表達(dá)EDA-EmIMP1的重組枯草芽孢桿菌的制備及其免疫效果評價

陳 志，丁可欣，林霞琳，黃瀟航，黃志堅，殷光文

(福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/ 福建省動物藥物工程實驗室，福建福州350002)

雞球蟲病是對全球禽養(yǎng)殖業(yè)危害很大的一種寄生蟲病，其中巨型艾美耳球蟲(Eimeria maxima)是較常見的雞球蟲。E.maxima具有很好的免疫原性，能夠?qū)ζ渌u球蟲產(chǎn)生交叉免疫力[1]。該球蟲感染雞所產(chǎn)生的抗體，能夠作為母源抗體傳遞給后代，對子代產(chǎn)生持續(xù)約3 個月的保護(hù)力[2-3]。

疫苗免疫是防治雞球蟲病的有效手段[4-5]。免疫相關(guān)蛋白1(IMP1)作為E.maxima中的蛋白，具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性[6]。纖維連接蛋白外域A (EDA)作為分子佐劑，能夠通過受體4 (TLR4)把抗原傳遞給樹突細(xì)胞(DCs)以增強(qiáng)其免疫原性[7-10]?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)作為異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)具非致病性、對人畜無害、完善的分泌系統(tǒng)、利于外源基因產(chǎn)物的純化和回收等特性[11]。本實驗結(jié)合枯草芽孢桿菌作為外源基因呈遞載體的優(yōu)勢，再將 EDA 作為 EmIMP1 的佐劑，制備 pHT01-EDAEmIMP1 和pHT01-EmIMP1 胞內(nèi)重組表達(dá)質(zhì)粒，對該重組枯草芽孢桿菌的免疫效果進(jìn)行評價，為雞球蟲疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 1 日齡的海蘭褐雄蛋雞，一級(CV)實驗動物，飼養(yǎng)于經(jīng)過嚴(yán)格殺菌消毒的環(huán)境，嚴(yán)格分組并給予足水足料喂養(yǎng)，1 周齡時抽樣檢查糞便中是否感染任何球蟲，確保其未感染。

pET28a-EDA-EmIMP1 和 pET28a-EmIMP1 重 組質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建保存；1012 枯草芽孢桿菌菌株和pHT01 質(zhì)粒均購自普健生物(武漢)科技有限公司；pEASY-Blunt Simple 載體、Trans1-T1 抗噬菌體化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒、PVDF 膜、His 小鼠源單克隆抗體(MAb)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG (IgG-HRP)均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA 連接試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；IL-10 和IL-4 細(xì)胞因子檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

E.maxima卵囊(新疆株)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)索勛教授惠贈，通過復(fù)壯之后保存于本實驗室，接種前通過活雞活化復(fù)壯，并觀察其數(shù)量和活性。

1.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中EmIMP1 基因序列(FN813227)，參考pHT01 質(zhì)粒中的酶切位點，設(shè)計擴(kuò)增EmIMP1 和EDA-EmIMP1 基因的引物，引入下列酶切位點(劃線部分)：XbaⅠ和AatⅡ：EmIMPI-XbaⅠ-5：TCTAGAATGGGGGCCGC TTGCGGGAAATC；EmIMPI-AatⅡ-3：GACGTCTCA GTGGTGGTGGTGGTGTGGTGATC； EDA-EmIMPIXbaⅠ -5： TCTAGAATGAACATTGATCGCCCTAAA GGACT； EDA-EmIMPI-AatII-3： GACGTCTCAGTG GTGGTGGTGGTGGTGATC。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 重組枯草芽孢桿菌的制備 根據(jù)本實驗室保存的 pET28a-EDA-EmIMP1 和 pET28a-EmIMP1 重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物電泳后回收目的片段EDA-EmIMP1 和EmIMP1，連接至克隆載體進(jìn)行測序。測序正確后將EDA-EmIMP1 和EmIMP1 酶切，分別連接至枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pHT01，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pHT01-EDA-EmIMP1 和 pHT01-EmIMP1。將其分別轉(zhuǎn)化至Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞后接種含Amp抗性的LB 液體培養(yǎng)基搖菌培養(yǎng)，利用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序鑒定正確后，參照文獻(xiàn)[12]方法分別轉(zhuǎn)化1012 枯草芽孢桿菌。經(jīng)PCR 鑒定為陽性的菌株利用Chl 抗性的2×YT 液體培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)。

1.4 重組枯草芽孢桿菌蛋白表達(dá)的western blot 鑒定 分別將轉(zhuǎn)化 pHT01-EDA-EmIMP1 和 pHT01-EmIMP1 的重組枯草芽孢桿菌的菌液培養(yǎng)至OD595nm約為0.6 時，加入終濃度為1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)過夜。離心后收集菌體超聲裂解，4 ℃10 000 r/min 離心10 min，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，以His 小鼠源MAb (1∶10 000)為一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1∶10 000)為二抗，進(jìn)行 western blot 分析。

