TRIM21蛋白結(jié)構(gòu)及其應(yīng)答病原感染的研究進(jìn)展

石鈞戈，周作勇,2*，王芝英,2*

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶榮昌402460；2.重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心，重慶榮昌402460)

TRIM (Tripartite motif)蛋白家族是一系列細(xì)胞內(nèi)具有廣泛生物學(xué)活性的蛋白，約有80 多種。其中TRIM21 蛋白在各種類型細(xì)胞，特別是某些免疫細(xì)胞如T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中廣泛表達(dá)[1]。TRIM21 最先作為自身抗原被發(fā)現(xiàn)，又稱為Ro52/SS-A，常引起干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥等自身免疫病[2]。隨著對(duì)TRIM21 蛋白結(jié)構(gòu)和功能的深入研究發(fā)現(xiàn)TRIM21 蛋白具有E3 泛素連接酶活性，并在固有免疫和適應(yīng)性免疫的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。TRIM21 蛋白是目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)細(xì)胞漿內(nèi)IgG 受體[3]，其介導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞內(nèi)中和反應(yīng)(Antibody-dependent intracellular neutralization，ADIN)拓寬了人們對(duì)中和反應(yīng)的認(rèn)識(shí)。此外，TRIM21 蛋白還在固有免疫中調(diào)控多種細(xì)胞因子的分泌。本文主要介紹TRIM21 的分子結(jié)構(gòu)和其介導(dǎo)的ADIN 以及調(diào)節(jié)固有免疫的作用。

1 TRIM21蛋白的結(jié)構(gòu)

人源TRIM21 蛋白的分子量為52 ku，共含有475 個(gè)氨基酸，內(nèi)含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域(圖1A)。其氨基端包含的RBCC 結(jié)構(gòu)域(RING-finger、B-box 和 Coiled-coil 結(jié)構(gòu)域)是TRIM 蛋白家族具有的保守特征之一[4]。RING-finger 結(jié)構(gòu)域具有泛素化活性，是TRIM21 作為E3 泛素連接酶參與細(xì)胞代謝途徑的基礎(chǔ)，該結(jié)構(gòu)域中保守的半胱氨酸和組氨酸殘基形成兩個(gè)鋅離子結(jié)合位點(diǎn)。B-box 結(jié)構(gòu)域也可以和鋅離子結(jié)合，鋅離子可能對(duì)維持該蛋白三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定有重要作用[5]。B-box 是TRIM 蛋白家族特有的一種高度保守的功能結(jié)構(gòu)域，約由40 個(gè)氨基酸殘基組成，分為B-box1 和B-box2 兩種類型。該結(jié)構(gòu)域能夠在氨基酸短序列中形成復(fù)雜且多樣化的結(jié)構(gòu)，可能是研究生物進(jìn)化的良好素材。TRIM21 的B-box 結(jié)構(gòu)域由3 條β 折疊股和一個(gè)α 螺旋片段按 ββαβ 順序形成類似 RING-finger 結(jié)構(gòu)域的折疊[6]，該結(jié)構(gòu)與E2 泛素結(jié)合酶競(jìng)爭(zhēng)RING-finger 中的結(jié)合位點(diǎn)，從而調(diào)控TRIM21 蛋白的泛素化活性[7]。此外，有研究表明 TRIM21 的 B-box 與 RING-finger 結(jié)構(gòu)域結(jié)合的同時(shí)還可以和coiled-coil 結(jié)構(gòu)域結(jié)合[6]，但它們之間的相互作用關(guān)系及功能尚不完全清楚。Coiled-coil 結(jié)構(gòu)域是具有多個(gè)α 螺旋相互纏繞形成的超二級(jí)結(jié)構(gòu)，其能夠促進(jìn)TRIM21 分子的同源二聚化，定位其它結(jié)構(gòu)域形成高度有序且穩(wěn)定的大分子聚合體，參與對(duì)底物的識(shí)別和泛素化過(guò)程[8]。

