Periostin對心肌梗死后中性粒細胞浸潤及心肌修復的調(diào)控作用研究

祝雙華 廖延 姜美花 詹宇婷 彭朝權(quán)

【摘要】目的探討心肌梗死后periostin對心功能的影響及其是否通過調(diào)控中性粒細胞發(fā)揮作用，為臨床治療提供一定理論基礎(chǔ)。方法分別取正常野生型（WT）和periostin敲除（periostin^-/-）C57小鼠各60只，通過心臟左前降支永久結(jié)扎的方式制備心肌梗死模型，在心肌梗死前及心肌梗死后3周檢測2組小鼠心功能指標，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色檢測組織形態(tài)學變化，并記錄2組小鼠生存情況;在心肌梗死后第1、3日通過流式方式檢測2組小鼠心肌梗死區(qū)中性粒細胞聚集情況。結(jié)果心臟彩色多普勒超聲顯示心肌梗死前2組小鼠的LVEF、左心室縮短分數(shù)（LVFS）、左心室收縮末容積（LVESV）、左心室舒張末容積（LVEDV）比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05），而心肌梗死后3周periostin^-/-f LVEF及LVFS高于WT組（P均<0.01），LVESV及LVEDV均低于WT組（P均<0.05）。TTC染色示periostin^-/-組梗死灶面積較WT組更?。╰=5.817、P<0.05）。Periostin子組的生存率高于WT組（log-rank P=0.046）。流式結(jié)果顯示心肌梗死后第1日periostin'組心肌梗死區(qū)中性粒細胞數(shù)量多于WT組（t=5.365，P<0.01），但在第3日少于WT組（t=2.548、P<0.05）。結(jié)論心肌梗死后periostin可以抑制中性粒細胞進人梗死區(qū)清除壞死心肌，不利于后續(xù)心臟的修復以及心功能的改善。

【關(guān)鍵詞】心肌梗死;Periostin;中性粒細胞;心肌修復

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┳鳛槟壳岸喟l(fā)、常見的心臟疾病，已然成為人類健康的一個重要負擔。其中，AMI最為兇險，致死致殘率最高，并呈現(xiàn)逐漸年輕化的趨勢[1-2]。高血壓病、糖尿病、抽煙、過度飲酒等均為冠心病的高危因素[3-4]。雖然藥物和介人治療很大程度降低了心肌梗死的致死率，但是在心肌梗死后，冠狀動脈血流的急劇減少和（或）中斷使得該動脈供應的心肌組織嚴重缺血缺氧，導致心肌細胞的大量壞死，最終引起心力衰竭等嚴重后果[5-7]。壞死的心肌組織促使免疫炎癥反應機制的啟動，大量免疫細胞向梗死區(qū)聚集，以清除壞死細胞[8-9]。

Periostin是一種細胞外基質(zhì)蛋白，有研究表明，其與風濕病、哮喘、腫瘤等多種疾病有關(guān)，在正常組織中沒有明顯表達，當出現(xiàn)組織損傷特別是炎癥細胞聚集時表達量明顯升高[10-12]。心肌梗死早期發(fā)生急性炎癥反應加重了心臟組織的缺氧損傷使梗死灶面積進一步擴大，然而，越來越多研究顯示心肌梗死早期伴隨的急性炎癥反應可促進壞死心肌細胞的清除，有利于后期心臟組織修復[13-16]。有研究顯示，心肌梗死早期發(fā)生的急性炎癥反應伴隨大量炎癥細胞聚集，中性粒細胞作為早期炎癥反應中最主要的效應細胞，在心肌梗死后第1日數(shù)量便達到高峰，隨之逐漸減少[17]。而periostin蛋白在心肌梗死后的炎癥反應中所扮演的角色尚不清楚。本研究通過構(gòu)建periostin基因敲除（perios^-/-）C57小鼠和正常野生型（WT）C57小鼠AMI模型，探討periostin的有無對于心肌梗死后中性粒細胞聚集及心功能改變的影響，為心肌梗死后的藥物治療提供一定理論依據(jù)。

