CCR5第一、二胞外環(huán)特異性結(jié)合短肽對(duì)大鼠損傷性結(jié)腸上皮細(xì)胞的重建作用與機(jī)制

宋銥航 劉思雪 簡嘉甫 黃花榮 鐘英強(qiáng)

【摘要】目的探究CC趨化因子受體5 （CCR5）第一、二胞外環(huán)拮抗短肽對(duì)大鼠損傷性結(jié)腸上皮細(xì)胞的重建作用與機(jī)制。方法原代培養(yǎng)大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞并鑒定;建立由TNF-α誘導(dǎo)的損傷性結(jié)腸上皮細(xì)胞模型;CCK8法檢測兩短肽（分別簡稱GH和HY短肽）對(duì)損傷性上皮細(xì)胞生長的影響;實(shí)時(shí)熒光定量PC R和蛋白免疫印跡法檢測各組（正常對(duì)照組、損傷模型組、各濃度GH短肽組、各濃度HY短肽組）黏蛋白2、occludin、CCR5、表皮生長因子（EGF）、三葉因子3（TFF3）的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果150ng/ml TNF-α作用細(xì)胞48h后可獲得損傷性上皮細(xì)胞;GH和HY短肽在0.125～0.500mg/ml濃度下均能促進(jìn)損傷性上皮細(xì)胞增殖;0.125～0.500mg/ml濃度的GH短肽組和HY短肽組occludin、EGF、TFF3的mRNA和蛋白水平均比損傷模型組高（P均<0.05）;0.500mg/ml濃度的GH短肽組和HY短肽組黏蛋白2的mRNA和蛋白的表達(dá)均比損傷模型組高（P均<0.05）：0.250～1.000mg/ml濃度的GH短肽組、0.500～1.000mg/ml濃度的HY短肽組CCR5的mRNA和蛋白表水平達(dá)均比損傷模型組低（P均<0.05）。結(jié)論CCR5第一、二胞外環(huán)特異性結(jié)合短肽在一定濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)損傷性上皮細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與促進(jìn)黏蛋白2、occludin、EGF、TFF3的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】炎癥性腸病;腸上皮細(xì)胞;原代培養(yǎng);CC趨化因子受體5;拮抗短肽

炎癥性腸?。↖BD）是一組病因未完全明了的慢性腸道非特異性免疫炎性疾病，主要包括克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和中間型IBD[1]。IBD除引起腸道損傷和炎癥表現(xiàn)外，腸上皮細(xì)胞的修復(fù)和重建在病程中也起著重要作用。一方面，腸上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)的連續(xù)性和數(shù)量會(huì)因黏膜屏障的擾亂而改變，IBD患者緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)有所下降，另一方面，多種因子參與腸黏膜修復(fù)[2]。三葉因子3（TFF3）主要由腸上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞表達(dá)，其可與腸道其它保護(hù)因子如表皮生長因子（EGF）和黏蛋白2等共同作用，減輕多種因素介導(dǎo)的腸黏膜損傷[3]。

CC趨化因子受體5（CCRS）作為趨化因子受體的一種，已被證實(shí)與IBD有密切的關(guān)系[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，CCRS第一、二胞外環(huán)特異性結(jié)合的模擬肽治療三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠后，腸道炎癥明顯減輕，結(jié)腸黏膜與上皮細(xì)胞發(fā)生了重建[5]。本研究擬進(jìn)行大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，建立損傷性上皮細(xì)胞模型，探討CCRS第一、二胞外環(huán)特異性結(jié)合短肽對(duì)損傷性上皮細(xì)胞生長的影響以及對(duì)黏蛋白2、occludin、CCRS、EGF、TFF3基因和蛋白表達(dá)的影響，為IBD的治療提供新的靶點(diǎn)。

材料與方法

一、動(dòng)物

SD乳鼠40只，雌雄不限，6～15日齡，體質(zhì)量10～209、由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（北校區(qū)）提供，許可證號(hào)：SYXK（粵）2017-0181，飼養(yǎng)條件為SPF級(jí)。本實(shí)驗(yàn)符合中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

二、主要試劑

CCRS第一、二胞外特異性拮抗肽由上海吉爾生化合成，其序列為GHWKVWL（簡稱GH）、HYIDFRA（簡稱HY）;胎牛血清、DEME培養(yǎng)基和青鏈霉素混合液購自Gibco;牛垂體提取物、胰島素鐵硒傳遞蛋白購自ScienCell; Dispase I購自Roche;膠原酶XI和Y27632購自Sigma; TNF-α購自R&D; CK-18一抗和GAPDH一抗購自Affinity;EGF由七、TFF3一抗和黏蛋白2一抗購自Santa Cruz;CCR5一抗和occludin一抗購自Abcam;Alexa Fluor■488熒光二抗購自中杉金橋;CCK8試劑盒購自Dojindo。