TRIM21 蛋白的羧基端是由PRY 和SPRY 兩個(gè)子結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的一個(gè)具有結(jié)合和識(shí)別功能的PRYSPRY 結(jié)構(gòu)域，分別長(zhǎng)約60 和150 個(gè)氨基酸殘基[9]。James 等研究表明PRYSPRY 是一個(gè)近似球形的三維立體折疊結(jié)構(gòu)，內(nèi)含一個(gè)由兩個(gè)反向平行的β 折疊構(gòu)成的扭曲β- 三明治結(jié)構(gòu)；同時(shí)，研究闡明了TRIM21 分子通過(guò)PRYSPRY 與IgG 分子Fc 片段結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子生物學(xué)過(guò)程[10]。PRYSPRY 和免疫球蛋白一樣是具有氨基酸組成和排列順序高度可變的序列，PRYSPRY 在PRY 和SPRY 子結(jié)構(gòu)域中形成兩個(gè)與抗體Fc 片段結(jié)合的位點(diǎn)，PRY 位點(diǎn)僅和免疫球蛋白分子的CH2 區(qū)域結(jié)合，而 SPRY 位點(diǎn)則結(jié)合CH3 區(qū)域(圖1B)，并且單個(gè) TRIM21 分子的 PRYSPRY 結(jié)構(gòu)域僅與免疫球蛋白分子的一條重鏈結(jié)合[10]。二聚體TRIM21 蛋白則可以同時(shí)結(jié)合IgG 分子的兩條重鏈，該結(jié)合方式使得TRIM21 蛋白對(duì)抗體的識(shí)別更加準(zhǔn)確迅速[11]。

圖1 TRIM21 蛋白的結(jié)構(gòu)

2 TRIM21蛋白的功能

2.1 TRIM21 介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞內(nèi)中和反應(yīng)(ADIN)抵抗病毒感染 病毒中和反應(yīng)被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)阻止病毒吸附和侵入細(xì)胞的重要機(jī)制，該機(jī)制通過(guò)抗體與病毒表面的粘附作用或與細(xì)胞毒性抗原決定簇結(jié)合使病毒喪失活性，從而保護(hù)機(jī)體免受病毒侵害。長(zhǎng)期以來(lái)，中和反應(yīng)被局限地理解為抗體與病毒單純?cè)诩?xì)胞外發(fā)生結(jié)合，且不需要其它效應(yīng)分子的參與[9,12]，直到發(fā)現(xiàn)TRIM21 蛋白與IgG 的相互作用[13]才有了新的認(rèn)識(shí)。已有研究顯示并非所有的抗體與病毒結(jié)合均具有中和效應(yīng)，病毒粒子被非中和抗體結(jié)合后可能仍然具有侵染細(xì)胞的能力[3]。這些攜帶有非中和抗體的病毒進(jìn)入細(xì)胞后被胞漿內(nèi)的TRIM21 蛋白識(shí)別引起TRIM21 蛋白自身泛素化，激活蛋白酶體清除病毒并促進(jìn)一系列免疫信號(hào)分子的表達(dá)，這一過(guò)程被稱為抗體依賴的細(xì)胞內(nèi)中和反應(yīng)(Antibody-dependent intracellular neutralisation，ADIN)[12]。隨著對(duì)TRIM21 蛋白結(jié)構(gòu)與功能探索的深入，ADIN 的機(jī)制也越來(lái)越清楚。

當(dāng)被抗體“標(biāo)記”的病毒進(jìn)入細(xì)胞漿后，二聚體TRIM21 分子便通過(guò)其PRYSPRY 結(jié)構(gòu)域結(jié)合到病毒上抗體Fc 片段，該過(guò)程激活了TRIM21 分子的E3 泛素連接酶活性?；罨蟮腡RIM21 蛋白在E2 泛素結(jié)合酶等的作用下自身多聚泛素化，形成含有K63 泛素鏈(K63-linked ubiquitin chains)和 K48 泛素鏈的 TRIM21 分子[3,14]。而病毒粒子或抗體是否也會(huì)被泛素化還有待進(jìn)一步研究[3]。隨著泛素化過(guò)程的進(jìn)行，大量的蛋白酶體聚集并溶解TRIM21-抗體-病毒復(fù)合物。溶解過(guò)程不僅與K48 泛素鏈的活性有關(guān)，還需要含纈酪肽蛋白(Valosin containing protein，VCP)的參與[15]，VCP 可以促進(jìn)蛋白酶體對(duì)底物的識(shí)別和降解[16]。TRIM21-抗體-病毒復(fù)合物溶解后釋放出游離的K63 泛素鏈，激活 NF-κB、AP-1、IRF3、IRF5 和 IRF7 等免疫相關(guān)信號(hào)通路，釋放 IL-6、CCL4、TNFα 和 IFNβ 等促炎細(xì)胞因子[3]，輔助機(jī)體免疫系統(tǒng)抵抗病原感染。同時(shí)，病毒粒子衣殼蛋白降解后釋放的核酸被 RIG-I(識(shí)別 RNA)和cGAS(識(shí)別DNA)識(shí)別，激活各種免疫相關(guān)信號(hào)通路，從而清除被釋放到細(xì)胞內(nèi)的病毒核酸[17](圖2)。

