表達(dá)牛乳鐵蛋白肽的重組雞源乳酸桿菌抗IBDV感染的研究

林慶宇，師一鳴，宋麗影，李雪純，譚宏超，于淑媛，姜艷平,2，崔 文,2，喬薪瑗,2，王 麗,2，周 晗,2，徐義剛,2，李一經(jīng),2，唐麗杰,2*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省動物疾病防控技術(shù)與制劑創(chuàng)制實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

乳鐵蛋白(Lactoferrin，Lf)是廣泛存在于動物常乳、初乳及其它外分泌液和嗜中性粒細(xì)胞中的鐵結(jié)合蛋白。1939 年Sorensen 等首次從牛奶中分離出該蛋白[1]。研究顯示，Lf 與多種生物學(xué)功能和保護(hù)作用相關(guān)，包括腸道中鐵離子的吸收、抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥和抑菌作用等[2-5]。乳鐵蛋白肽是Lf 經(jīng)胰蛋白酶分解后產(chǎn)生的小肽，具有Lf 的全部生物學(xué)功能。牛乳鐵蛋白肽LFcin 和LFampin 分別由牛Lf 的aa17～aa41 和aa268～aa284 構(gòu)成，這兩段肽在結(jié)構(gòu)域和空間位置非常接近[6]，兩段肽均具有殺菌、抗病毒、抑制真菌及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等多種生物學(xué)功能。

傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBD 病毒(IBDV)感染產(chǎn)生的雛雞免疫抑制性疾病[7]，防控該病的主要措施是雛雞接種弱毒疫苗，但疫苗免疫對雛雞的法氏囊也存在一定的損傷[8]，探究以具有抗病毒功能的乳鐵蛋白肽對IBDV 感染的作用具有重要意義。

本研究利用實驗室構(gòu)建的表達(dá)牛乳鐵蛋白肽的重組雞源乳酸桿菌pPG-XLFEC/M11，檢測其在體外抑制IBDV 增殖的活性，并將重組菌飼喂雛雞，檢測其對雛雞抵抗IBDV 感染的作用，為表達(dá)牛乳鐵蛋白肽的重組雞源乳酸桿菌在生產(chǎn)中的應(yīng)用，及家禽綠色安全健康養(yǎng)殖提供理想的預(yù)防疾病途徑。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 電轉(zhuǎn)入重組表達(dá)質(zhì)粒pPG-XL FEC 的雞源乳酸桿菌(Lactobacillus saerimneri) M11菌株[9]pPG-XLFEC/M11、電轉(zhuǎn)入空載體的乳酸桿菌pPG/M11 菌株、IBDV 弱毒 CEF94 株、強(qiáng)毒UK661株、雞成纖維細(xì)胞DF-1 株和含IBDV CEF94 株VP3基因的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD19-T-VP3，均由本實驗室構(gòu)建并保存；1 日齡SPF 雛雞購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

牛乳鐵蛋白肽標(biāo)準(zhǔn)品(LFcin)購自武漢星皓生物科技有限公司；鼠抗牛乳鐵蛋白肽多克隆抗體由本實驗室制備并保存；兔抗Myc 單克隆抗體(MAb)和HRP 標(biāo)記山羊抗鼠及抗兔IgG(HRP-IgG)購自英濰捷基(上海)貿(mào)易公司；CCK-8 試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；RTAce 購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；dNTP、RRI 購自寶生物工程(大連)有限公司；FastStart Universal SYBR Green Master 購自 Roche 公司；Fast 2000 RNA 提取試劑盒購自迅捷生物有限公司；雞IgG 和SIgA 檢測試劑盒購自北京誠林生物科技有限公司。

1.2 重組菌pPG-XLFEC/M11 表達(dá)牛乳鐵蛋白肽的檢測 取2 mL 過夜培養(yǎng)的重組菌pPG-XLFEC/M11，離心后加入終濃度10 mg/mL 的溶菌酶，37 ℃1 h，超聲破碎后取上清，以兔抗Myc 標(biāo)簽MAb 為一抗(1∶2 000)，以山羊抗兔HRP-IgG (1∶5 000)為二抗，利用western blot 檢測上清中牛乳鐵蛋白肽的表達(dá)，同時以空載體乳酸桿菌pPG/M11 為陰性對照。