材料與方法

一、AMI小鼠模型的制備

1.Periostiri'-小鼠雜交、鑒定

無特定病原體（SPF）periostin基因敲除親代C57小鼠購自廈門大學，實驗過程符合實驗動物倫理。將periostin敲除雜合雌鼠與雜合雄鼠雜交，待子代生長至10～14d，剪取小鼠爪，按照組織基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）說明書提取genome DNA、并進行PCR擴增，擴增體系為：ddH₂O2.1μ1、2×Mix 6μl、WT下游引物0.3μl、periostin下游引物0.3 wl、WT及periostin上游引物0.3μl、cDNA 2μl，引物序列見表1。擴增后利用1%瓊脂糖凝膠電泳，135V/h，軟件分析條帶位置。

2.AMI小鼠模型

分次選取SPF級12周齡正常野生型（WT組）（購自廣東省動物實驗中心）和periostin敲除（periostin^-/-組）C57小鼠，每次每組各20只（分別用于生存率分析及流式檢測、免疫熒光等），體質(zhì)量25～30g，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，備皮、氣管插管、小鼠呼吸機正壓通氣，于左側(cè)第3、4肋間位置依次剪開皮膚、肌肉及肋間隙，暴露心臟，于左前降支起始端下2一3mm處進行永久性結(jié)扎，可見結(jié)扎處以下左室前壁明顯變白，造模成功，關(guān)閉胸腔，等待小鼠麻醉蘇醒。

二、流式檢測中性粒細胞表達

心肌梗死后第0、1、3日取Wr組及periostin}.組小鼠各6只，麻醉后取心臟組織用HBSS沖洗，剪取梗死區(qū)稱重后，加入11型膠原酶、DNase I，用組織細胞勻漿儀制備成細胞懸液，離心棄上清，磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，細胞計數(shù)。加入小鼠流式抗體CDllb-PEcy7 （1：20）（Thermo）、 Lineage-FITC（1：20）（Thermo），4℃避光孵育30min、PBS清洗、離心、重懸后，流式細胞儀檢測CDllb及Lineage雙陽性細胞群[18]。0

三、冰凍切片及免疫熒光染色

心肌梗死后第1、3日取2組小鼠各3只，麻醉、灌注固定后取出心臟，4%多聚甲醛4'C固定12h，30%蔗糖脫水過夜，OCT包埋組織，置于一20℃冰凍切片機至包埋劑凝固后連續(xù)冰凍切片（厚度為6μm），復溫后用PBS漂洗，山羊血清封閉40min，Ly6g（1：250，BD公司）一抗4℃孵育過夜，PBS充分漂洗，熒光二抗（488抗rat1：500，Thermo）室溫孵育30min，PBS充分漂洗，DAPI染核2min，PBS充分漂洗，封片，共聚焦顯微鏡（LSM800）觀察拍照。

四、組織RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量PCR（RT-PCR）

心臟組織剪碎，加入小鋼珠和1ml Trizol，組織勻漿振蕩器研磨后，加入200μl氯仿，充分振蕩混勻15s，室溫靜置10min，4℃ 12000轉(zhuǎn)/分離心15min，取上層水相，加入等量異丙醇，充分混勻，室溫10min，4℃12000轉(zhuǎn)/分離心10min，棄上清，75%乙醇4℃8500轉(zhuǎn)/分離心5min、室溫干燥10min、DEPC水溶解，測定RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TIANGEN）合成cDNA，進行qPCR、反應體系：cDNA 3μl、DEPC水3.6μl、2×Mi×7.5μl、上下游引物各0.3μl，引物序列見表2。程序如下：94℃預變性5min，循環(huán)程序94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，并收集熒光信號，共40循環(huán)。

五、TTC染色

小鼠麻醉后取出心臟，清除黏連組織及血液，直接放入-20℃速凍20～30min，用刀片從心尖開始手動切厚度約1mm的切片，放入提前預熱好的TTC孵育液中，37℃避光孵育30min，間隔10min輕搖組織，使其染色均勻，組織顯色后加人終止液后進行拍照，正常組織呈紅色，梗死區(qū)呈蒼白色，計算梗死比例=（單個層面梗死區(qū)面積X厚度）/（單個層面梗死區(qū)與非梗死區(qū)總面積X厚度）。

六、心功能檢測

正常小鼠及心肌梗死后3周用小鼠超聲機檢測LVEF、左心室縮短分數(shù)（LVFS）、左心室收縮末容積（LVESV）、左心室舒張末容積（LVEDV）。

七、統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel、Graphpad、Image J進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布計量資料以x±s表示，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并用log-rank檢驗對比生存曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、Periostiri'-小鼠鑒定