圖2 抗體依賴的細(xì)胞內(nèi)中和反應(yīng)通路圖(參考 Foss[11]等和 Watkinson[17]等繪制)

目前報(bào)道的能夠激活A(yù)DIN 而被清除的病毒均為無(wú)囊膜病毒，包括口蹄疫病毒(FMDV)、人腺病毒 5 型(hAdV5)[18-19]等。這可能是由于有囊膜病毒在侵入細(xì)胞時(shí)不將病毒表面的抗體帶入細(xì)胞漿，無(wú)法被胞內(nèi)的TRIM21蛋白所識(shí)別[18]。這在一定程度上也表明了TRIM21 蛋白的激活需要借助于抗體[3]。此外，TRIM21 蛋白還可以通過(guò)類似機(jī)制抵抗腸道沙門氏菌(salmonella enterica)感染[20]，提示ADIN 反應(yīng)對(duì)某些胞內(nèi)菌的清除也有重要意義。TRIM21 蛋白與其它的Fc 受體不同，它廣泛地結(jié)合各種不同類型的抗體分子，如IgA、IgG 和IgM[21]。理論上，凡是和抗體分子結(jié)合的病原微生物進(jìn)入胞漿被TRIM21 分子識(shí)別后均能夠引起ADIN，但乳頭瘤病毒衣殼蛋白L2的單克隆抗體不能激活A(yù)DIN，這表明TRIM21 對(duì)抗體的識(shí)別可能還存在更加復(fù)雜的機(jī)制。

在經(jīng)典中和反應(yīng)過(guò)程中，必須有足量的抗體與病毒上所有具有侵染或細(xì)胞毒性功能的表位結(jié)合才能發(fā)揮作用。而ADIN 僅需少量的抗體即可抵抗病毒侵入[22]。免疫系統(tǒng)被病原刺激后產(chǎn)生足量抗體需要一定時(shí)間，尤其在初次免疫的早期抗體含量往往較低，由此推測(cè)TRIM21 介導(dǎo)的ADIN 可能在針對(duì)胞內(nèi)病原產(chǎn)生初次免疫應(yīng)答的早期發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

2.2 TRIM21 參與固有免疫應(yīng)答 固有免疫是機(jī)體在長(zhǎng)期進(jìn)化中逐漸形成的抵御病原侵入的非特異性防御功能，其是免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，對(duì)適應(yīng)性免疫也有著重要的調(diào)控作用。TRIM21 蛋白不僅作為抗體的Fc 受體在細(xì)胞內(nèi)協(xié)調(diào)體液免疫，同時(shí)也是固有免疫中重要的信號(hào)分子。當(dāng)侵入機(jī)體的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)被相應(yīng)的模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別，TRIM21 蛋白作為多種模式識(shí)別受體的下游信號(hào)分子參與固有免疫應(yīng)答過(guò)程[23]。目前關(guān)于TRIM21在固有免疫中的研究主要集中在其與干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor，IRF)互作和炎癥調(diào)控方面。

