外周血白細(xì)胞PDE4C基因甲基化及環(huán)境因素交互作用與乳腺癌發(fā)病的關(guān)系

李 爍 張楠楠 李亮亮 龍志平 尹慧慧 趙亞雙 王 帆

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一[1]。目前認(rèn)為乳腺癌的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，其中表觀遺傳學(xué)改變尤其是DNA甲基化的發(fā)生是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的一個重要原因。除遺傳因素外，DNA甲基化同時也會受環(huán)境因素的影響。有明確的證據(jù)表明膳食葉酸可以提供甲基，在調(diào)控DNA甲基化中起重要作用，從而與乳腺癌的發(fā)病相關(guān)[2]。作為磷酸二酯酶4(Phosphodiesterase 4，PDE4)家族的重要成員，PDE4C廣泛分布于各種炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞，可作為抑制劑作用于細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎作用[3]。Bao等研究發(fā)現(xiàn)在腦膠質(zhì)瘤樣本中PDE4C啟動子發(fā)生高甲基化，伴隨表達(dá)下調(diào)并與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，該研究得出結(jié)論，PDE4C能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷徙而起到腫瘤抑制劑的作用[4]。

目前，尚沒有研究報道PDE4C甲基化與乳腺癌發(fā)病的關(guān)系。因此，本研究旨在應(yīng)用病例對照研究方法探討外周血白細(xì)胞中PDE4C甲基化的狀態(tài)及其與環(huán)境因素之間的聯(lián)合、交互作用與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采用病例對照的研究方法，患者為2010年10月—2014年12月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科首次就診，經(jīng)病理證實(shí)為乳腺癌并無其他癌癥史的女性患者402例，所有患者術(shù)前均未接受化療及其他抗癌治療。對照為同時期納入的哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的眼科住院患者和哈爾濱香坊社區(qū)的志愿者女性470例，對照人群中無乳腺癌疾病史以及其他癌癥疾病史。采集病例及對照組的術(shù)前空腹靜脈血5 mL，高速離心后及時分裝、儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 流行病學(xué)調(diào)查

病例和對照使用統(tǒng)一的調(diào)查問卷進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。調(diào)查的主要內(nèi)容包括人口學(xué)基本資料(年齡、身高、體重、BMI、民族、婚姻狀況、文化程度、腫瘤家族史等)、發(fā)病前環(huán)境因素暴露信息，如：飲食習(xí)慣(蔬菜、蛋類、肉類、奶制品等食用量)、行為習(xí)慣(吸煙、飲酒、運(yùn)動、體力活動、職業(yè)類型等)以及月經(jīng)史、避孕藥服用史等。

調(diào)查人員均為經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室的在讀研究生，在調(diào)查過程中嚴(yán)格遵守調(diào)查員手冊內(nèi)容，采用面對面直接詢問的方式完成問卷。數(shù)據(jù)由Epidata 3.1軟件建立數(shù)據(jù)庫，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行二次錄入，以防止數(shù)據(jù)的漏錄和誤錄，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)出到Excel 2007中進(jìn)行合并整理和分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測方法

1.3.1 DNA提取及重亞硫酸鹽處理 本研究采用QIAamp DNA Blood Mini Kit，按照說明書對外周血進(jìn)行白細(xì)胞DNA提取。使用Nanodrop 2000 Spectrophtomete檢測DNA的質(zhì)量和濃度。使用EpiTect重亞硫酸鹽修飾試劑盒，按照說明書將提取到的DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的初始DNA總量為2 000 ng，轉(zhuǎn)化后的DNA產(chǎn)量在50～100 ng/μL之間并保存在-80℃以備用。

1.3.2 質(zhì)粒構(gòu)建和標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度稀釋 使用TOPO TA Cloning for Sequencing試劑盒將目標(biāo)區(qū)域新鮮純化的特異性PCR產(chǎn)物用于質(zhì)粒的構(gòu)建，所有操作均按照說明書進(jìn)行。提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序驗(yàn)證，并依據(jù)質(zhì)粒長度進(jìn)行計(jì)算。用于定量的質(zhì)粒濃度按拷貝數(shù)107～10 /μL進(jìn)行稀釋，所選梯度分別為107、106、105、104、103、100、10，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

