健康豬體內(nèi)塞尼卡病毒的分離和鑒定

張 志，張麗麗,2，張美晶，劉 爽，張 峰，董雅琴，張 慧，崔 進(jìn)，吳發(fā)興，李曉成*

(1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266019)

塞尼卡病毒(Senecavirus A，SVA)，曾用名為塞尼卡谷病毒(Seneca Vally virus，SVV)，是最近發(fā)現(xiàn)的一種引起豬感染和發(fā)病的小核糖RNA 病毒。2014年，國際病毒分類委員會在小核糖RNA 病毒科(Picornaviridae)下新增一個塞尼卡病毒屬(Senecavirus)，SVA 是該屬唯一的病毒[1]。作為單股正鏈不分節(jié)段的RNA 病毒，SVA 的直徑約為27 nm，基因組大小約為7.3 kb。在結(jié)構(gòu)上，SVA 與其它小RNA 病毒類似，基因組也由5' 端、3' 端和一個大的開放閱讀框(ORF)組成，且ORF 編碼一個由2181 aa 組成的多聚蛋白前體，多聚蛋白前體進(jìn)一步可水解形成VP1～VP4 等 4 個結(jié)構(gòu)蛋白和 7 個非結(jié)構(gòu)蛋白[1]。SVA 最初發(fā)現(xiàn)于PER.C6 的細(xì)胞培養(yǎng)物中，但直到2012 年才發(fā)現(xiàn)SVA 可以引起豬的水泡樣病變，感染豬的鼻吻部、蹄部冠狀帶等出現(xiàn)明顯水泡[2]，在臨床上與口蹄疫、豬水泡性口炎、豬水皰病、豬水泡性疹等疾病的病變十分相似[3]。美國首先報道了SVA 引起的水皰病，其后，加拿大、巴西、中國、泰國、哥倫比亞等養(yǎng)豬業(yè)比較發(fā)達(dá)的國家陸續(xù)也從出現(xiàn)水泡病的豬病料中檢測到SVA[4-8]。2015 年，我國首次報道廣東某豬場發(fā)生塞尼卡病，不久之后，湖北、福建、河南、黑龍江等省的豬場先后檢測到了SVA，這意味著SVA 在我國豬場的感染已經(jīng)相當(dāng)廣泛[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)室前期對我國健康豬群進(jìn)行了SVA 的流行病學(xué)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)部分屠宰場的外觀健康豬群也存在SVA 感染，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了SVA 病原的分離鑒定和分子流行特征分析，結(jié)果從這些SVA陽性樣品中分離到了2 株SVA，為后續(xù)的疫苗研制等研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品及其來源 10 份SVA 陽性樣品來源自廣西壯族自治區(qū)某屠宰場屠宰的生豬，采樣豬外觀健康，沒有明顯的臨床發(fā)病癥狀和病理剖檢變化，樣品經(jīng)熒光定量RT-PCR 鑒定為SVA 陽性，放置在-70 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 BHK-21 細(xì)胞由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心畜病監(jiān)測室保存。Premix ExTaq酶、一步法 RT-PCR 試劑盒、pMD18-T 載體和 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞均購自寶生物工程(大連)有限公司；TRIzol試劑、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶等均購自life 公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank 中登錄的SVA 病毒株(NC_011349)的VP1 基因序列設(shè)計(jì)一對引物(SVA-VP1-F：ACTCTCCGTCTCCCCGTTGATTG TAAT/SVA-VP1-R：TGGGTTGTCAGAAGCAGGACC AGGATT)，用于SVA 的VP1 基因擴(kuò)增，擴(kuò)增特異性序列預(yù)期884 bp。

