雞傳染性法氏囊病病毒DK株VP2基因序列分析及其對(duì)SPF雛雞的致病力

雷赟赟，林紹青，劉秉琿，于高博，武 琦，周五朵,2，黃寶欽，吳異健,2*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；2.福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350002；3.福建圣農(nóng)發(fā)展股份有限公司，福建南平354100)

傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)是雞傳染性法氏囊病(IBD)的病原體，臨床上引起幼齡雞(3 周齡～8 周齡)急性、高度接觸性的傳染性疾病，侵害雞的中樞免疫器官法氏囊[1]。法氏囊是禽體內(nèi)能夠產(chǎn)生抗體的B 淋巴細(xì)胞分化、成熟的場(chǎng)所，分化完全的B 淋巴細(xì)胞繼而從法氏囊中遷移到外周免疫器官，并發(fā)揮重要的免疫功能[2]。IBDV 主要在雞的B 淋巴細(xì)胞中復(fù)制，且偏嗜于活躍的增殖細(xì)胞，對(duì)不成熟或前體B 淋巴細(xì)胞比成熟的B 淋巴細(xì)胞的影響更大[3]。IBDV 有2 個(gè)血清型，血清I 型病毒對(duì)雞有致病力，對(duì)火雞無(wú)致病力；血清II 型病毒從火雞中分離，為非致病型。血清I 型病毒根據(jù)毒力差異分為經(jīng)典株、超強(qiáng)株、變異株和致弱株4 大類[4]。由于疫苗的不斷使用，在免疫選擇壓力的作用下，病毒出現(xiàn)了許多IBDV 超強(qiáng)株和變異株，導(dǎo)致病毒致病力及宿主對(duì)疫苗免疫應(yīng)答的改變，使之越來(lái)越難以防控，造成重大經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

IBDV DK 株是從福建某雞場(chǎng)分離鑒定的IBDV野毒株，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其毒力和致病性進(jìn)行了研究，為該株病毒分離地區(qū)IBD 的防控提供了臨床流行病學(xué)和分子流行病學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 IBDV DK 株由本實(shí)驗(yàn)室從福建某雞場(chǎng)發(fā)病的雞群中分離鑒定并保存；SPF 種蛋購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司，本實(shí)驗(yàn)室自行孵化。

pMD18-T、DL2000 DNA Marker 購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、Trans ZolTMUp RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京全式金公司；RT-qPCR 試劑盒和T4 連接酶均購(gòu)自Promega 公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega 公司；普通PCR Mix 購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；2×Phanta Max Buffer、dNTP Mix (10 mM each)、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 均購(gòu)自南京諾唯贊公司。

1.2 動(dòng)物感染試驗(yàn) 將IBDV DK 株病毒液10 倍倍比稀釋至10-8，按常規(guī)方法進(jìn)行雞胚半數(shù)致死量(ELD50)檢測(cè)。對(duì) 20 日齡實(shí)驗(yàn)雛雞以 2×103ELD50/0.2 mL/ 羽，分別經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼、口服接種感染，每組12 只。同時(shí)分別設(shè)滴鼻、點(diǎn)眼、口服0.2 mL PBS/ 羽為健康對(duì)照組雞，每組12 只觀察并記錄SPF 雞死亡情況。對(duì)死亡雞剖檢，觀察記錄其剖檢變化。取病變法氏囊和脾臟，按常規(guī)方法制作病理切片、HE 染色后觀察組織病理學(xué)變化。

