凋亡基因Caspase3和Caspase7單核苷酸多態(tài)性與胃癌遺傳易感性研究

劉佳音 燕飛虎 張艷橋

胃癌是我國乃至世界最常見的危害人類生命健康的腫瘤之一。世界范圍內(nèi)，胃癌的發(fā)病率居第四位，其中超過70%的新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國家[1]。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，存在于整個(gè)基因組，是最常見的遺傳變異，已成為第3代遺傳標(biāo)志[2]。SNP可能通過調(diào)節(jié)環(huán)境危險(xiǎn)因素的影響來調(diào)節(jié)多個(gè)參與胃癌發(fā)生的生物學(xué)通路，本研究擬利用大樣本研究Caspase 3與Caspase 7基因的SNP與胃癌遺傳易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究納入研究對(duì)象共2 036人，年齡范圍為18～92歲，其中病例組1 000人，對(duì)照組1 036人。病例組來自2008—2011年哈爾濱醫(yī)科大學(xué)遺傳學(xué)教研室及2014年哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院招募的新診斷的、未接受任何治療的、病理診斷明確的胃癌病人。對(duì)照組來自2010年哈醫(yī)大附屬腫瘤醫(yī)院社區(qū)體檢者、2014年3月—2014年12月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及黑龍江省祖國醫(yī)藥研究所的健康體檢者及無癌患者。兩組年齡和性別匹配，本研究已通過哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審查合格并獲得批準(zhǔn)。

1.2 方法

所有受試者在招募前均簽署知情同意書，并完成一份標(biāo)準(zhǔn)化問卷，內(nèi)容包括人口統(tǒng)計(jì)信息、暴露信息(包括吸煙及飲酒狀態(tài))、工作經(jīng)歷、家族史，并捐獻(xiàn)血樣供分子流行病學(xué)檢測(cè)。血液標(biāo)本于2 mL離心管中，3 000 g，4℃，離心30 min。將離心好的血細(xì)胞和血清分別凍存于超低溫冰箱中。使用DNA提取試劑盒提取全血細(xì)胞基因組DNA，具體操作步驟按試劑盒的使用說明進(jìn)行。

1.3 SNP選擇

本研究中的SNP位點(diǎn)是根據(jù)NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/snp)和國際HapMap項(xiàng)目數(shù)據(jù)庫(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)選擇，包括Caspase 3與Caspase 7各兩個(gè)SNP，這些是假定的4個(gè)miRNA靶位點(diǎn)(表1)。

表1 預(yù)測(cè)凋亡基因miRNA結(jié)合位點(diǎn)的SNP位點(diǎn)Table 1 The SNP sites of predicting miRNA binding sites for apoptotic genes

1.4 TaqMan探針基因分型篩選

采用ABI VIIA7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)病例組及對(duì)照組DNA進(jìn)行分型篩選，將已鋪板的病例及對(duì)照DNA 2.25 μL用八通道排槍加入384孔板內(nèi)，設(shè)置反應(yīng)條件為5 μL體系，50個(gè)循環(huán)得到擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增結(jié)束后用SDS2.0軟件進(jìn)行基因型分型篩選。紅色和藍(lán)色分別代表野生型和突變型兩種純合子等位基因型，中間綠色簇代表雜合子基因型，黑色叉代表陰性對(duì)照及分型失敗(圖1)。

圖1 基因型鑒定結(jié)果示例Figure 1 The results of sample genotyping

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SAS 9.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，病例組與對(duì)照組之間性別、年齡、吸煙、飲酒狀況的構(gòu)成比的比較采用雙側(cè)χ2檢驗(yàn)，對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)后，采用χ2檢驗(yàn)比較病例組和對(duì)照組的單個(gè)位點(diǎn)基因型頻率差異，再通過單因素和多因素Logistic回歸模型分析基因型與疾病的關(guān)聯(lián)，對(duì)每個(gè)位點(diǎn)分層分析不同性別、年齡、吸煙、飲酒狀況亞層之間基因型與疾病的關(guān)聯(lián)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況差異

病例組和對(duì)照組年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，病例組與對(duì)照組的吸煙、飲酒狀態(tài)以及年吸煙包數(shù)構(gòu)成存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表2)。

表2 不同變量病例對(duì)照組間差異比較結(jié)果Table 2 Comparison of differences between case and control groups with different variables

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律分析

驗(yàn)證病例組和對(duì)照組兩組人群基因頻率是否符合哈代-溫伯格平衡定律，病例組和對(duì)照組中Caspase3基因的2個(gè)位點(diǎn)基因型頻率與Caspase7基因的2個(gè)位點(diǎn)基因型頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，說明所選對(duì)照對(duì)于該基因具有人群代表性(表3)。

2.3 基因頻率與基因型頻率

本研究所選取4個(gè)位點(diǎn)的野生型等位基因分別為A、C、T、G，野生型純合基因型為風(fēng)險(xiǎn)基因型，即rs1049253的AA、rs1049216的AA、rs4353229的CC和rs10787498的TT。