Higgs 等發(fā)現(xiàn)TRIM21 參與IRF3 多聚泛素化并誘導(dǎo)蛋白酶體將其降解，從而抑制IFN-β 的產(chǎn)生[24]。這一結(jié)論在Manocha 等用流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)侵染人類小膠質(zhì)細(xì)胞(CHME3)的實(shí)驗(yàn)[25]中得到證實(shí)。但有研究顯示在水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)和雞新城疫病毒 (Newcastle disease virus，NDV)感染過(guò)程中TRIM21 阻礙IRF3 的泛素化和降解，促進(jìn)干擾素的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體抗病毒能力[25]。以上相互矛盾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能與不同類型病毒感染、感染持續(xù)時(shí)間以及上游信號(hào)傳導(dǎo)途徑等實(shí)驗(yàn)條件差異有關(guān)[25]。在對(duì)IRF8 與TRIM21 蛋白互作的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的情況[26-27]。Kim等認(rèn)為在細(xì)胞被刺激的早期，TRIM21 蛋白能夠促進(jìn)IRF8的轉(zhuǎn)錄活性，隨著選擇性自噬接頭蛋白p62 (Sequestosome 1/p62，p62)表達(dá)量增加，在p62 調(diào)控下TRIM21 轉(zhuǎn)而促進(jìn)大量IRF8 泛素化，使其被蛋白酶體降解[27]。P62 的參與使得TRIM21 在感染的不同時(shí)期發(fā)揮不同的作用，TRIM21 調(diào)控IRF3 的過(guò)程中是否也有同樣的作用機(jī)制尚不清楚。此外，現(xiàn)已證實(shí)IRF7 和IRF5 可以被TRIM21 泛素化，進(jìn)而被蛋白酶體降解[28-29]。TRIM21 與IRF 互作是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，在TRIM21 泛素化IRF 的同時(shí)，IRF 也可以反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi) TRIM21 蛋白的表達(dá)[30]。TRIM21 蛋白通過(guò)與IRF 的互作，調(diào)節(jié)干擾素的生成，參與固有免疫系統(tǒng)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

除了與IRF 互作外，TRIM21 還與多種促炎細(xì)胞因子分泌有關(guān)。TRIM21 不僅能夠間接引起ADIN 反應(yīng)中炎癥相關(guān)通路激活，還能直接負(fù)調(diào)控NF-κB 依賴的炎癥通路，減少 IL-1、 IL-6、 TNFα和CXCL10的分泌[1]。此外，TRIM21 還可通過(guò)泛素化線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(MAVS)促進(jìn)白介素和促炎細(xì)胞因子的分泌。Lenart 等發(fā)現(xiàn)TRIM21 在CD16+單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中具有促炎癥反應(yīng)的“開關(guān)”功能，使炎癥反應(yīng)在應(yīng)答病原的過(guò)程中有序進(jìn)行[31]。TRIM21 還能通過(guò)調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的分泌抵抗胞內(nèi)寄生弓形蟲(Toxoplasma gondii)感染[32]。綜上，TRIM21作為連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵信號(hào)分子，對(duì)機(jī)體應(yīng)答病原感染有重要作用。

3 展 望

TRIM21 作為連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，建立起一道應(yīng)答病原侵入的新防線。目前，有關(guān)TRIM21 應(yīng)答病原感染機(jī)制的研究主要集中在病毒，而對(duì)其它胞內(nèi)寄生的病原微生物的研究還很少。此外，TRIM21 作為E3泛素連接酶能否直接引起病原體蛋白的泛素化還不得而知。對(duì)TRIM21 應(yīng)答病原機(jī)制的研究不僅有助于更好地認(rèn)識(shí)自身免疫系統(tǒng)，同時(shí)也為某些疾病提供了可能的臨床診療方法。首先，基于ADIN 殺滅胞內(nèi)病原的機(jī)理，可以通過(guò)某些技術(shù)使抗體進(jìn)入胞內(nèi)并激活A(yù)DIN 清除胞內(nèi)病原，從而制備更加高效的中和抗體。目前，已有研究將乙型肝炎病毒(HBV)的單克隆抗體與細(xì)胞穿透肽結(jié)合，使該抗體能夠穿過(guò)細(xì)胞膜與胞內(nèi)病毒結(jié)合，激活TRIM21 介導(dǎo)的ADIN 反應(yīng)而清除病毒，在體內(nèi)外均取得了較好的抗感染效果[33]。其次，TRIM21 蛋白作為固有免疫中重要的信號(hào)分子，其必然與某些感染性疾病之間存在一定的聯(lián)系，能否將TRIM21 作為生物標(biāo)志分子指示某些疾病的發(fā)生？目前在結(jié)核病和病毒性呼吸道感染中已有相關(guān)的研究，但均未取得令人滿意的結(jié)果[33]。該方向的探索可能對(duì)其它某些疾病的診斷具有重要的意義。此外，有研究發(fā)現(xiàn)TRIM21參與SALL4(Sal-like protein 4)的降解從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[34]，其能否為腫瘤治療提供新方法還有待進(jìn)一步探究。