1.5 動物免疫實驗 將實驗雞分為5 組，每組10只：EDA 組(免疫pHT01-EDA-EmIMP1 重組枯草芽孢桿菌)、EmIMP1 組(免疫 pHT01-EmIMP1 重組枯草芽孢桿菌)、枯草芽孢桿菌組、空白組(PBS)和攻蟲對照組(PBS)。

免疫前一天禁食，每組雞口服相應(yīng)菌液(0.3 mL 1010cfu/mL 菌液/ 只)，每隔2 周免疫 1 次，共免疫3 次，每次免疫2 周后采血。

1.6 各組雞EmIMP1 抗體效價的ELISA 檢測 采用 100 μL/ 孔的 EmIMP1 抗原蛋白(4 μg/mL)包被 96孔板，將各組三免后分離的血清分別按 1 ∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1 ∶12 800 梯度濃度稀釋后作為一抗，以羊抗鼠IgG-HRP (1∶10 000)為二抗，進(jìn)行 ELISA 檢測[1]雞血清中抗EmIMP1 特異性抗體效價。

1.7 各組雞血清中IL-10 和IL-4 含量的檢測 按照IL-10 和IL-4 的試劑盒說明書檢測免疫后不同時間的血清，利用“Curve Expert”軟件分析實驗結(jié)果。

1.8 攻蟲試驗 將空白組隔離飼養(yǎng)，其余組每只雞灌喂約2×104個高活性E.maxima卵囊。收集攻蟲后5 d～9 d 的雞糞進(jìn)行卵囊計數(shù)，第5 d 迫殺所有實驗雞觀察腸道病變并計分，并稱量灌喂球蟲時雞的體重和10 d 后的體重，并計算抗球蟲指數(shù)ACI[13]。

2 結(jié) 果

2.1 EDA-EmIMP1 和EmIMP1 基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 將PCR 擴(kuò)增得到的目的片段EDA-EmIMP1 和EmIMP1 分別克隆于pHT01，構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR 鑒定，結(jié)果顯示分別有與 EmIMP1 (1 160 bp)和 EDA-EmIMP1 (1 446 bp)基因大小相符的特異性條帶(圖1)，表明正確構(gòu)建重組質(zhì)粒pHT01-EDA-EmIMP1 和pHT01-EmIMP1。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR 鑒定結(jié)果Fig.1 Amplifications of EmIMP1 and EDA-EmIMP1 genes by PCR

2.2 重組枯草芽孢桿菌的制備與鑒定 將轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒 pHT01-EDA-EmIMP1 和 pHT01-EmIMP1 的枯草芽孢桿菌菌液經(jīng)PCR 鑒定，結(jié)果顯示存在與預(yù)期相符的條帶(圖2)，表明正確構(gòu)建了含有pHT01-EDAEmIMP1 和pHT01-EmIMP1 的重組枯草芽孢桿菌。

圖2 pHT01-EDA-EmIMP1/B.subtilis 和pHT01-EmIMP1/B.subtilis 的 PCR 鑒定Fig.2 Identification of the pHT01-EDA-EmIMP1/B.subtilis and pHT01-EmIMP1/B.subtilis by PCR

2.3 重組枯草芽孢桿菌重組表達(dá)蛋白的western blot 鑒定 將轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pHT01-EDA-EmIMP1和pHT01-EmIMP1 的枯草芽孢桿菌分別誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行western blot 鑒定，結(jié)果顯示在約70 ku 處有特異性條帶，由于EDA 的片段較小，所以兩種蛋白的條帶均在70 ku 左右，與目的條帶片段相符(圖3)。表明了這兩種重組蛋白均可以在枯草芽孢桿菌中正確表達(dá)。

圖3 Western blot 鑒定重組枯草芽孢桿菌重組蛋白的表達(dá)Fig.3 Identification of recombinant protein expressions from the B.subtilis by western blot

2.4 各組雞血清中EmIMP1 抗體效價的ELISA 檢測結(jié)果 利用ELISA 方法檢測三免后雞血清中EmIMP1 抗體的效價，結(jié)果顯示 1∶3 200 稀釋度時EDA 組和EmIMP1 組的OD450nm值依舊大于PBS 組，其中EDA 組的 OD450nm值稍高于 EmIMP1 組，而枯草芽孢桿菌組僅高于PBS 組(圖4)。表明重組枯草芽孢桿菌可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，并且佐劑EDA 對雞體液免疫的提高更顯著。

圖4 各組雞三免后抗EmIMP1 抗體效價的檢測結(jié)果Fig.4 The titration of the antibody against EmIMP1 after the 3rd immunization

2.5 各組雞血清中IL-10 和IL-4 細(xì)胞因子含量的檢測結(jié)果 利用相應(yīng)試劑盒檢測各組雞免疫后不同時間的血清中IL-10 和IL-4 細(xì)胞因子含量。結(jié)果顯示，一免后各組雞IL-10 和IL-4 細(xì)胞因子含量差異不顯著，EDA 組雞IL-10 含量稍高。二免后EDA 組雞IL-10 含量顯著高于其它組，EmIMP1 組其次。三免后EDA 組雞IL-10 細(xì)胞因子含量依舊最高。二免后EDA 組IL-4 細(xì)胞因子含量稍高于其它組；三免后EDA 組的細(xì)胞因子濃度顯著提升，并顯著高于其它組，而枯草芽孢桿菌組其次，EmIMP1 組濃度稍高于 PBS 組(圖5)。表明 EmIMP1 基因單獨在pHT01 載體中呈遞的效果較差，需要EDA 佐劑才能更好的遞呈。