1.4 病毒的分離培養(yǎng)及效價測定 取10 份SVA 陽性樣品稱重后加入 4 倍體積的 PBS (0.01 mol/L，pH7.2)進(jìn)行研磨，以8 000 r/min 離心5 min，取上清液，用0.22 μm 無菌濾器過濾后加入到生長良好的單層BHK-21 細(xì)胞中，同時用PBS 空白作為陰性對照。接種3 d 后將細(xì)胞反復(fù)凍融3 次，繼續(xù)接種新的BHK-21 細(xì)胞，如此連續(xù)盲傳5 代，記錄細(xì)胞病變(CPE)，對分離的病毒用 96 孔板測定病毒的TCID50。

1.5 RNA 的提取 取接種BHK-21 細(xì)胞后出現(xiàn)明顯CPE 的細(xì)胞上清液，按照TRIzol 試劑的操作說明書提取總RNA。同時，對照組BHK-21 細(xì)胞的上清液也按照此法提取RNA。

1.6 SVA 分離株 VP1 基因的擴(kuò)增、測序及結(jié)果分析 以1.4 分離病毒提取的RNA 為模板，按照一步法RT-PCR 試劑盒說明書和1.3 中的引物擴(kuò)增SVA的VP1 基因，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后克隆于pMD18-T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 接感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑鑒定后挑選白斑提取重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，陽性克隆由寶生物工程(大連)有限公司測序。選擇GenBank 中已登錄的SVA 基因序列作為參考株序列，利用DNAStar 和Clustalw1.83 等軟件進(jìn)行核苷酸序列比對、同源性分析，利用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并以Bootstrap 值1000 驗(yàn)證進(jìn)化樹的可信度。

1.7 SVA 分離病毒上清液中其它病原的檢測 利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的方法[11]，同時檢測該陽性樣品和分離病毒上清中是否存在豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒、牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬乙型腦炎病毒等。參考《OIE 陸生動物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊》 提供的口蹄疫病毒(FMDV)檢測方法，檢測分離培養(yǎng)的細(xì)胞上清中是否含有FMDV。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果 10 份SVA 陽性樣品接種BHK-21 后的第一代和第二代接種細(xì)胞均無明顯的CPE，但接種第 3 代后 GXT91 和 GXT94 等 2 份樣品出現(xiàn)了輕微的CPE。繼續(xù)盲傳到第5 代時，仍僅接種 GXT91 和 GXT94 的 BHK-21 細(xì)胞可以觀察到明顯的CPE，顯微鏡下可見大量細(xì)胞變圓、皺縮、死亡和脫落，而對照組BHK-21 細(xì)胞形態(tài)和單層均較好，同時其它8 份樣品接種的BHK-21 細(xì)胞均未出現(xiàn)明顯的CPE。表明可以用BHK-21 細(xì)胞分離和培養(yǎng)SVA，并且SVA 在BHK-21 細(xì)胞中經(jīng)過連續(xù)3代盲傳后就能夠產(chǎn)生典型的特征性CPE，與其它病毒引起的CPE 存在明顯差異。進(jìn)一步將收獲的SVA病毒株GXT94 的第5 代病毒進(jìn)行TCID50測定，效價為107.6/mL。有研究發(fā)現(xiàn)，SVA 對腫瘤具有很高的專嗜性，可以溶解小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、小兒神經(jīng)內(nèi)分泌癌細(xì)胞等，曾用于腫瘤的靶向治療[12]，但有關(guān)SVA 的細(xì)胞培養(yǎng)特性開展得研究不多，本研究采用BHK-21 細(xì)胞從樣品中分離培養(yǎng)得到2 株SVA，為SVA 的分離培養(yǎng)提供了一條可行的技術(shù)路徑。