1.3.3 PDE4C甲基化定量檢測 使用ABI 7500 real-time PCR進(jìn)行PCR擴(kuò)增及DNA甲基化修飾的定量PCR特異性檢測(qMSP)[5]。PDE4C基因擴(kuò)增上下游引物：5′-CGGTTATTTATCGTTTGTAGGAGGAAACG-3′，5′-ATCCAACAACGCTTCTATTCGAATCCG-3′，MyOD基因(非甲基化基因)作為管家基因擴(kuò)增的上下游引物序列：5′-CCAACTCCAAATCCCCTCTCTAT-3′，5′-TGATTAATTTAGATTGGGTTTAGAGAAGGA-3′。PCR反應(yīng)體系：Universal SYBR Green Supermix試劑，10 μL；引物終濃度600 nmol/L，正反向引物各0.6 μL；重亞硫酸鹽修飾后的DNA 5 ng，1 μL；補(bǔ)充雙蒸水至20 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本、DNA樣本及空白對照檢測均采用副孔，以保證結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性?；蚣谆瘷z測PCR參數(shù)：(1)PDE4C：95℃ 6 min；95℃ 30 s，42個循環(huán)；66.5℃ 30 s；72℃ 30 s；(2)MyOD：95℃ 6 min；95℃ 30 s，42個循環(huán)；56℃ 30 s；72℃ 30 s。每個樣本的甲基化水平計(jì)算：甲基化水平=(PDE4C基因甲基化拷貝數(shù)/MyOD基因拷貝數(shù))×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)分析分類變量在病例組和對照組中的差異；采用t檢驗(yàn)分析連續(xù)性變量在兩組中的差異。采用單因素和多因素非條件Logistic回歸分析PDE4C基因甲基化與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)系?；蚝铜h(huán)境的聯(lián)合和交互作用分別采用叉生分析、多因素Logistic回歸分析，叉生分析的檢驗(yàn)水準(zhǔn)經(jīng)Bonferroni進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的基本人口學(xué)特征

本研究共納入402例乳腺癌患者和470例對照。對病例組和對照組的基本情況進(jìn)行分析(表1)。兩組間婚姻狀況、文化程度、工作性質(zhì)和腫瘤家族史的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在后續(xù)的多因素分析時將這些因素納入作為調(diào)整因素進(jìn)行調(diào)整。

表1 乳腺癌病例組和對照組的基本特征[n(%)]Table 1 The characteristics of breast cancer patients and health controls[n(%)]

Note：a.Grouped by Asian standards；Missing values：marital status，3；education level，2；Occupation，112；family history of cancer，62；BMI，3.

2.2 PDE4C基因甲基化與乳腺癌發(fā)病的關(guān)系

調(diào)整了婚姻狀況、文化程度、工作性質(zhì)和腫瘤家族史的非條件logistic結(jié)果顯示，PDE4C基因甲基化與乳腺癌的發(fā)病之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(P>0.05)(表2)。

表2 外周血白細(xì)胞PDE4C基因甲基化與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系Table 2 Relationship between PDE4C gene methylation in peripheral blood leukocytes and the risk of breast cancer

2.3 環(huán)境因素與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的分析

采用逐步回歸的方法篩選與乳腺癌發(fā)病相關(guān)的環(huán)境因素，并將婚姻狀況、文化程度、工作性質(zhì)和腫瘤家族史作為調(diào)整因素。單因素和多因素Logistic回歸結(jié)果如表3所示，將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的環(huán)境因素納入多因素Logistic回歸模型中，結(jié)果顯示，粗糧、蔬菜、蔥屬性植物、禽肉、牛奶、運(yùn)動為乳腺癌的保護(hù)性因素。豬肉、心理應(yīng)激指數(shù)、月經(jīng)不規(guī)律為乳腺癌的危險因素。

表3 環(huán)境因素與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的非條件logistic回歸分析Table 3 Unconditional logistic regression analysis of environmental factors and risk of breast cancer

Note：a.Adjustment factors including Marital status，Education level，Occupation and Family history of cancer；b.Smoke，take at least one cigarette a day for more than 6 months；c.Alcohol，including all alcohol；d.Sports，including walking，climbing stairs，running，walking and various sports activities，etc.