圖5 各組雞IL-10(A)和IL-4(B)含量檢測結(jié)果Fig.5 The concentration of IL-10 (A) and IL-4 (B)

2.6 攻蟲后各組雞卵囊計數(shù)、腸道病變計分、平均增重結(jié)果 對各組實驗雞攻蟲后收集雞糞進(jìn)行卵囊計數(shù)，結(jié)果顯示，EDA 組減少率最高，其次是EmIMP1 組，而枯草芽孢桿菌組最低，各組的數(shù)據(jù)有顯著差異，表明EDA 分子佐劑的加入對減少卵囊排出中有顯著的效果。攻蟲后第5 d 迫殺雞觀察腸道病變并計分，結(jié)果顯示EDA 組病變最輕，攻蟲組病變最嚴(yán)重，EmIMP1 組和枯草芽孢桿菌組差異不顯著，但對腸道均起到一定保護(hù)作用，其中EDA 組對腸道保護(hù)效果最好。增重實驗結(jié)果顯示，各組雞攻蟲后，EDA 組在10 d 內(nèi)增重最多，平均增重顯著高于其它組，EmIMP1 組其次，攻蟲組和枯草芽孢桿菌組增重最少，但EmIMP1 組和枯草芽孢桿菌組差異不顯著。EDA 組的抗球蟲指數(shù)ACI 計算結(jié)果為187，空白對照組為200，其它各組均比較低(表1)。表明EDA 佐劑可以提高球蟲EmIMP1 抗原的免疫保護(hù)效果。

表1 各組雞攻蟲后球蟲卵囊計數(shù)、腸道病變計分、平均增重結(jié)果Table 1 The result of oocyst output, intestinal lesion score and the average weight gain

3 討 論

本研究利用枯草芽孢桿菌表達(dá)E.maxima的免疫保護(hù)抗原EmIMP1 以及佐劑分子EDA，研究該重組疫苗激發(fā)的免疫反應(yīng)及其對E.maxima感染的免疫保護(hù)作用。結(jié)果顯示，含有EDA 分子佐劑的重組疫苗激發(fā)的抗體反應(yīng)以及細(xì)胞因子反應(yīng)更強(qiáng)，對E.maxima的感染可以起到更好的抵抗作用。由此表明，枯草芽孢桿菌具有作為球蟲活疫苗載體的潛力。而分子佐劑的加入可以更好的促進(jìn)疫苗的免疫保護(hù)效果。

E.maxima是一種腸道原蟲，機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫在控制該蟲感染的過程中均起重要作用[1]。本研究中，EDA 組免疫雞的抗體效價顯著高于其它組，說明EDA 分子佐劑可以激發(fā)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答，這與前人的研究結(jié)果一致。Femel 等將EDA與細(xì)菌硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)的融合蛋白接種至乳腺癌小鼠體內(nèi)后，小鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生高效價的抗EDA 抗體[14]。這些結(jié)果表明，EDA 分子佐劑在促進(jìn)機(jī)體抗體應(yīng)答方面具有一定的作用。

細(xì)胞因子是免疫細(xì)胞活化后分泌的，不同的細(xì)胞因子在抵抗病原過程中起著不同的作用。本研究中，三免后，EDA 組的IL-10 和IL-4 的水平高于其它各組，由于IL-4 和IL-10 是Th2 型細(xì)胞因子，其水平的高低和抗體反應(yīng)呈正相關(guān)。IL-4 可以促進(jìn)B細(xì)胞的活化，進(jìn)而促進(jìn)抗體應(yīng)答的產(chǎn)生。IL-10 在球蟲感染致病中起著一定的作用，由于IL-10 可以抑制INF-γ 的分泌以及NO 的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)。而適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)對于機(jī)體抵抗球蟲的感染是有利的。但炎癥反應(yīng)過強(qiáng)可以造成機(jī)體的損傷，反而不利于機(jī)體抗球蟲。因此，本研究中IL-10在抗球蟲感染過程中的作用還值得深入研究。

枯草芽孢桿菌能調(diào)節(jié)動物腸道微生態(tài)，增強(qiáng)免疫力，分泌多種消化酶，促進(jìn)動物生長性能及抗氧化能力，還可以作為疫苗活載體，表達(dá)和運送外源抗原，激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答[15-16]。目前，枯草芽孢桿菌作為抗原呈遞系統(tǒng)研究出現(xiàn)良好的應(yīng)用前景，由于該菌生活在動物的腸道，可以直接把外源抗原攜帶到動物的腸道黏膜部位，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較好的黏膜免疫。而良好的黏膜免疫應(yīng)答對于球蟲病的控制是至關(guān)重要的。因此，枯草芽孢桿菌具有作為球蟲病疫苗活載體的潛力。至于活載體微生物轉(zhuǎn)入的基因是否存在安全隱患，有待長期觀察與實驗評估。