2.2 SVA VP1 基因的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果 GXT91和GXT94 接毒后的第5 代上清液與相應(yīng)的陽性樣品提取的 RNA 分別進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示GXT91 和 GXT94 的第 5 代細(xì)胞上清液與 GXT94 原始樣品均可以擴(kuò)增出一條約900 bp 的特異性條帶，而GXT91 原始樣品、空白對照和BHK-21 陰性對照樣品均無特異性條帶擴(kuò)增(圖1)，這可能與原始樣品GXT91 中SVA 的含量較少有關(guān)。前期對樣品初篩時采用的是熒光定量RT-PCR 方法，而本次檢測時采用了 RT-PCR 方法， 導(dǎo)致樣品 GXT91 用RT-PCR 檢測時呈現(xiàn)陰性，但經(jīng)過5 代連續(xù)傳代以后，其上清液用RT-PCR 檢測到明顯的特異性條帶。測序結(jié)果顯示，GXT91 和GXT94 的VP1 基因序列均為884 bp，與預(yù)期大小一致，表明 GXT91 和GXT94 接種BHK-21 的上清液中均存在 SVA 的增殖。對GXT91 和GXT94 的第5 代細(xì)胞上清液分別進(jìn)行豬瘟、口蹄疫等外源病原的檢測，結(jié)果均為陰性，表明這種BHK-21 產(chǎn)生的典型CPE 是由SVA 引起的，而非其它病原感染的結(jié)果。

圖1 SVA 樣品及細(xì)胞培養(yǎng)上清液的RT-PCR 檢測結(jié)果Fig.1 Detections of SVA from the samples and their cell culture supernatant by RT-PCR

2.3 GXT91 和GXT94 分離株 VP1 基因的序列分析 同源進(jìn)化分析結(jié)果顯示，GXT94 和GXT91 與SVA 參考病毒株NC_011349 VP1 基因的同源性為90.2 %～90.6 %，推導(dǎo)氨基酸同源性為96.7 %～97.1 %；與其它SVA 株的核酸同源性為92.8 %～97.4 %，推導(dǎo)氨基酸同源性為98.2 %～100 % (圖2)。表明本研究分離的病毒確實(shí)是SVA，但這兩株SVA 分離株與目前SVA 參考株的核酸序列存在一定差異。進(jìn)一步分析SVA 的遺傳變異性發(fā)現(xiàn)，新出現(xiàn)的SVA 株與參考株NC_011349 之間的同源性顯著降低，僅為90.2 %～90.6 %，低于其它病毒株與NC_011349 的同源性，表明分離病毒株VP1 基因已發(fā)生明顯的變異。但所有SVA 株之間推導(dǎo)氨基酸的同源性卻較高，提示SVA 的核酸突變多為無義突變，這些突變集中發(fā)生在氨基酸的第二或第三核苷酸的位置，對編碼的氨基酸類別影響較小，即對SVA 的生物學(xué)功能影響不大。但這種不斷增強(qiáng)的變異也提示要密切關(guān)注SVA 的分子演化狀況，防止核酸突變積累到一定程度引起病毒的生物學(xué)功能發(fā)生較大轉(zhuǎn)變。

同時，用SVA 的VP1 基因構(gòu)建的同源進(jìn)化樹也顯示，這些SVA 株可以分為兩個大的分支I 和II。SVA 最早的參考株NC_011349 以及美國、泰國和中國的部分病毒株屬于分支I，本研究分離的2 個病毒株以及哥倫比亞、美國和中國的部分病毒株屬于分支II，與NC_011349 參考株的遺傳距離較遠(yuǎn)(圖2)。這一結(jié)果提示，SVA 流行株的變異一直持續(xù)地進(jìn)行，新的病毒流行分支不斷出現(xiàn)。本研究中分離和鑒定的2 株SVA 與其它SVA 株之間呈現(xiàn)明顯差異，表明GXT91 和GXT94 形成的進(jìn)化分支可能又是一個新的流行分支。

圖2 SVA 分離株與參考株的VP1 基因序列進(jìn)化樹分析Fig.2 The evolutionary tree based on the VP1 gene sequences of the SVA isolates and reference strains

現(xiàn)有研究表明，豬的水泡病除了口蹄疫、豬水泡病、豬皰疹性口炎等以外，還與SVA 的感染密切相關(guān)[2,10]，但截止本文投稿為止，國內(nèi)外未見從健康豬群分離SVA 的報道。本研究結(jié)果表明在健康豬群中SVA 的感染仍然存在，不可忽視。