苦蕎麥種子與幼苗對疊氮化鈉誘變的響應(yīng)

劉建霞 張夢麗 李慧 溫日宇

摘要：用疊氮化鈉對苦蕎麥種子進行誘變，確定疊氮化鈉的最佳誘變劑量和時間，檢測誘變后幼苗的生理指標(biāo)。以晉蕎2號種子為材料，用不同濃度梯度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 mmol/L）的疊氮化鈉分別處理4、8、12 h，探討苦蕎麥種子的發(fā)芽率和相對發(fā)芽率。同時，對幼苗的丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）及過氧化物酶（POD）的活性進行檢測。結(jié)果表明，疊氮化鈉的濃度為0.8 mmol/L、誘變時間為8 h時，苦蕎麥種子發(fā)芽率為49%，相對發(fā)芽率為51.04%，接近半致死濃度。疊氮化鈉在低濃度時，苦蕎麥葉片的SOD、POD活性均升高，高濃度時，活性則有所下降。當(dāng)疊氮化鈉濃度為0.6 mmol/L時，SOD活性達到最大值，當(dāng)疊氮化鈉濃度為0.8 mmol/L時，POD活性達到最大值。綜合分析可知，疊氮化鈉濃度為0.8 mmol/L、處理時間為8 h為最佳誘變組合。

關(guān)鍵詞：疊氮化鈉;誘變;苦蕎麥

中圖分類號： Q945.34;S517.01? 文獻標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0085-03

苦蕎麥[Fagopyrum tataricum （L.） Gaertn]屬蓼科蕎麥屬雙子葉植物，又稱萬年蕎、野南蕎等[1]，種子外形較長，為三棱形，頭部棱角明顯、尖銳，底部較圓，外表光滑，為灰黑色或黑褐色，沒有光澤[2]?？嗍w麥的生長適應(yīng)性強，具有耐干旱、耐寒冷、耐酸堿、耐貧瘠以及生育期短的特點，主要分布在西南山區(qū)、云貴高原、陜西、山西等地，是我國傳統(tǒng)的小雜糧之一[3]?？嗍w麥的營養(yǎng)價值十分豐富，蛋白質(zhì)、維生素、微量元素的含量均比其他作物高，開發(fā)前景非常廣闊[4];此外，苦蕎麥還具有較高的藥用價值，可以治療胃痛、消化不良、腰腿疼痛、跌打損傷，《本草綱目》中記載：苦蕎麥的性味苦、平、寒，具有益氣力、續(xù)精神、利耳目、寬腸健胃的作用[5]。臨床研究表明，苦蕎麥能夠降低血糖血脂，能有效地預(yù)防和治療糖尿病。

目前對蕎麥研究最多的是蘇聯(lián)，其次是日本、波蘭、南斯拉夫及加拿大[6]。我國蕎麥品種多，資源豐富，但是蕎麥科研起步比較晚，育種技術(shù)也比其他作物落后，蕎麥不僅產(chǎn)量低而且很不穩(wěn)定，品種多而亂，退化嚴重，影響了我國蕎麥在國際市場的競爭力[7]。隨著人們對苦蕎麥營養(yǎng)、保健及藥用價值研究的深入，對苦蕎麥開發(fā)利用力度加大，苦蕎麥也漸漸被人們接受，市場上對苦蕎麥的需求量也不斷加大，因此，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強、適應(yīng)性廣、符合人們要求的苦蕎麥新品種迫在眉睫[8]。