本研究采用雜合型periostin敲除雌雄鼠交配獲得子代小鼠，通過瓊脂糖凝膠電泳方法鑒定子代小鼠基因型。WT鼠顯示一條帶，條帶位置691bp;純合子顯示一條帶，條帶位置500by;雜合子顯示兩條帶，條帶位置500 by和691by，見圖1A。此外，為明確純合小鼠是否表達periostin、RT-PCR結(jié)果顯示在心肌梗死后第1、3日，periostin^-/-小鼠都不表達periostin，見圖1B。

二、Periostin敲除可改善心肌梗死小鼠左心功能。

為了排除periostin蛋白本身對心功能的影響，本研究比較了心肌梗死前periostin^-/--小鼠和WT小鼠的心功能差異。WT組和periostin^-/--組的LVEF、LVFS、LVESV、LVEDV比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均>0.05）。而在心肌梗死后第3周心臟彩超顯示，periostin^-/-組與WT組比較，LVEF（t=7.689、P=0.005）、LVFS（t=8.366，P=0.004）升高，而LVESV（t=3.538，P=0.038）及LVEDV（t=6.366，P=0.024）則降低，見圖2。

三、Periostin敲除可縮小心肌梗死后的梗死灶面積

本研究采用TTC染色反映心肌梗死小鼠梗死灶面積，結(jié)果表明心肌梗死后3周，periostin^-/-組梗死灶面積小于WT組（t=5.817，P=0.004），見圖3。

四、Periostin敲除可提高心肌梗死后小鼠生存率

雖然periostin^-/-組與WT組相比確實改善了各項心功能指標，也確實縮小了梗死灶面積，但是其對小鼠心肌梗死后心功能的改善程度是否具有臨床轉(zhuǎn)化意義并不清楚。因此本研究進一步比較了periostin^-/--小鼠與WT小鼠的Kaplan-Meier生存曲線。以心肌梗死后21d作為觀察終點，通過生存曲線分析（log-rank檢驗）發(fā)現(xiàn)periostin^-/-組的生存率要高于WT組（P<0.05），見圖4。

五、Periostin可抑制心肌梗死早期梗死灶中性粒細胞浸潤

心肌梗死早期急性炎癥反應的主要效應細胞為中性粒細胞，因此本研究為了探究periostin在心肌梗死早期的炎癥反應中發(fā)揮的作用，利用流式細胞方法檢測心肌梗死后第0、1、3日的periostin^-/-組以及WT組梗死灶的中性粒細胞數(shù)量。結(jié)果表明，心肌梗死后第1日periostin^-/-組梗死區(qū)的中性粒細胞多于wlr組（t=5.365、P=0.003）o而在第3日periostin組梗死區(qū)中性粒細胞數(shù)量明顯減少，而且要少于WT組（t=2.548，P=0.034），見圖5。免疫熒光結(jié)果與流式結(jié)果一致，見圖60

六、Periostin敲除可提高梗死區(qū)炎癥因子表達

periostin^-/-組與WT組細胞相比，心肌梗死后第1日的IL-1β（t=22.940，P < 0.001）、TNF-α（t=12.990，P<0.001）、IL-8（t=11.800，P<0.001）、IL-23α（t=7.027，P<0.001）升高，第3日2組IL-1β、TNF-α、IL-8雖無明顯差異，但periostin^-/-組較第1日下降明顯，并且periostin^-/--組的IL-23α（t=4.931，P=0.001）仍高于WT組，見圖70其中IL-1β、TNF-α和IL-8均可以招募中性粒細胞，IL-23 a則招募巨噬細胞。因此，心肌梗死早期的缺氧損傷可能引起心肌梗死區(qū)固有免疫細胞以及間質(zhì)細胞炎癥因子表達上升，將中性粒細胞趨化至梗死區(qū)發(fā)揮效應。

討論

本研究發(fā)現(xiàn)，periostin^-/--組比WT組小鼠在心肌梗死后3周的心功能提高，梗死灶面積縮小，且小鼠的生存率更高。periostin^-/-小鼠心肌梗死后第1日梗死灶內(nèi)浸潤的中性粒細胞比WT /J"鼠更多。然而第3日WT組小鼠梗死灶內(nèi)的中性粒細胞反而多于periostin^-/--組。此外，心肌梗死后第1日periostin^-/-組小鼠比WT組的IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-23α表達增加。以上結(jié)果提示，心肌梗死發(fā)生后periostin蛋白通過抑制可趨化中性粒細胞的炎癥因子表達從而降低梗死灶內(nèi)的中性粒細胞數(shù)量，使得心肌梗死后早期壞死心肌細胞清除、心肌修復受阻，梗死灶面積不縮小，進而使得心功能下降，小鼠生存率降低。