2.4 PDE4C基因甲基化和環(huán)境因素的聯(lián)合、交互作用與乳腺癌發(fā)病的關(guān)系

在多因素有意義的環(huán)境因素中，根據(jù)現(xiàn)有的研究報道，蔥屬性植物、運(yùn)動、心理應(yīng)激指數(shù)與炎癥性疾病發(fā)生密切相關(guān)[6-9]。因此，本研究應(yīng)用叉生分析及多因素logistic回歸模型計(jì)算PDE4C甲基化與蔥屬性植物、運(yùn)動、心理應(yīng)激指數(shù)的聯(lián)合和交互作用。結(jié)果顯示，PDE4C高甲基化與蔥屬性植物(>3次/周)聯(lián)合作用的OReg值為0.373(95%CI：0.208～0.668)，提示PDE4C高甲基化攜帶者增加蔥屬性植物的攝入量可降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險，但未發(fā)現(xiàn)PDE4C甲基化與蔥屬性植物之間有顯著的交互作用。均未發(fā)現(xiàn)PDE4C甲基化與運(yùn)動、心理應(yīng)激指數(shù)之間存在顯著的聯(lián)合和交互作用(表4)。

表4 PDE4C甲基化和環(huán)境因素間聯(lián)合和交互作用分析表Table 4 Combination and interactions between PDE4C methylation and environmental factors

Note：ORega，ORenvironment& gene methylation，combinations between gene and environmental factors，we analyzed the combined effects of three factors and PDE4C methylation，with thePvalue of 0.05/3 after Bonferroni correction；ORib，ORinteraction，interactions between gene and environmental factors；Adjustment factors including Marital status，Education level，Occupation and Family history of cancer.

3 討論

乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素、多步驟共同作用的復(fù)雜過程，如物理因素、化學(xué)因素以及基因突變和染色體異常等[7]。隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，尤其是基因甲基化的深入研究，外周血白細(xì)胞作為癌癥易感性的特異性DNA甲基化生物標(biāo)志物的潛在用途已經(jīng)被提出，這為乳腺癌復(fù)雜機(jī)制的解釋和靶向治療提供了依據(jù)。Choi等[8]應(yīng)用病例對照的研究方法檢測乳腺癌外周血白細(xì)胞的5-甲基胞嘧啶(5-mdC)的水平以研究外周血白細(xì)胞甲基化與乳腺癌的關(guān)系，該研究得出結(jié)論：外周血白細(xì)胞甲基化與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。在本研究中，對病例組和對照組的外周血白細(xì)胞進(jìn)行甲基化檢測，旨在探討外周血白細(xì)胞PDE4C基因甲基化及其與環(huán)境因素交互作用和乳腺癌發(fā)病的關(guān)系。

世界癌癥報告結(jié)果顯示飲食習(xí)慣、體力活動、生活方式等均與癌癥相關(guān)[9]。Hanf等[10]的在一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查中指出減少紅肉的攝入量會降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險，這與本項(xiàng)研究的結(jié)果一致，豬肉攝入量大于等于250克每周者比小于250克每周者的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險高，OR為1.915(95%CI：1.248～2.939)。牛奶中含有豐富的鈣及結(jié)合亞麻油酸，世界癌癥研究基金會報告中指出，高頻次攝入牛奶會降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險[11]，本研究結(jié)果與其一致，調(diào)整后的OR為0.468(95%CI：0.240～0.913)。Hanf等[13]同時報道增加蔬菜、植物纖維的攝入量會降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險，本研究結(jié)果顯示蔬菜(OR=0.428，95%CI：0.245～0.747)會降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險，與其報道結(jié)果一致。瑞典卡洛琳梅斯醫(yī)學(xué)院的研究人員對6.1萬名女性的健康狀況進(jìn)行長達(dá)17年的研究，根據(jù)問卷調(diào)查結(jié)果顯示，約有300名乳腺癌患者喜歡吃大米等細(xì)糧，與喜吃粗糧者相比，她們患乳腺癌的風(fēng)險高出44%，本研究結(jié)果顯示粗糧攝入量大于等于50克每周會降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險，調(diào)整的OR為0.694(95%CI：0.500～0.965)。