疊氮化鈉（NaN3）是一種常見的化學(xué)誘變劑，具有使用效率高、毒性小、價格低廉、容易獲得、對M1的生理損傷小等優(yōu)點[9]。其等電點pH值為4.18，當(dāng)用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值為3，現(xiàn)用現(xiàn)配）溶解疊氮化鈉時，NaN3在溶液中主要產(chǎn)生HN3分子，表現(xiàn)為中性，細胞膜不能將其截留，可以透過細胞膜進入細胞質(zhì)中，按照堿基替換的方式來影響DNA的正常合成，導(dǎo)致點突變的產(chǎn)生[9]，從而導(dǎo)致基因發(fā)生突變，獲得新的變異品種。目前利用疊氮化鈉進行誘變育種的研究較多，在大豆[10]、大麥[11]、小麥[12]等作物上均有應(yīng)用，而在苦蕎麥誘變育種方面的研究較少，因此，本研究以苦蕎麥種子為材料，利用不同濃度疊氮化鈉對其進行誘變研究，探究種子發(fā)芽率及幼苗生理指標(biāo)的變化，找出疊氮化鈉半致死濃度，獲得最佳誘變濃度與誘變時間組合，以此對苦蕎麥進行快速的遺傳改良，為獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的苦蕎麥新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2017年3月在山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細胞工程實驗室進行。材料為山西當(dāng)?shù)乜嗍w麥品種晉蕎2號，來源于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所。

1.2 方法

（1）將種子倒入有水的塑膠盆中洗滌數(shù)遍，以除去種子表面的灰塵，同時除去水面上漂浮的劣質(zhì)種子以及草籽等，然后從中選取顆粒飽滿的苦蕎麥種子約6 000粒，將其放入大燒杯中，加入清水在室溫下浸泡約14 h[13]。然后進行種子消毒處理，具體方法如下：在無菌條件下，用75%乙醇浸泡 30 s，然后置于0.1%氯化汞溶液中處理12 min，最后用無菌水漂洗 5～6次，待用[14];將處理好的種子放入20個錐形瓶中，每個錐形瓶100粒，分別用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 mmol/L 疊氮化鈉處理4、8、12 h，每個錐形瓶中加入 20 mL 誘變劑，以磷酸緩沖液（pH值為3）處理為對照（CK），然后以同樣的方法將每個誘變處理做2組重復(fù)，以保證試驗結(jié)果的可靠性[13]。為了去除種子上殘留的疊氮化鈉溶液，需要用硫代硫酸鈉作終止劑對其進行終止誘變處理，具體方法如下：將錐形瓶中的疊氮化鈉誘變劑倒入1個固定容器中，然后加入10 mL 0.1 mol/L Na2S2O3·5H2O洗滌15 min，再用清水對其沖洗5 min[13];處理完成后，將種子轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，皿內(nèi)要鋪上2層濾紙以保持濕潤，然后將其放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，定期觀察并統(tǒng)計發(fā)芽的種子數(shù)[15]，調(diào)查7 d時的發(fā)芽率。

（2）丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性的測定參考《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 23對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 疊氮化鈉處理對苦蕎麥發(fā)芽率、相對發(fā)芽率的影響

由表1可知，疊氮化鈉同一處理時間內(nèi)隨著處理濃度的增大，各組之間發(fā)芽率和相對發(fā)芽率均存在顯著差異（P<0.05）。處理時間為4 h時，對照和0.2 mmol/L之間發(fā)芽率差異未達到極顯著水平，0.6 mmol/L和0.8 mmol/L之間發(fā)芽率差異未達到極顯著水平，其余各組之間發(fā)芽率均存在極顯著差異（P<0.01）;除對照和0.2 mmol/L外，其余各組之間相對發(fā)芽率均存在極顯著差異（P<0.01）。處理時間為 8 h 時，除0.6、0.8 mmol/L外，其余各組之間發(fā)芽率和相對發(fā)芽率均存在極顯著差異（P<001）。處理時間為12 h時，各組之間發(fā)芽率和相對發(fā)芽率均存在極顯著差異（P<0.01）。隨著疊氮化鈉處理時間和濃度的加大，苦蕎麥的發(fā)芽率整體呈現(xiàn)出下降的趨勢，當(dāng)疊氮化鈉的濃度為1.5 mmol/L、處理時間為 12 h 時，發(fā)芽率由原來的94%降到3%，種子的相對發(fā)芽率也呈現(xiàn)出下降的趨勢，當(dāng)疊氮化鈉處理濃度達到 1.5 mmol/L、處理時間為12 h時，其相對發(fā)芽率由100.00%降到3.19%。在同一濃度下，隨著誘變時間的延長，苦蕎麥種子相對發(fā)芽率也表現(xiàn)為下降的趨勢，說明隨著處理濃度和處理時間的增加，苦蕎麥種子受損傷的程度也不斷加大，當(dāng)疊氮化鈉濃度為 0.8 mmol/L、時間為8 h時，苦蕎麥種子發(fā)芽率為49%，相對發(fā)芽率為51.04%，因此得出疊氮化鈉最適宜的誘變組合為濃度0.8 mmol/L、時間8 h。