另以牛乳鐵蛋白肽標(biāo)準(zhǔn)品包被ELISA 板，鼠抗牛乳鐵蛋白肽多克隆抗體(1:400)為一抗，以山羊抗鼠HRP-IgG(1:5 000)為二抗，TMB 顯色后，測定OD450nm數(shù)值，繪制牛乳鐵蛋白肽濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同一濃度設(shè)置3 個重復(fù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算重組菌pPG-XLFEC/M11 上清中牛乳鐵蛋白肽的含量。

1.3 重組牛乳鐵蛋白肽的細(xì)胞毒性檢測 將DF-1細(xì)胞用0.25%胰酶消化后按2.5×105個/mL 接種于96孔板中，每孔100 μL，長至匯合度為90%。取重組菌培養(yǎng)6 h 后的破菌后上清，按照TCA 濃縮的方法[10]將牛乳鐵蛋白肽分別濃縮至2.728 mg/mL、1.364 mg/mL、0.682 mg/mL、0.341 mg/mL、0.1705 mg/mL 后，將pPG/M11 培養(yǎng)后的上清按照相同的方法濃縮至與重組菌表達(dá)乳鐵蛋白肽為2.728 mg/mL 相同的倍數(shù)(50倍)，分別加入DF-1 細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)96 h，同時設(shè)置相同濃度的化學(xué)合成肽(LFcin)作為陽性對照，同一個濃度設(shè)置5 個平行孔，根據(jù)CCK-8 試劑盒說明書檢測，分析重組菌表達(dá)的牛乳鐵蛋白肽對DF-1細(xì)胞的毒性作用。

1.4 重組牛乳鐵蛋白肽對IBDV 在DF-1 細(xì)胞內(nèi)增殖的影響 將96 孔板中長滿單層的DF-1 細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，取 100 μL TCID50為 10-4.372的 IBDV CEF94株分別與100 μL 濃縮后濃度為2.728 mg/mL 的pPG-XLFEC/M11 破菌后上清，100 μL 2.728 mg/mL 的化學(xué)合成肽(Lfcin)以及 100 μL 相同濃縮倍數(shù)的pPG/M11 的破菌后上清，在37 ℃、5 %的CO2預(yù)先作用1 h，再接種感染DF-1 細(xì)胞，同時設(shè)正常細(xì)胞組和IBDV 組作為對照，每組3 個平行孔，觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)IBDV 對照組發(fā)生50 %細(xì)胞病變時進(jìn)行CCK-8 檢測，計算感染病毒后的細(xì)胞活性。

利用陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD19-T-VP3，參照文獻(xiàn)方法[11]，建立IBDV 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。取各組細(xì)胞孔的培養(yǎng)液 100 μL，8 000 r/min 離心 5 min，利用 RNA 提取試劑盒提取上清液RNA 后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板進(jìn)行qPCR[12]分析各組中IBDV 核酸的拷貝數(shù)。

1.5 重組菌對雛雞抵抗IBDV 感染作用的檢測

1.5.1 IBDV 對雛雞的絕對致死量測定 選取16 只39 日齡SPF 雛雞，測定 IBDV 強(qiáng)毒株 UK661(EID50為10-4.5mL/ 只)對雛雞的絕對致死量。按照不同的感染方式設(shè)為4 組，分別為：口服400 EID50；口服300 EID50并滴鼻 100 EID50；口服 200 EID50并滴鼻200 EID50；口服100 EID50并滴鼻300 EID50。設(shè)置 7 d的觀察期，確定IBDV 對雛雞絕對致死量的條件。

1.5.2 雛雞飼喂重組菌pPG-XLFEC/M11 及IBDV 感染試驗 選取體質(zhì)量相近的1 日齡SPF 雛雞45 只，隨機(jī)分成 3 組，重組菌pPG-XLFEC/M11 組和空載體乳酸菌pPG/M11 組飼喂的活菌數(shù)均為2×109cfu/只(取1 mL 過夜培養(yǎng)的乳酸菌離心，用100 μL PBS重懸)，對照組飼喂等體積的PBS。自雛雞7 日齡開始飼喂，每次連續(xù)飼喂2 d，間隔10 d 飼喂一次，共3 次。在雛雞39 日齡時按照1.5.1 的絕對致死劑量條件感染IBDV UK661 株，當(dāng)對照組出現(xiàn)臨床癥狀時，從各組中分別選取5 只雛雞，心臟采血處死，剖檢取出肝臟、腎臟和法氏囊組織，經(jīng)4 %多聚甲醛固定，制備石蠟切片及HE 染色，觀察雛雞的組織病理學(xué)變化；取上述各組雛雞采血后的血清及刮取其盲腸的黏液，按照雞IgG 和SIgA 檢測試劑盒操作說明書，測定雞血清總IgG 與腸黏膜SIgA 抗體；采集3 組雞的盲腸扁桃體，經(jīng)液氮研磨后，利用試劑盒提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，以qRT-PCR 方法檢測TLR2、IFN-γ、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平[13]。將各組余下的10 只SPF 雞，設(shè)置5 d 的觀察期并計算其存活率。