心肌梗死早期血流中斷導致梗死區(qū)心肌細胞缺氧損傷壞死引起急性炎癥反應，主要表現(xiàn)為炎癥介質(zhì)釋放增加，炎癥細胞聚集至梗死區(qū)，此時進人梗死區(qū)的主要為中性粒細胞以及促炎型巨噬細胞[5，17-18]。本結(jié)果也證實無論是periostin^-/-組還是WT組小鼠心肌梗死后第1日梗死灶浸潤的中性粒細胞急劇升高。但是與其他研究不同的是，心肌梗死后第3日梗死區(qū)內(nèi)的中性粒細胞數(shù)量比第1日明顯下降。主流觀點認為心肌梗死早期炎癥反應雖然清除了一部分壞死心肌，但是在此過程中產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)、細胞毒性物質(zhì)對梗死灶內(nèi)存活的心肌細胞甚至鄰近梗死區(qū)的正常心肌細胞也發(fā)揮了殺傷作用[19]。因為心肌一般被認為是不可再生的，所以心肌細胞在心肌梗死后發(fā)生的是瘢痕修復。但是心肌組織發(fā)揮生理功能依賴于心肌細胞而非瘢痕組織，況且心肌梗死早期炎癥反應使得心肌細胞受到更嚴重損傷甚至炎性壞死。因此，大部分學者認為心肌梗死早期炎癥反應不利于梗死后心臟修復，并且提出利用一些拮抗早期炎癥反應的藥物治療心肌梗死[9]。然而與其他研究不同，本研究發(fā)現(xiàn)periostin^-/-組在心肌梗死后第1日梗死區(qū)中性粒細胞上升而第3日下降，并且可改善小鼠預后。我們認為periostin蛋白缺失后，中性粒細胞在心肌梗死后第1日的時候急劇升高以便快速清除壞死細胞，在第3日的時候迅速降低以控制炎癥的強度、時間、范圍，盡量減少對存活心肌細胞及梗死灶鄰近區(qū)正常心肌的殺傷作用，同時快速啟動組織修復的過程。而且?guī)醉椶卓乖缙谘装Y反應的藥物臨床試驗均告以失敗，也從側(cè)面反應了早期炎癥對心肌梗死后組織修復并不是不利的[20-22]。

綜上所述，本研究采用periostin^-/-小鼠和WT小鼠建立AMI模型，直接清除periostin蛋白觀察動物表型，避免了因為蛋白本底表達掩蓋的現(xiàn)象。從建立AMI模型之后小鼠的心功能、心臟病理改變、生存預后等多方面揭示periostin^-/--心肌梗死小鼠表型的改變，結(jié)合已有研究推陳出新，得到了與以往研究不同的結(jié)論，并且初步探討了periostin^-/-改善心肌梗死小鼠預后的機制。本研究的不足之處在于對于機制探索過于淺顯，僅僅發(fā)現(xiàn)了periostin^-/-小鼠心肌梗死后第1日炎癥介質(zhì)將大量中性粒細胞招募至梗死區(qū)，但第3日中性粒細胞卻急劇下降的原因沒有找到，并且中性粒細胞通過何種途徑清除壞死心肌細胞同時盡量減少對存活心肌細胞的殺傷并不明確。未來可從本研究出發(fā)，深入探索急性炎癥反應在心肌梗死早期心臟修復方面的分子機制，趨利避害為改善AMI的臨床治療及預后提供新的實驗基礎(chǔ)和理論支持。

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（收稿日期：2019-01-18）

（本文編輯：楊江瑜）

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2019.05.009

基金項目：國家自然科學基金（81370214）;廣東省自然科學基金（2015A030313183）

作者單位：510630 廣州，中山大學附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科（祝雙華，彭朝權(quán)）;510060 廣州，中山大學干細胞與組織工程研究中心

（廖延，姜美花）;510800廣州，中山大學附屬腫瘤防治中心（詹宇婷）

通信作者，彭朝權(quán)，E-mail：pengcq123456@163.com