三、主要方法

1.完全培養(yǎng)基和酶消化液的配置

完全培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，20ng/ml表皮生長因子，5 [[Lg/ml牛垂體提取物，10μg/ml胰島素，10μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，100μg/ml肝素鈉，100 IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素。酶消化液：完全培養(yǎng)基，0.1mg/ml Dispase I、300U/ml膠原酶XI，10 nmol/ml Y27632。

2.SD大鼠原代結(jié)腸上皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)[6-8]的方法并改進(jìn)。取6一巧日齡乳鼠5只，頸椎脫臼處死，無菌下取出結(jié)腸并縱行剪開，用含青鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗5次，剪碎至1mm³大小，反復(fù)清洗至上清澄清，加10ml酶消化液25℃震蕩消化30min、反復(fù)吹打3～5min，室溫靜置1min。取上清至新離心管，加10ml梯度離心液（DMEM+5%胎牛血清+2%山梨醇），200～300轉(zhuǎn)/分離心2min，棄上清，加10ml離心液重懸，重復(fù)3一5次后加培養(yǎng)基接種于25cm²培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，每48h更換培養(yǎng)液。細(xì)胞長至80%～90%加0.05%胰酶消化，光鏡下看到成纖維樣細(xì)胞變圓飄起時(shí)倒棄消化液，PBS清洗后再加0.25%胰酶消化，離心后接種于新的培養(yǎng)瓶，90min后將培養(yǎng)液連同未貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

3.大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的鑒定

CK-18是上皮細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物之一，本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光法鑒定。將第2代細(xì)胞接種于爬片上，待長至60%～80%去除培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定15min，0.2% Triton X-100破膜10min、3% BSA室溫封閉30min，CK-18一抗（1：200稀釋）4℃孵育過夜，漂洗后熒光二抗（1：400稀釋）避光孵育1h，DAPI避光染色10min，封片后熒光顯微鏡觀察。

4.損傷性結(jié)腸上皮細(xì)胞的制備與細(xì)胞生長曲線

取第2代細(xì)胞，以1×10⁴/ml密度種于85孔板，每孔100μl，共5組（含無細(xì)胞空白對(duì)照組）。24h貼壁后加入TNF-α使其終濃度為0、50、100、150ng/ml、培養(yǎng)1～8d（每48h換液），加入CCK8，孵育1h。酶標(biāo)儀測定450nn波長下各孔吸光度（ODQ₄₅₀）。以時(shí)間為橫軸，以O(shè)D值為縱軸繪制各組細(xì)胞生長曲線。

5.透射電鏡觀察正常和損傷性上皮細(xì)胞

取第2代細(xì)胞種于培養(yǎng)皿，設(shè)正常對(duì)照組和損傷模型組，正常對(duì)照組不處理，損傷模型組TNF-α以150ng/ml刺激細(xì)胞，48h后電鏡固定液4'C固定3h，回收細(xì)胞并經(jīng)包裹、再固定、漂洗、脫水和包埋后，制成厚度約50～80nn的切片，醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙染后透射電鏡觀察。

6.應(yīng)用拮抗短肽干預(yù)損傷性上皮細(xì)胞

取第2代細(xì)胞種于96孔板，設(shè)5組細(xì)胞孔和1組空白孔，對(duì)照組為不加短肽的損傷模型組。24h細(xì)胞貼壁后，TNF-α以150ng/ml濃度作用于各組細(xì)胞，48h后GH和HY短肽分別以0、0.125、0.250、0.500、1.000mg/ml的濃度作用于各組細(xì)胞1～7d。CCK8法測定OD值并繪制生長曲線。

7.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測黏蛋白2、occludin、CCR5、EGF、TFF3的mRNA表達(dá)水平

細(xì)胞種于6孔板，設(shè)正常對(duì)照組、損傷模型組、GI短肽組和HY短肽組（濃度各為0.125、0.250、0.500、1.000mg/ml）。24h貼壁后，TNF-α以150ng/ml濃度作用于損傷模型組和各給藥組，48h后GH和HY短肽以上述濃度分別作用于各組細(xì)胞。5d后回收細(xì)胞。Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增，檢測結(jié)合SYBR染料的熒光強(qiáng)度，得到循環(huán)數(shù)Ct值。以β-actin為內(nèi)參，2^-△△Ct計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)定量。引物序列見表1。