本研究所選取的4個(gè)符合哈代-溫伯格平衡定律的位點(diǎn)病例組與對(duì)照組之間基因型頻率都沒有差異(表4)；Logistic回歸結(jié)果顯示4個(gè)位點(diǎn)都與疾病沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。將帶有風(fēng)險(xiǎn)等位基因的基因型組合后進(jìn)行分析，顯示出針對(duì)兩個(gè)基因來說，帶有兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因型的個(gè)體比帶有0～1個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因型的個(gè)體容易患病，其患病風(fēng)險(xiǎn)增加了69.6%；調(diào)整了協(xié)變量影響后帶有3個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因型的個(gè)體比帶有0～1個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因型的個(gè)體容易患病，其患病風(fēng)險(xiǎn)增加了27.6%；帶有大于1個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因型的個(gè)體比帶有0～1個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因型的個(gè)體容易患病，其患病風(fēng)險(xiǎn)增加了35%(表5)。

表3 哈代-溫伯格平衡分析Table 3 Hardy-Weinberg balance analysis

表4 Caspase 3與Caspase 7等位基因頻率分析Table 4 Caspase 3 and Caspase 7 allele genes frequencies

表5 基因型頻率組間比較結(jié)果Table 5 Comparison of genotype frequencies between the case and control groups

2.4 分層分析

對(duì)每個(gè)位點(diǎn)以及風(fēng)險(xiǎn)基因型組合根據(jù)年齡、性別、吸煙、飲酒狀況進(jìn)行分層分析。本研究所選取的4個(gè)位點(diǎn)在任何亞層中都與疾病關(guān)；兩個(gè)基因組合之后的分層分析中，年齡≤60歲、男性、從不吸煙、年吸煙包數(shù)≤25、胃非賁門腺癌的亞層中風(fēng)險(xiǎn)基因型與疾病有關(guān)(表6)。

表6 2個(gè)基因組合亞層之間比較結(jié)果Table 6 Results of comparison between sublayers of two gene combinations

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種模式，它通過清除受損的細(xì)胞起到保護(hù)作用，從而起到維持體內(nèi)平衡的作用[3]。細(xì)胞凋亡途徑的任何改變都可能導(dǎo)致各種疾病包括癌癥的發(fā)生。Caspase對(duì)不同細(xì)胞死亡的刺激反應(yīng)而活化，引起大量細(xì)胞蛋白水解，最終導(dǎo)致這種死亡形式產(chǎn)生了生物學(xué)及形態(tài)學(xué)上的變化[4]。Caspase3和Caspase7是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡途徑的執(zhí)行者，它們?cè)诩?xì)胞凋亡的執(zhí)行階段及線粒體途徑中發(fā)揮重要作用，如線粒體膜電位的去極化和促凋亡因子包括細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放[5]。

在此項(xiàng)基于醫(yī)院的病例對(duì)照研究中，我們研究了位于Caspase3和Caspase7基因3′UTR常見的、假定有功能的一些SNP與東北地區(qū)人群胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。其中2個(gè)位點(diǎn)位于Caspase3基因，分別是rs1049253和rs1049216；2個(gè)位點(diǎn)位于Caspase7基因，分別是rs4353229和rs10787498。我們的研究結(jié)果顯示，將Caspase7的2個(gè)位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)基因合并后進(jìn)行多因素分析，帶有1個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因型的個(gè)體比不帶有風(fēng)險(xiǎn)基因型的患病風(fēng)險(xiǎn)增加。分層分析這種風(fēng)險(xiǎn)在年齡小于等于60歲，從不吸煙，年吸煙包數(shù)小于等于25包和非胃賁門腺癌人群中更為明顯。將Caspase3和Caspase7基因的4個(gè)位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)基因合并后進(jìn)行多因素分析，帶有2個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因型的個(gè)體比帶有0～1個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因型的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)增加。然而，單因素分析這4個(gè)位點(diǎn)，并未發(fā)現(xiàn)其之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，亞層之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。合并分析Caspase3的2個(gè)位點(diǎn)，也無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，分層分析2位點(diǎn)之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。我們可以看出，Caspase7基因rs4353229和rs10787498位點(diǎn)的SNP是對(duì)胃癌風(fēng)險(xiǎn)貢獻(xiàn)效果最為顯著的聯(lián)合位點(diǎn)。因此，這些研究結(jié)果表明，Caspase3兩個(gè)位點(diǎn)與Caspase7兩個(gè)位點(diǎn)SNP均與胃癌風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。將Caspase7基因兩個(gè)位點(diǎn)的SNP合并分析表明其可能影響胃癌的易感性，或可作為疾病診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。據(jù)我們所知，同時(shí)研究凋亡途徑中效應(yīng)Caspase3和Caspase7基因多個(gè)位點(diǎn)SNP與東北地區(qū)人群胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的文章此前鮮見。

