白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ通過TLR4/MyD88通路調(diào)控肺癌A549細胞增殖侵襲的研究

劉志強 褚艷杰 劉 靜 王彥博

肺癌是呼吸系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率逐年升高，5年生存率在4%～17%之間[1]。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與免疫系統(tǒng)不能產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān)[2]。MyD88是天然免疫受體TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的接頭蛋白，TLR4與MyD88共同表達，通過激活多種促炎細胞因子和抗凋亡蛋白影響腫瘤患者的生存期及預(yù)后[3-4]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ(AtractylenolideⅠ)是從白術(shù)中提取的天然倍半萜內(nèi)酯，已經(jīng)用于抗炎和癌癥治療。臨床研究表明，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可以改善胃癌患者食欲和(Karnofsky，KPS)評分，且副作用少[5]。但有關(guān)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對肺癌的作用研究甚少，其分子機制研究尚不清楚。

因此，本研究探討TLR4/MyD88在肺癌組織中的表達情況，并將白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ作用于人肺癌A549細胞，通過檢測細胞活力、細胞侵襲及TLR4/MyD88通路相關(guān)蛋白，闡明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ抑制肺癌細胞增殖侵襲的作用機制，為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 腫瘤組織樣本

選取2017年8月—2018年8月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院就診的28例患者手術(shù)切除的肺癌組織及癌旁組織。病理診斷由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科完成。所有患者均簽署了書面知情同意書。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組處理

人肺癌A549細胞系購自中科院上海細胞庫。細胞置于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ購于MCM?小分子網(wǎng)站(http：//www.medchemexpress.cn/)，溶解于DMSO中。細胞分組為：(1)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ處理組：給予100 μM/L白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ；(2)對照組：給予相應(yīng)濃度DMSO，作為對照組。

1.3 RNA提取和定量RT-PCR

使用TRIzol試劑(Invitrogen)按照說明書從肺癌組織及癌旁組織中提取RNA。使用PrimeScript?RT試劑盒合成cDNA，SYBR Premix Ex Taq試劑盒在ABI7900序列檢測器上進行qPCR，β-actin作為內(nèi)參，引物信息見表1。

表1 實時定量PCR引物Table 1 Real-time quantitative PCR primers

1.4 細胞侵襲測定

使用聚碳酸酯濾膜(8 μm孔徑)測定試劑盒(Corning)測定細胞侵襲遷移能力。將無胎牛血清培養(yǎng)基中約5×104個A549細胞接種在預(yù)先涂有基質(zhì)膠的上室中，下室加入200 μL含胎牛血清的培養(yǎng)基。次日加入白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、DMSO處理細胞。48 h后，使用棉簽擦拭頂部腔室以除去非侵入性細胞。細胞置于100%甲醇中固定，0.1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡拍照，Image-Pro Plus 6.0計數(shù)。

1.5 免疫組化染色

將肺癌組織或癌旁組織用4%多聚甲醛固定7天，轉(zhuǎn)移至不同濃度的乙醇中脫水后包埋在石蠟中，切片用于免疫組化染色。組織切片置于檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中108℃溫育5 min進行抗原修復(fù)，并于3%H2O2室溫中預(yù)處理15 min，然后用PBS洗滌。隨后山羊血清孵育20 min。孵育一抗TLR4(Abcam，1∶50)及MyD88(Abcam，1∶100)后置于濕盒中4℃過夜。次日孵育二抗(辣根過氧化物酶綴合的抗兔IgG)，使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。每組隨機選擇三個視野，進行顯微鏡拍照。

1.6 MTT檢測細胞增殖

適當(dāng)濃度A549細胞鋪入96孔板，貼壁后分別加入白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、DMSO后，按24 h、48 h、72 h時間點處理。棄原細胞培養(yǎng)基，每孔加入200 μL MTT溶液，37℃恒溫條件下孵育4 h，棄上清液，每孔加200 μL DMSO，于ELx80TM光吸收酶標(biāo)儀(BioTek)上機檢測，記錄490 μm處吸光度值。

1.7 Western blot

用RIPA裂解緩沖液裂解白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ及DMSO處理后的細胞，提取樣品總蛋白，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化樣品與6×緩沖液混合后加熱至100℃，維持7 min。配置10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳70 V 30 min，110 V 2 h；300 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min。室溫封閉2 h，孵育一抗TLR4(Abcam，1∶500)，MyD88(Abcam，1∶1 000)及β-catenin(Abcam，1∶2 000)4℃過夜，次日用紅外熒光標(biāo)記二抗避光孵育1 h，使用Odyssey紅外成像系統(tǒng)顯色蛋白條帶并分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TLR4及MyD88 mRNA在肺癌組織及癌旁組織中的表達

經(jīng)qRT-PCR檢測28例肺癌組織和相應(yīng)癌旁組織中TLR4及MyD88的mRNA表達，發(fā)現(xiàn)TLR4及MyD88的mRNA水平在肺癌組織中顯著升高，與癌旁組織比較差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.016；P=0.007)(圖1A，B)，說明TLR4/MyD88通路與肺癌發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)。

2.2 TLR4及MyD88蛋白在肺癌組織及癌旁組織中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，在肺癌組織中TLR4蛋白水平及MyD88蛋白水平顯著高于癌旁組織(P=0.004，P=0.007)(圖2A、圖2C)。圖2B，2D為免疫組化染色陽性率統(tǒng)計圖，證明了TLR4/MyD88通路在肺癌中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

圖1 肺癌組織及癌旁組織中TLR4及MyD88的mRNA表達Figure 1 The expression of TLR4 and MyD88 mRNA in lung cancer and adjacent normal tissues Note：*P<0.05，**P<0.01，when compared with the adjacent normal tissues.