8.蛋白免疫印跡法檢測黏蛋白2、occludin、CCR5、EGF、TFF3的蛋白表達(dá)水平

參考7的分組和處理，提總蛋白，測蛋白濃度，變性后將蛋白樣本等量等體積加入凝膠中電泳、轉(zhuǎn)印。5%BSA封閉，黏蛋白2（1：1000）、occludin（1：5 000）、一抗CCR5（1：2 000）、EGF（1：1000）、TFF3（1：1000）、GAPDH（1：1000）4℃孵育過夜。二抗（1：10 000）室溫孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析比較。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)和作圖，計(jì)量資料采用x士s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、結(jié)腸上皮細(xì)胞形態(tài)

原代培養(yǎng)可獲得大量完整隱窩單位（圖IA、B），24h后見其貼壁，周圍少量細(xì)胞爬出（圖1C）。3～5d可見細(xì)胞呈片狀集落，周圍輻射出大量細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)多樣，呈多角形或鋪路石樣，可見成纖維樣細(xì)胞混雜生長（圖1D、E）。純化后的上皮細(xì)胞純度大為提升，傳代后依然生長良好（圖1F）。

二、結(jié)腸上皮細(xì)胞鑒定

免疫熒光染色后，多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，即CK-18角蛋白表達(dá)陽性（圖2A、D），胞核呈藍(lán)色熒光（圖2B、E），融合后圖像如圖2C、F。

三、正常和損傷性上皮細(xì)胞的生長曲線

正常結(jié)腸上皮細(xì)胞接種后2一8d位于指數(shù)生長期，提示了此段時(shí)間細(xì)胞活力最佳，是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的良好時(shí)機(jī)。

TNF-α以50ng/ml濃度作用于細(xì)胞時(shí)，第6、8日的OD值有輕微降低（P均<0.05）;當(dāng)TNF-α為100ng/ml時(shí)，第5-8日細(xì)胞的OD值與正常對(duì)照組相比有所降低（P均<0.05）;TNF-α為150ng/ml時(shí)，第2～8日的OD值與正常對(duì)照組相比降低（P均<0.05），見圖3。

四、電鏡觀察正常和損傷性上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

正常結(jié)腸上皮細(xì)胞（圖4A、B）可見胞膜周圍有較多的微絨毛（黑色箭頭）以及線粒體（紅色箭頭）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（藍(lán)色箭頭）等多種細(xì)胞器。損傷性上皮細(xì)胞（圖4C、D）可見細(xì)胞膜局部破損，胞質(zhì)內(nèi)空泡較多。部分線粒體明顯腫脹，嵴消失，呈空泡樣，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微擴(kuò)張，微絨毛明顯腫脹，可見4個(gè)自噬小體（紫色箭頭）。

五、GH和HY短肽對(duì)損傷性上皮細(xì)胞生長的影響

第4日GH短肽0.250、0.500mg/ml和HY短膚0.125一0.500mg/ml作用細(xì)胞的OD值與損傷模型組相比略有增高（P均<0.05）;第5～7日兩短肽以0.125～0.500mg/ml濃度作用細(xì)胞的OD值較損傷模型組均有升高（P均<0.05），見圖5。

六、GI和日、短肽對(duì)黏蛋白2、occludin、CCR5、EGF、TFF3基因表達(dá)的影響

在0.125～0.500mg/ml濃度的GH短肽組和HY短肽組，occludin、EGF和TFF3的mRNA表達(dá)水平均比損傷模型組高（P均<0.05）; 0.500mg/ml濃度的GI和日、短肽組黏蛋白2的mRNA表達(dá)水平均比損傷模型組高（P均<0.05）;0.250～1.000mg/ml濃度的GH短肽組、0.500～1.000mg/ml濃度的HY短肽組CCRS的mRNA表達(dá)水平均比損傷模型組低（P均<0.05），見表2、3。

七、GH和HY短肽對(duì)黏蛋白2、occludin、CCR5、EGF、TFF3蛋白表達(dá)水平的影響

在0.125～0.500mg/ml濃度的GH短肽組和HY短肽組occludin、EGF和TFF3的蛋白表達(dá)水平均比損傷模型組高（P均<0.05）; 0.500mg/ml濃度的GH短肽組和HY短肽組黏蛋白2蛋白的表達(dá)水平均比損傷模型組高（P均<0.05）;0.250～1.000mg/ml濃度的GH短肽組、0.500～1.000mg/ml濃度的HY短肽組CCR5的蛋白表達(dá)水平均比損傷模型組低（P均<0.05），見表4、5。

討論

IBD作為一種發(fā)病機(jī)制未完全明確的疾病，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物模型的建立相對(duì)完善，缺乏相應(yīng)的細(xì)胞模型。我們采用Dispase Ⅰ和膠原酶Ⅺ聯(lián)合消化結(jié)腸組織，用鼠尾膠原包被培養(yǎng)瓶促進(jìn)隱窩單位貼壁。酶消化液中添加Rho激酶抑制劑Y27632來抑制腸道干細(xì)胞的“失巢凋亡”[9]。上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)中?；祀s成纖維細(xì)胞，純化是培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。成纖維細(xì)胞對(duì)胰酶更為敏感、貼壁速度更快，因此用差速消化法和差速貼壁法提純，可顯著減少成纖維細(xì)胞的數(shù)量，以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