2 結(jié) 果

2.1 重組牛乳鐵蛋白肽表達(dá)的檢測結(jié)果 重組菌pPG-XLFEC/M11 經(jīng)溶菌酶作用后，經(jīng)western blot檢測，在約16 ku 處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符，表明牛乳鐵蛋白肽在重組菌中獲得表達(dá)。

ELISA 方法繪制的牛乳鐵蛋白肽標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.459e0.8644x，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算本研究中重組乳酸桿菌表達(dá)的牛乳鐵蛋白肽含量為54.56 μg/mL。

圖1 重組牛乳鐵蛋白肽表達(dá)的檢測Fig.1 Identification of the recombinant bovine lactoferrin peptide expression

2.2 重組菌表達(dá)牛乳鐵蛋白肽的細(xì)胞毒性檢測 將重組菌表達(dá)的牛乳鐵蛋白肽按照不同濃度與DF-1細(xì)胞共培養(yǎng)96 h 后，利用CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞活性，結(jié)果顯示，重組菌表達(dá)的牛乳鐵蛋白肽含量達(dá)到2.728 mg/mL 時(TCA 濃縮上清50 倍)，測定的OD450nm數(shù)值與2.728 mg/mL 的化學(xué)合成牛乳鐵蛋白肽組、濃縮50 倍的空菌pPG/M11 上清組以及正常細(xì)胞對照組所測定的OD450nm數(shù)值相近(圖2)，表明各組間細(xì)胞活性相似，重組菌表達(dá)牛乳鐵蛋白肽對DF-1 細(xì)胞幾乎無毒性作用。

圖2 重組牛乳鐵蛋白肽對DF-1 細(xì)胞的毒性檢測Fig.2 Cytotocity of recombinant bovine lactoferrin peptide to DF-1 cells

2.3 重組菌表達(dá)牛乳鐵蛋白肽對IBDV 在DF-1 細(xì)胞內(nèi)增殖的抑制作用 將濃縮的重組菌破菌后上清與IBDV CEF94 株預(yù)處理1 h 后，再作用于DF-1 細(xì)胞，培養(yǎng)至病毒對照組出現(xiàn)CPE，利用CCK-8 法檢測細(xì)胞活性，結(jié)果顯示，重組菌組與空載體乳酸桿菌pPG/M11 組相比差異顯著(p＜0.05)，與病毒對照組相比差異極顯著(p＜0.01)，重組菌組可以顯著改善IBDV 感染引起的細(xì)胞活性降低，但其效果不如化學(xué)合成肽組明顯(圖3A)。分析各組中的病毒拷貝數(shù)，其中病毒對照組為105.02拷貝/μL，重組菌組為100.72拷貝 /μL，空載體乳酸菌為 102.18拷貝 /μL，化學(xué)合成肽(Lfcin)組為100.41拷貝/μL，重組菌組中IBDV的拷貝數(shù)明顯減少，與空載體乳酸桿菌pPG/M11 組相比差異顯著(p＜0.05)，與病毒對照組相比差異極顯著(p＜0.01) (圖3B)。表明重組牛乳鐵蛋白肽可以抑制IBDV 在DF-1 細(xì)胞內(nèi)的增殖。

圖3 重組牛乳鐵蛋白肽對IBDV 的抑制作用Fig.3 The inhibitation effect of the recombinant bovine lactoferrin peptide on IBDV

2.4 重組菌對雛雞抵抗IBDV 感染的檢測作用

2.4.1 重組菌對雛雞感染IBDV 后的組織病理學(xué)影響 將16 只健康的39 日齡SPF 雛雞隨機(jī)分為4組，按照不同的感染途徑和感染劑量感染IBDV 強(qiáng)毒株UK661，最終確定該病毒株絕對致死量的感染途徑和劑量為同時口服300 EID50及滴鼻100 EID50IBDV (圖4)。