1.3 VP2 基因的擴(kuò)增與序列分析 根據(jù)GenBank登錄的IBD10SD02(KM523631)VP2 基因序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)出一對(duì)擴(kuò)增IBDV VP2 基因的全長(zhǎng)特異性引物。上游引物為F：5'-ATGACAAACCT GCAAGAT-3'，下游引物為R：5'-CAGCTATCCTCC TTATGG-3'，預(yù)期擴(kuò)增的目的基因片段為1 365 bp，引物由上海鉑尚生物公司合成。提取IBDV DK 株總RNA 并反轉(zhuǎn)成cDNA，以其為模板PCR 擴(kuò)增IBDV VP2 基因、PCR 產(chǎn)物回收純化后與pMD18-T 載體連接、篩選陽(yáng)性克隆株由上海鉑尚生物公司測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較、分析，并繪制VP2 基因推導(dǎo)的氨基酸序列的遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 IBDV DK 株的致病性試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)接種病毒的雞胚死亡情況，利用Reed-Muench 法計(jì)算出IBDV的 ELD50為 10-4.50/0.2 mL。實(shí)驗(yàn)雞感染 IBDV DK 株后出現(xiàn)畏寒、扎堆、精神沉郁、采食量減少、飲水增多、排出白色稀糞等臨床癥狀，感染后3 d～5 d出現(xiàn)死亡。剖檢病死雞可見大腿肌肉和胸部肌肉均出現(xiàn)出血和脫水癥狀，腎臟腫大或有出血、肌胃與腺胃交界處有出血。法氏囊腫大，表面有黃色滲出液、有的法氏囊腫大出血呈“紫葡萄”樣。法氏囊剪開后，內(nèi)部皺褶腫大、出血、腸道黏膜內(nèi)容物增加、發(fā)病率為100 % (12/12、12/12、12/12)、平均死亡率為44.4 % (4/12、6/12、6/12)。對(duì)照組雞正常。表明IBDV DK 分離株具有較強(qiáng)的致病力。法氏囊和脾組織按常規(guī)方法制作病理切片、經(jīng)HE 染色后觀察可見，法氏囊淋巴濾泡結(jié)構(gòu)模糊、大量的淋巴細(xì)胞出現(xiàn)水腫、壞死、崩解；濾泡間水腫、髓質(zhì)區(qū)形成囊狀空腔、存在吞噬細(xì)胞，其中大多數(shù)為異嗜細(xì)胞、濾泡變性。髓質(zhì)部變成一個(gè)由許多細(xì)胞殘屑構(gòu)成的團(tuán)塊，周圍環(huán)繞著殘存的皮質(zhì)、網(wǎng)狀組織間散在有少量即將變性的細(xì)胞。脾臟紅髓區(qū)內(nèi)淋巴濾泡結(jié)構(gòu)消失，大量淋巴細(xì)胞變性壞死。對(duì)照組SPF雞無(wú)明顯病理變化(圖1)。表明實(shí)驗(yàn)雞感染IBDV DK 株后以法氏囊濾泡淋巴細(xì)胞壞死為其主要特征，間質(zhì)及濾泡外圍的偽嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；脾臟主要表現(xiàn)為廣泛的淋巴細(xì)胞壞死為特征的急性炎癥，引起感染雞法氏囊等免疫器官損傷、導(dǎo)致免疫抑制。

圖1 IBDV DK 株感染雞的組織病理學(xué)變化(HE，100×)Fig.1 Histopathological changes of the organ tissues in artificially infected chickens (HE,100×)

2.2 病毒VP2 基因的擴(kuò)增與序列分析結(jié)果2.2.1 DK 分離株VP2 基因的擴(kuò)增 以提取的病毒基因組反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板PCR 擴(kuò)增其VP2基因。結(jié)果顯示，得到了約1 400 bp 的特異性條帶，與預(yù)期大小一致(圖2)。重組質(zhì)粒pMD18-TVP2 經(jīng)測(cè)序顯示目的基因序列為1 365 bp，且與IBD10SD02 的同源性為94.6 %。進(jìn)一步表明擴(kuò)增的目的片段正確。

圖2 VP2 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification of VP2 gene by PCR

2.2.2 分離株VP2 基因序列分析 根據(jù)VP2 基因測(cè)序結(jié)果與參考株的相應(yīng)基因序列比較分析結(jié)果顯示，IBDV DK 分離株VP2 基因序列與參考株相應(yīng)基因的同源性為 93.1 %～97.0 %，其中 DK 株與Cu-1wt 參考株(經(jīng)典株)VP2 基因序列同源性最高為97.0 %。其氨基酸序列比較分析結(jié)果也與Cu-1wt 同源性最高為97.5 %。VP2 基因推導(dǎo)的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，DK 株與Cu-1wt 參考株處在同一分支；DK 株與 Cu-1wt、OKYM、UK661、MB 等參考株親緣關(guān)系較近；與Edgar 參考株親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)(圖3)。

圖3 IBDV DK 株與各參考株VP2 基因推導(dǎo)氨基酸序列的遺傳進(jìn)化關(guān)系Fig.3 Genetic evolution relationship based on the deduced amino acid sequences of VP2 gene in DK strain

比較DK 株與不同毒力代表株VP2 基因推導(dǎo)氨基酸序列中的代表性氨基酸位點(diǎn)的差異，結(jié)果顯示，DK 株的 249Q、253Q、279D、284A、290M、313V、330S 與超強(qiáng)毒株HLJ0504 與UK661、強(qiáng)毒株Cu-1wt 與Edgar 的氨基酸位點(diǎn)一致，且DK 株的七肽區(qū)也為 SWSASGS；但 DK 株的 222P、242Q、256V、294I、299 N 與中等毒力病毒株的氨基酸位點(diǎn)一致；222P、256V、299N 這3 個(gè)氨基酸位點(diǎn)不符合IBDV 超強(qiáng)毒株的特征[6]；而其在222P、249Q位與抗原變異株的222T 和249K 也不相同。表明DK 株具有中等毒力病毒株的特性又具有部分超強(qiáng)毒株的特性。

綜上所述，DK 株的毒力與Cu-1wt 標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株同源關(guān)系最近，且DK 株既具有中等毒力病毒株的特性又具有部分超強(qiáng)毒株的特性；再結(jié)合IBDV DK株對(duì)SPF 雛雞的致病性結(jié)果，表明IBDV DK 分離株為中等偏強(qiáng)毒力病毒株。