為一個整體。數(shù)據(jù)進行標準化處理，根據(jù)關(guān)聯(lián)分析四公理[11]，計算各指標與D的關(guān)聯(lián)系數(shù)，然后分別求出各指標與D的關(guān)聯(lián)度，并按關(guān)聯(lián)度大小排列出關(guān)聯(lián)序。

以D為參考數(shù)據(jù)列X0=（0.046，0.305，0.363，0.000，0.041），株高等8項指標為比較數(shù)列（子序列），記為Xi（i=1，2，3…，8），X1=（0.99，1.13，1.10，1.04，1.01）、X2=（102，1.57，1.64，1.38，1.45）、…、X8=（1.48，2.72，2.66，1.51，2.16）。使用式（5）對數(shù)據(jù)進行標準化處理[12]，使用式（6）～式（7）計算關(guān)聯(lián)系數(shù)、關(guān)聯(lián)度，如表7所示。

關(guān)聯(lián)度的大小表示某一項指標對磷的耐受強度。根據(jù)表7的結(jié)果，各項指標對磷的耐受強度排序為超氧化物歧化酶活性>脯氨酸含量>株高>葉綠素a含量>葉寬>丙二醛含量>類胡蘿卜素含量>葉綠素b含量。

3 討論

3.1 不同磷水平處理對多花黑麥草生長的影響

磷是植物生長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)元素之一，不僅是植物體內(nèi)許多重要化合物的組分，而且還以多種途徑參與植物代謝[13]。植物細胞抵抗逆境損傷的重要保護酶系統(tǒng)如SOD和過氧化物酶（POD）等是植物體內(nèi)活性氧的清道夫，在清除植株體內(nèi)多余的活性氧、避免細胞受到氧損傷等過程中發(fā)揮著巨大的作用[14]。不同的磷水平處理對植物的生長指標和生理指標有較大的差異，隨著磷水平的增加，株高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與董秋平等的研究結(jié)果[14]有相似性。本研究中隨著磷水平的增加，多花黑麥草的葉綠素含量下降，該結(jié)果與前人對類蘆、玉米和桉樹的研究結(jié)果[12，15-16]不一致。與之相反，陳秀鈴研究發(fā)現(xiàn)，鄧恩桉葉片葉綠素含量在低磷肋迫下顯著增加[17]，與本研究結(jié)果一致，這說明不同的植物對磷處理的應(yīng)答具有一定的差異，植物可通過自身調(diào)節(jié)葉綠素含量來適應(yīng)。此外，本研究中，隨著磷水平的增加，葉綠素a、葉綠素b、脯氨酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，該結(jié)果與余姣妲等對杉木的研究結(jié)果[18]有相似之處，也有所差別，這表明在磷脅迫下，不同植物的適應(yīng)機制有差異性。

3.2 不同磷水平處理對多花黑麥草影響的綜合評價及耐磷指標的篩選

關(guān)于植物耐磷的形態(tài)及生理指標有很多，筆者選取8個指標用于多花黑麥草對不同磷水平處理效果響應(yīng)的評價。通過主成分分析可將8個原始的單項指標轉(zhuǎn)換成2個新的相對獨立的綜合指標，進一步對2個新的綜合指標利用隸屬函數(shù)分析法得到耐磷綜合評價值，避免了利用單個性狀指標描述多花黑麥草對磷響應(yīng)的局限性。張加強等運用灰色關(guān)聯(lián)分析篩選出亞麻芽期的耐鎘鑒定指標[19];蘇德偉等運用灰色關(guān)聯(lián)分析得出葉片相對含水量、葉綠素含量、丙二醛含量、可溶性多糖含量與抗旱指數(shù)的關(guān)聯(lián)度較大[20];崔博文等運用灰色關(guān)聯(lián)分析得出類胡蘿卜素質(zhì)量分數(shù)、根系活力、丙二醛質(zhì)量分數(shù)和游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)與馬尾松耐低磷性關(guān)系密切[21]，此法在數(shù)據(jù)分析上已得到廣泛應(yīng)用[22-24]。本試驗在主成分分析和隸屬函數(shù)分析的基礎(chǔ)上，利用這8個與耐磷性密切相關(guān)的形態(tài)及生理指標與耐磷綜合評價值進行灰色關(guān)聯(lián)分析，篩選出超氧化物歧化酶活性、脯氨酸含量、株高、葉綠素a含量與綜合評價值的關(guān)聯(lián)度最大，可作為反映多花黑麥草對磷響應(yīng)效果的分析指標。由于本試驗僅涉及1個多花黑麥草品種對磷的生理響應(yīng)的研究，篩選出的耐磷指標存在一定的局限性，因此，還需進一步研究不同品種多花黑麥草對磷的生理響應(yīng)，從而篩選出更具有代表性的耐磷指標。

4 結(jié)論

在一定的磷水平范圍內(nèi)，磷水平的增加對多花黑麥草的生長有促進作用，多花黑麥草各指標對磷的耐受水平也不同。通過主成分分析和隸屬函數(shù)法對多花黑麥草8個鑒定指標的耐磷系數(shù)進行綜合評價得出，磷水平10.0 mg/kg時最適宜多花黑麥草生長;灰色關(guān)聯(lián)相關(guān)分析結(jié)果表明，在綜合評價值和各耐磷指標的關(guān)聯(lián)度中，超氧化物歧化酶活性、脯氨酸含量、株高、葉綠素a含量與綜合評價值的關(guān)聯(lián)度較大，可作為多花黑麥草耐磷評價指標。

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