2.2 疊氮化鈉處理對苦蕎麥幼苗生理指標(biāo)的影響

2.2.1 不同濃度疊氮化鈉處理下苦蕎麥葉片MDA含量的變化 對MDA含量的測定結(jié)果如圖1所示，可以得出，對照MDA含量為0.667 μmol/L，而疊氮化鈉濃度為 1.5 mmol/L時，MDA含量為1.654 μmol/L，是對照的 2.48倍。相比于對照，處理組的MDA含量總體都在升高，除0.2 mmol/L疊氮化鈉濃度時與對照差異不顯著，其余各組均與對照有顯著差異（P<0.05），隨著處理濃度的增大，各相鄰濃度梯度之間并無顯著差異，說明MDA含量隨處理濃度的增大而增加，但各組之間增加量不多，總體趨勢較為平緩，但相比于對照，MDA含量增加的量越來越大，趨勢也越來越明顯。

2.2.2 不同濃度的疊氮化鈉處理下苦蕎麥葉片SOD活性的變化 由圖2可以看出，對照的SOD活性為48.28 U/g，隨著處理濃度的升高，苦蕎麥葉片中SOD活性也隨之升高，在疊氮化鈉濃度為0.6 mmol/L時，SOD活性為131.84 U/g，達到最大值，而后隨著處理濃度的繼續(xù)增大，SOD活性則慢慢減弱，在疊氮化鈉濃度為1.5 mmol/L時，SOD活性下降到6543 U/g。因此可知，疊氮化鈉在低濃度時苦蕎麥葉片SOD活性升高，高濃度時苦蕎麥葉片SOD活性下降，在濃度為04、0.6、0.8 mmol/L時相較于對照差異極顯著（P<0.01）。

2.2.3 不同濃度的疊氮化鈉處理下苦蕎麥葉片POD活性的變化 如圖3所示，POD活性變化與SOD活性變化趨勢相一致，對照POD活性為19.61 U/g，而在疊氮化鈉處理濃度為 0.8 mmol/L 時POD活性為76.92 U/g，達最大值，隨后POD活性逐漸降低，在疊氮化鈉濃度為1.5 mmol/L時POD活性下降為29.93 U/g。由此可知，疊氮化鈉在低濃度時苦蕎麥葉片POD活性上升，高濃度時苦蕎麥葉片POD活性下降，在濃度為 0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L時與對照差異極顯著（P<0.01）。