按照以上確定的感染途徑和劑量接種感染IBDV 后，將各組雛雞心臟采血后處死，采集相應(yīng)臟器固定后，HE 染色觀察雛雞組織病理學(xué)變化情況。結(jié)果顯示，各組雛雞的肝臟、腎臟變化均不明顯；病毒對照組的法氏囊濾泡萎縮，淋巴細(xì)胞大量壞死，結(jié)締組織增生，巨噬細(xì)胞浸潤；空載體乳酸桿菌pPG/M11 組表現(xiàn)為濾泡萎縮，淋巴細(xì)胞大量壞死減少，結(jié)締組織增生，局部少量出血伴少量異嗜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤；而重組菌組的法氏囊濾泡只輕度萎縮，僅個別濾泡內(nèi)可見異嗜細(xì)胞浸潤(圖5)。表明飼喂表達(dá)牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸桿菌的雛雞可以在一定程度上抑制IBDV 強(qiáng)毒株感染對雛雞法氏囊組織的損傷作用。

圖4 39 日齡雛雞感染IBDV 絕對致死量的條件Fig.4 Absolute lethal dose of 39 days aged chicken challenged by IBDV

圖5 各組雛雞的組織病理學(xué)變化(100×)Fig.5 The histopathological changes of related organ tissues from each group of chicken (100×)

2.4.2 重組菌對雛雞免疫球蛋白及炎性細(xì)胞因子的影響 將試劑盒中提供的標(biāo)準(zhǔn)品按照說明書的劑量加入，酶標(biāo)儀檢測OD450nm的數(shù)值，繪制免疫球蛋白濃度與OD450nm數(shù)值的陽性標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算血清總IgG 和腸黏液SIgA 的含量。結(jié)果顯示，表達(dá)牛乳鐵蛋白肽的重組雞源乳酸桿菌可以有效的提高血清中總IgG 以及腸黏液中SIgA 水平，且血清中的總IgG抗體水平與空載體乳酸桿菌pPG/M11 組相比差異顯著(p＜0.05) (圖 6)。該組 TLR2 與細(xì)胞因子 IFN-γ、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的 mRNA 相對轉(zhuǎn)錄水平均增加，與空載體乳酸桿菌pPG/M11 組相比差異顯著(p＜0.05) (圖7)。表明雛雞飼喂表達(dá)牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸桿菌，可以增強(qiáng)雞體非特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫以及炎癥反應(yīng)信號通路的相關(guān)分子水平。

2.4.3 重組菌對IBDV 感染雛雞存活率的影響 雛雞感染試驗結(jié)果顯示，在IBDV 感染后的第5 d，對照組雛雞全部死亡，存活率為0。空載體乳酸桿菌pPG/M11 組雛雞的存活率為40 %，重組菌組雛雞的存活率為60 % (圖8)，表明重組雞源乳酸桿菌表達(dá)的牛乳鐵蛋白肽對雛雞具有一定的抵抗IBDV 感染作用。

圖6 重組菌對雛雞免疫球蛋白的影響Fig.6 Effect of recombinant Lactobacillus on immunoglobulin

圖7 盲腸扁桃體TLR2 和細(xì)胞因子的mRNA 相對水平Fig.7 Cytokines and TLR2 mRNA relative level in cecal tonsil

圖8 重組菌對IBDV 感染雛雞存活率的影響Fig.8 Effect of recombinant Lactobacillus on the survival rate of chicken against IBDV infection