TNF-α作為與IBD相關(guān)的前沿炎癥因子，是引起腸上皮細(xì)胞損傷的主要因素之一，可誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，增加腸道上皮的通透性帥[10]。TNF-α在IBD患者的表達(dá)可呈現(xiàn)慢性、長期的升高，且TNF-α單抗（如Infliximab）對(duì)中重度IBD有明顯治療效果[11]。我們用TNF-α制備損傷性腸上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)150ng/ml的TNF-α刺激48 h后對(duì)細(xì)胞的生長有較為明顯的抑制，且隨著時(shí)間延長，抑制作用持續(xù)存在。電鏡結(jié)果也表明，該條件下細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生了明顯損傷。

CCR5主要表達(dá)于T細(xì)胞、單核細(xì)胞和未成熟樹突狀細(xì)胞的胞膜上，有關(guān)CCR5的研究也多集中在對(duì)炎癥細(xì)胞自身的影響。Dwine且等[12]發(fā)現(xiàn)了人類多種結(jié)腸癌細(xì)胞系和正常結(jié)腸黏膜組織中也表達(dá)CCR5，隨后Ye等[13]發(fā)現(xiàn)了IBD活動(dòng)期患者腸黏膜CCR5表達(dá)的陽性率明顯增高，且主要集中在固有層炎癥細(xì)胞、固有腺體上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜上。遺憾的是，CCR5在結(jié)腸上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞中的功能是否完全相同并未有報(bào)道。

本課題組通過噬菌體肽庫展示技術(shù)篩選出2條特異性結(jié)合CCR5胞外環(huán)的短肽，發(fā)現(xiàn)它們可改善TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎的病理和組織學(xué)的改變[14-15]。本研究中0.125～0.500mg/ml濃度的GH和HY短肽均有促進(jìn)損傷性結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖的作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果也表明，適當(dāng)濃度的 GH、HY短肽均可促進(jìn)黏蛋白2、occludin、EGF、TFF3 mRNA和蛋白的表達(dá)。另外，一定濃度GH、HY短肽可抑制CCR5mRNA和蛋白的表達(dá)，且隨著濃度升高，抑制作用更加明顯。這充分說明GH和HY短肽促進(jìn)損傷性腸上皮細(xì)胞重建機(jī)制與這些生長因子的表達(dá)增高有關(guān)[16]。

CCR5拮抗劑能否直接影響細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)，目前尚無定論，Venuti等[17]發(fā)現(xiàn)CCR5抗體與其胞外環(huán)結(jié)合時(shí)，可造成T細(xì)胞表面CCR5陰性表達(dá)，可能由于胞內(nèi)信號(hào)通路被激活，形成了以CCR5為中心的復(fù)合體。還有研究發(fā)現(xiàn)，CCR5除了以單體形式存在于細(xì)胞表面，也能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚合成同源寡聚體，還可與其他趨化因子受體聚合發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)[18]。Sohy等[19]發(fā)現(xiàn)在T細(xì)胞和單核細(xì)胞中，CCR2、CCR5以及CXCR4可共同組成異源三聚體，任一單體的拮抗劑都可影響到另外兩者的生物活性。現(xiàn)階段有多種CCR5抑制劑被開發(fā)，馬拉維若是目前唯一被批準(zhǔn)可應(yīng)用于臨床的CCR5小分子拮抗劑，但不會(huì)影響CD4⁺T細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)，而蛋白激酶C拮抗劑苔蘚蟲素-1卻能使CCR5的表達(dá)降低[20]。GH和HY短肽可能有別于傳統(tǒng)拮抗劑，除特異性結(jié)合CCR5以外還具有其他生物學(xué)功能。

綜上所述，細(xì)胞水平上適宜濃度的GH和HY短肽可促進(jìn)損傷性上皮細(xì)胞增殖，分子水平上其可促進(jìn)腸黏膜修復(fù)相關(guān)蛋白黏蛋白2、occludin、EFG和TFF3的表達(dá)。這其中涉及的具體信號(hào)通路和分子機(jī)制尚未完全明確，有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2019-01-28）

（本文編輯：楊江瑜）

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2019.05.011

基金項(xiàng)目：廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.201803010004）

作者單位：510120廣州，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科（宋銥航，劉思雪，簡嘉甫，鐘英強(qiáng)），兒科（黃花榮）

通信作者，鐘英強(qiáng)，E-mail：zhongyingqiang@126.com