3 結(jié)論與討論

3.1 疊氮化鈉對苦蕎麥種子發(fā)芽的最佳誘變濃度和時間

關(guān)于疊氮化鈉對種子發(fā)芽的影響，國內(nèi)外學(xué)者不斷進行了研究。目前，作為一種常見的誘變劑，很多資料顯示，疊氮化鈉對作物有很高的誘變潛力，其應(yīng)用于大麥、水稻、蠶豆、高粱等作物并且得到了范圍相當(dāng)廣泛的突變譜以及相當(dāng)高的突變頻率[17]。本試驗中以晉蕎2號為試驗材料，探究疊氮化鈉處理對苦蕎麥種子發(fā)芽的影響，與疊氮化鈉對一些不同種屬作物研究的結(jié)果相比，其最佳誘變濃度和誘變時間都有一定的差異。楊國志等對西瓜的誘變育種研究認為，疊氮化鈉濃度為1.5 mmol/L、誘變時間為1.5 h時，誘變效果最佳[18];陸兆新等對水稻種子誘變的研究表明，疊氮化鈉濃度為 1 mmol/L、誘變時間為12 h時，其誘變效應(yīng)最為明顯[19];張會靈等對辣椒種子的誘變研究表明，疊氮化鈉濃度為 4 mmol/L、誘變時間為4 h時效果最佳[20]。而疊氮化鈉作用于蓼科植物的研究還比較少，在蓼科植物的誘變育種研究中，有關(guān)于誘變劑EMS（甲基磺酸乙酯）對頭花蓼的研究，結(jié)果表明，在EMS濃度為 0.6%、誘變時間為24 h或者EMS濃度為0.8%、誘變時間為12 h時，達到半致死條件[21]。本試驗對苦蕎麥的研究結(jié)果表明，隨著誘變劑濃度的升高，苦蕎麥種子的發(fā)芽率、相對發(fā)芽率均有所降低，發(fā)芽時間有所延長，在疊氮化鈉濃度為 0.8 mmol/L、誘變時間為8 h時為最佳的誘變組合，在此濃度下，種子發(fā)芽率達到49%，相對發(fā)芽率為5104%，因此認為疊氮化鈉濃度為0.8 mmol/L時是苦蕎麥種子誘變的半致死濃度，最佳誘變時間為8 h。

3.2 疊氮化鈉對苦蕎麥幼苗MDA含量和SOD、POD活性影響的分析

疊氮化鈉對種子發(fā)芽及幼苗生長的影響與逆境環(huán)境對種子的影響很相似，抗氧化酶活性的變化與幼苗在逆境條件下的應(yīng)對反應(yīng)也一致，疊氮化鈉濃度過大時，可能直接破壞種子的抗性機制，使幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性發(fā)生變化[22]。植物器官在逆境中，由于自由基對其造成的損害而會使植物器官發(fā)生膜脂的過氧化作用，生物膜中的不飽和脂肪酸分解后能產(chǎn)生MDA，可以和蛋白質(zhì)結(jié)合，使膜中的結(jié)構(gòu)蛋白和酶進行聚合、交聯(lián)，形成不可溶的化合物（脂褐素）沉積，因此能夠?qū)|(zhì)膜系統(tǒng)造成進一步的傷害[23]。通過MDA含量的測定結(jié)果可以得出，相比于對照，處理組的MDA含量總體都是在升高的，而且隨著處理濃度的增大，MDA含量上升的量越來越多，趨勢越來越明顯，這就表明脂膜受到了損傷，而且誘變劑濃度越高，其受到的損傷越大。植物抗氧化系統(tǒng)中的重要酶類包括SOD、POD，在正常的條件下，這些酶能夠有效地將體內(nèi)的活性氧自由基清除掉，以保護細胞免受傷害，但是在逆境條件下，植物清除活性氧的能力低于植物體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生速度，因此會引起傷害[23]。而植物體內(nèi)的抗氧化酶類如SOD、POD、過氧化氫酶（CAT）等可有效清除氧自由基，在對SOD、POD活性的測定中明顯看出，在低濃度時，SOD、POD含量升高，高濃度時，含量均有所下降，說明長時間、高濃度的疊氮化鈉誘變使苦蕎麥抗氧化系統(tǒng)受到抑制，SOD、POD的活性受到損傷，而低濃度疊氮化鈉誘變使植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)被激活，因此呈現(xiàn)出上升趨勢，在疊氮化鈉濃度為0.6 mmol/L時SOD活性達到最大值，在疊氮化鈉濃度為0.8 mmol/L時POD活性達到最大值。

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