3 討 論

許多學(xué)者認(rèn)為，理想的益生菌種最好是從本動物的腸道中分離出來的[11]，本研究采用表達(dá)牛乳鐵蛋白肽的重組雞源乳酸桿菌Lactobacillus saerimneriM11 為基因工程菌株，M11[9]是從雛雞體內(nèi)分離篩選得到的，具有較強(qiáng)耐酸、耐膽鹽以及較好定植能力。由于牛乳鐵蛋白肽的表達(dá)載體是組成型表達(dá)載體，因此牛乳鐵蛋白肽的表達(dá)無需額外添加誘導(dǎo)劑[14]。經(jīng)TCA 濃縮，濃度達(dá)到2.728 mg/mL 的重組雞源乳酸桿菌pPG-XLFEC/M11 破菌后上清對DF-1 細(xì)胞幾乎無毒性，說明重組菌表達(dá)乳鐵蛋白肽的濃度在2.728 mg/mL 時，DF-1 細(xì)胞的生長以及生理活性幾乎未受到影響。因此，以2.728 mg/mL 為工作濃度，檢測重組雞源乳酸桿菌pPG-XLFEC/M11 對IBDV 在DF-1 細(xì)胞內(nèi)增殖的影響。乳鐵蛋白肽抑制細(xì)胞病變的結(jié)果表明：濃縮后的重組菌上清與IBDV 預(yù)作用1 h 后，重組菌表達(dá)的乳鐵蛋白肽可以有效地抑制IBDV 引起的DF-1 細(xì)胞病變，但該效果不如同濃度下化學(xué)合成肽(LFcin)抑制IBDV 引起的DF-1 細(xì)胞病變明顯；qRT-PCR 檢測DF-1 細(xì)胞中病毒粒子拷貝數(shù)結(jié)果表明：濃縮后的重組菌上清與IBDV 預(yù)作用1 h 后，DF-1 細(xì)胞中IBDV 病毒粒子的拷貝數(shù)相對于病毒對照組顯著降低，同樣地，在相同濃度下化學(xué)合成肽(LFcin)組DF-1 細(xì)胞中IBDV 病毒粒子的拷貝數(shù)更低，這可能是由于用TCA 方法濃縮得到的乳鐵蛋白肽不如化學(xué)合成的乳鐵蛋白肽純度高所致。乳鐵蛋白肽的抗病毒活性可能是其與病毒粒子的直接作用從而抑制了病毒對細(xì)胞的侵染[15]；也有研究認(rèn)為抗菌肽首先與病毒粒子表面黏膜分子結(jié)合，使病毒失去與宿主細(xì)胞結(jié)合的位點，從而阻止病毒侵入細(xì)胞[16]；或者是抗菌肽與細(xì)胞表面的一些病毒受體如氨基葡聚糖結(jié)合，從而阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。

IBDV 自然宿主為雞和火雞，3 周齡～6 周齡的仔雞易感，表現(xiàn)為突然發(fā)病，死亡集中發(fā)生于幾天時間之內(nèi)，死亡率可達(dá)50 %～100 %。本研究將飼喂重組菌后的雛雞感染IBDV 強(qiáng)毒UK661 株，當(dāng)對照組雛雞出現(xiàn)臨床癥狀時采血處死取樣，將法氏囊、肝臟和腎臟制成組織切片，然后在100 倍光鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，病毒組的肝臟和腎臟組織幾乎沒有病理變化，這可能是與IBDV 主要侵染雞法氏囊有關(guān)[17]。重組菌組雛雞的法氏囊組織沒有發(fā)生病變或病變較輕，而空載體乳酸菌組和病毒對照組出現(xiàn)淋巴細(xì)胞大量壞死和結(jié)締組織增生，可見重組菌能夠抑制IBDV 對雛雞法氏囊組織的損傷。重組菌組雛雞的TLR2 和相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA 相對水平較空載體乳酸菌組明顯升高，TLR 與觸發(fā)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和抗病毒分子IFN 的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)[18]。通過 TLR2 上調(diào)激活 IFN-γ 以及 MyD88依賴性信號通路，從而更快的激活NF-κB 通路，激發(fā) IL-6、IL-8 和 TNF-α 有助于誘導(dǎo) T、B 細(xì)胞的分化增殖，參與炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到抗病毒的效果。血清中IgG 和腸黏膜SIgA 是發(fā)揮抗病毒作用的主要抗體，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組菌組的血清總IgG 含量明顯高于其它兩組，與pPG/M11 組相比差異顯著(p＜0.05)；SIgA 的分泌量也高于pPG/M11 組，表明重組菌能夠增強(qiáng)雞體的體液和黏膜免疫應(yīng)答水平。

重組菌對IBDV 感染雛雞存活率的影響結(jié)果表明，空載體乳酸菌組相比較對照組雛雞的存活率明顯提高，這可能與乳酸菌的益生作用有關(guān)。重組菌組相比較空載體乳酸菌組雛雞的存活率進(jìn)一步提高，說明表達(dá)牛乳鐵蛋白肽的重組雞源乳酸桿菌對雛雞感染IBDV 具有較好的保護(hù)作用。本研究為表達(dá)牛乳鐵蛋白肽的重組雞源乳酸桿菌在生產(chǎn)中的應(yīng)用以及禽類疾病的預(yù)防奠定基礎(chǔ)。