由于近年來女性工作節(jié)奏加快，工作壓力增大，月經(jīng)不調(diào)和心理因素已經(jīng)成為乳腺癌發(fā)生不可忽視的危險因素，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)月經(jīng)不規(guī)律比規(guī)律者的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險高，OR值為1.931(95%CI：1.080～3.455)；心理應(yīng)激指數(shù)越高，乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險越高，應(yīng)激指數(shù)>15分組的OR為2.415(95%CI：1.659～3.514)。研究報道運(yùn)動可以明顯預(yù)防乳腺癌的發(fā)生，機(jī)體可以通過運(yùn)動燃燒脂肪來調(diào)節(jié)月經(jīng)周期，增強(qiáng)和改善心肺功能，使心情愉悅，從而精神狀態(tài)放松，緩解心理壓力，降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險[12]，本研究中運(yùn)動調(diào)整后的OR為0.519(95%CI：0.368～0.732)，與報道的結(jié)論相同。

慢性炎癥是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的危險因素。PDE4C作為抑制劑的抗炎機(jī)制主要包括誘導(dǎo)具有抑制細(xì)胞活性的細(xì)胞因子的生成(如白細(xì)胞介素-2)和抑制多種炎癥介質(zhì)的活性等，PDE4C發(fā)生甲基化時，表達(dá)降低，失去抗炎抑制劑的作用，上述抗炎機(jī)制失活，導(dǎo)致慢性炎癥，繼而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。已有研究報道，某些刺激性食物如蔥屬性植物具有抗炎、抗氧化的作用，對腫瘤的發(fā)生起保護(hù)作用[13]。一項(xiàng)研究表明[14]，蔥屬性植物中的烯丙基硫化合物可以改變腫瘤的微環(huán)境和癌前細(xì)胞的生物學(xué)行為，降低癌癥的發(fā)生風(fēng)險。本研究中我們發(fā)現(xiàn)蔥屬性植物的攝入量大于3次每周會降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(OR=0.365，95%CI：0.254～0.523)；在聯(lián)合、交互作用分析中，結(jié)果顯示PDE4C基因的高甲基化與蔥屬性植物(>3次/周)的聯(lián)合作用的OR值為0.373(95%CI：0.208～0.668)，此結(jié)果提示PDE4C基因高甲基化攜帶者增加蔥屬性植物的攝入量，可降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險。

本研究局限性為環(huán)境因素資料的收集存在一定的回憶偏倚。問卷中關(guān)于飲食因素的資料是以頻次劃分，對暴露的劑量分析不夠細(xì)致，無法給出定量的分析結(jié)果。由于樣本量的限制，在叉生分析時亞組分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)效能不足，結(jié)果有待大樣本人群研究驗(yàn)證。本研究是回顧性病例對照研究，血液樣本在病人確診為乳腺癌之后收集，因此需要基于隊(duì)列人群的前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究結(jié)果表明乳腺癌的發(fā)生是多方面因素共同作用的結(jié)果。PDE4C基因高甲基化不是乳腺癌發(fā)病的獨(dú)立危險因素。心理應(yīng)激指數(shù)偏高、月經(jīng)周期不規(guī)律和長時間較高頻次/攝入量的豬肉，會增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險。較高頻次/攝入量的粗糧、蔬菜、蔥屬性植物、禽肉、牛奶，經(jīng)常鍛煉身體會降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險。PDE4C高甲基化攜帶者增加蔥屬性植物的攝入量可降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險。