圖2 肺癌組織及癌旁組織中TLR4及MyD88的蛋白表達Figure 2 The expression of TLR4 and MyD88 protein in lung cancer and adjacent normal tissues Note：B.n=5，**P=0.004；D.n=5，**P=0.007.

2.3 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ調(diào)控肺癌細胞的侵襲能力

相對于對照組，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ處理組A549細胞穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)量顯著減少(圖3A)，兩組之間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.028)。圖3B為穿過基質(zhì)膠細胞數(shù)量統(tǒng)計圖，說明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ抑制了A549細胞侵襲轉(zhuǎn)移。

圖3 Transwell檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對A549侵襲能力的影響Figure 3 The effect of Atractylenolide I on invasive ability of A549 cells.* P<0.05，when compared to the negative controlNote：n=10，*P=0.028.

2.4 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ影響肺癌細胞的增殖活力

與對照組相比較，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ處理組顯著抑制了A549細胞的增殖活力，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖4)。進一步證實了白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的抗腫瘤作用。

2.5 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ影響TLR4/MyD88蛋白的表達

Western blot實驗結(jié)果顯示，給予白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ后，A549細胞的TLR4/MyD88蛋白的表達較對照組顯著降低(圖5A)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。圖5B為統(tǒng)計圖，說明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ通過抑制TLR4/MyD88通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖4 MTT檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對A549細胞活力的影響Figure 4 The effect of Atractylenolide I on viability of A549 cellsNote：n=5，*P<0.05.

圖5 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ抑制A549中TLR4/MyD88通路Figure 5 Atractylenolide I inhibited the expression of TLR4 and MyD88 protein in A549 cells Note：*P<0.05，when compared with the negative control.

3 討論

2019年，全球肺癌新發(fā)病例數(shù)估計為2 596 112例，死亡病例數(shù)估計為228 150例。盡管在治療方面取得了許多進展，但晚期肺癌的5年總生存率仍然很低[6]。多年來，肺癌一直被認為是非免疫原性腫瘤。然而隨著免疫相關(guān)標(biāo)志物如細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4(CTLA-4)、程序性死亡1(PD-1)/程序性死亡配體1(PD-L1)在CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)中的發(fā)現(xiàn)以及對腫瘤免疫治療的逐漸推廣[7]，近年來免疫抑制對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響受到了極大關(guān)注。分子診斷學(xué)和免疫治療學(xué)的新進展推動了新型治療藥物的快速發(fā)展，這些藥物開創(chuàng)了肺癌管理的新時代，且具有良好的療效和安全性[8]。

白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ是白術(shù)的主要天然成分之一，因其具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤等多種作用而受到越來越多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)[9]，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可以通過阻斷Notch通路而有效地抑制腫瘤細胞的增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡。先前的研究表明[10]，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對于K562慢性粒細胞白血病、U937急性髓細胞白血病和Jurkat T淋巴瘤細胞有細胞毒作用，可誘導(dǎo)白血病細胞發(fā)生ROS介導(dǎo)的凋亡。此外，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ通過RAS/ERK和PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在黑色素瘤細胞中發(fā)揮抗增殖、誘導(dǎo)細胞分化和抑制細胞遷移的作用[11]。近期研究表明，抑制PDK1和lncRNA HOTAIR介導(dǎo)的EZH2基因表達有助于增強白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和厄洛替尼對人肺癌細胞的抑制作用[12]，并能通過激活ERK1/2，抑制肺癌細胞的生長[13]。本研究證實白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可抑制A549細胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移，說明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ具有抗腫瘤作用。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ處理組TLR/MyD88的表達水平下降，進一步驗證白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ通過TLR/MyD88通路影響了肺癌的發(fā)生發(fā)展。

一般認為局部細胞因子的釋放和炎癥誘發(fā)可以導(dǎo)致腫瘤免疫抑制的發(fā)生[14]，而Toll樣受體(TLRs)在其中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。TLRs作為一類進化保守的模式識別受體，能選擇性的識別病原微生物所攜帶的病原體相關(guān)分子模式，在固有免疫中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在此過程中，髓樣分化因子88(MyD88)是關(guān)鍵的銜接分子，也是免疫抑制和腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵分子[15-16]。TLRs被配體識別后，可將信號傳遞給細胞內(nèi)的接頭分子，然后通過NF-KB和IRF-3等多種信號傳導(dǎo)通路激活炎癥，進而引起白細胞介素6等多種細胞因子的釋放和抗凋亡蛋白表達的增加。有研究表明炎癥相關(guān)NF-KB通路激活以及活化后所引起的炎癥因子的分泌均可促進腫瘤細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[17]，增加腫瘤細胞的凋亡抗性從而引起化療耐藥。另外，慢性炎癥導(dǎo)致的免疫抑制，如T細胞和NK細胞功能不全，也有利于腫瘤細胞生長[18-19]。以上這些發(fā)現(xiàn)為尋找治療肺癌的新方法提供了理論基礎(chǔ)。在本研究中，發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中，TLR4/MyD88的mRNA和蛋白的表達水平顯著升高，為肺癌靶向干預(yù)治療提供新思路。

本研究首先通過收集臨床患者樣本，確定TLR4/MyD88通路在肺癌組織中高表達，說明了TLR4/MyD88通路與肺癌發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)。通過檢測肺癌A549細胞的增殖侵襲情況，驗證白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ通過拮抗TLR4/MyD88發(fā)揮抗腫瘤作用，進一步闡明了白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ抑制肺癌的作用機制，為肺癌的臨床治療提供新思路。