Soung等[6]研究發(fā)現(xiàn)滅活Caspase7的基因突變可能導(dǎo)致其細(xì)胞凋亡功能缺失，從而誘發(fā)某些實(shí)體腫瘤的發(fā)生。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，Caspase7缺乏的小鼠對(duì)內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡有抵抗力，在LPS誘導(dǎo)的殺傷力作用下受到明顯的保護(hù)[7]。根據(jù)Caspase7基因的生物學(xué)意義，Caspase7的遺傳變異可能通過改變蛋白表達(dá)或其功能從而影響患癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。許多研究發(fā)現(xiàn)在胃癌與結(jié)腸癌中Caspase7是下調(diào)的[8]。

在分層分析中，我們的數(shù)據(jù)表明所觀察到的胃癌風(fēng)險(xiǎn)在年齡小于等于60歲，從不吸煙，年吸煙包數(shù)小于等于25包和非胃賁門腺癌人群中更為明顯。由于年輕的患者暴露于吸煙和飲酒相對(duì)較少，同時(shí)我們?cè)诜俏鼰熣吆头秋嬀普咧幸灿^察到一些保護(hù)作用，他們可能只經(jīng)歷了一些輕微暴露因素。這與易感個(gè)體很可能是經(jīng)歷了一些輕微暴露因素的年輕者這一觀點(diǎn)相符。相反地，老年人可能會(huì)暴露于更多的環(huán)境危害，從而喪失保護(hù)性等位基因的遺傳優(yōu)勢(shì)[9]。然而，由于樣本量有限，未來仍需要大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)這種推斷，在本研究中特別是分層分析中更應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)處理。

越來越多的證據(jù)表明，結(jié)合靶基因mRNA的3′UTR的miRNA，通過調(diào)節(jié)原癌基因或抑癌基因的表達(dá)，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用[10]。位于miRNA靶mRNA結(jié)合位點(diǎn)的SNP可能影響miRNA與靶mRNA的相互作用，從而導(dǎo)致靶基因表達(dá)異常[11]。Garcia-Lozano等[12]發(fā)現(xiàn)Caspase7基因rs4353229的SNP可能與Caspase7的表達(dá)水平及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。然而，rs4353229基因型與胃癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系可能也與其他未知的結(jié)合位點(diǎn)附近功能性變異相關(guān)。在本研究中，我們并未對(duì)基因型mRNA的表達(dá)進(jìn)行分析，因此在后續(xù)研究中，需要我們?nèi)ミM(jìn)一步驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)基因型mRNA的表達(dá)量，并對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行功能驗(yàn)證。

總體而言，本研究對(duì)凋亡途徑中效應(yīng)Caspase3和Caspase7基因多個(gè)位點(diǎn)的SNP與東北地區(qū)人群胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)做了大樣本的系統(tǒng)研究，但其中仍存在一些可能的限制。首先，這是一個(gè)基于醫(yī)院的病例對(duì)照研究，可能存在選擇偏倚，這是由于從癌癥醫(yī)院和綜合醫(yī)院招募的病例可能不能十分理想地代表所有地理上與相似的環(huán)境因素暴露下相匹配的人群病例。雖然我們將年齡、性別等暴露因素進(jìn)行匹配，但吸煙情況、飲酒情況等無法進(jìn)行精確的匹配，因此存在一定的差異。將病例和對(duì)照進(jìn)行年齡、性別、居住區(qū)的頻數(shù)進(jìn)行匹配和進(jìn)一步調(diào)整潛在的混雜因素后，運(yùn)用Logistic回歸分析進(jìn)行校正，最終使得潛在的混雜偏倚最小化。每個(gè)SNP的基因型均分布符合哈迪-溫伯格平衡，這進(jìn)一步證實(shí)了我們控制選擇的隨機(jī)性。其次，幽門螺旋桿菌感染作為胃癌的主要危險(xiǎn)因素之一，未在本研究中進(jìn)行評(píng)估，這是因?yàn)獒t(yī)院并未進(jìn)行這類常規(guī)檢測(cè)，收集這些資料存在一定困難。與胃癌相關(guān)的一些因素如飲食習(xí)慣、職業(yè)暴露因素、心理精神情況也未能收集到，這在一定程度上降低了胃癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的可信性。幽門螺桿菌與Caspase3、Caspase7基因型聯(lián)合作用需要更多的前瞻性研究和臨床研究來進(jìn)一步證實(shí)我們的發(fā)現(xiàn)。最后，由于癌癥是一個(gè)復(fù)雜的多因素疾病，潛在的功能性多態(tài)性位點(diǎn)需要進(jìn)行進(jìn)一步的功能試驗(yàn)來預(yù)測(cè)整體風(fēng)險(xiǎn)。未來研究應(yīng)包括更多參與凋亡通路基因的SNP，并結(jié)合每個(gè)SNP最合適的影響作用來提高其預(yù)測(cè)能力。因此需要來自國內(nèi)外不同地域的大樣本前瞻性研究來進(jìn)一步證實(shí)并探索Caspase家族與胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。