可視化LAMP檢測常見肉制品中豬肉成分

朱 凱，康懷彬，王德國

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471000；2.許昌學院食品與生物工程學院，河南 許昌 461000）

食品安全問題一直是制約肉制品行業(yè)乃至食品行業(yè)快速穩(wěn)定發(fā)展的一大難題。一般而言，肉類食品安全問題分為兩種，第1種是天然存在的，如大腸桿菌[1]、阪崎克羅諾桿菌[2]、副溶血性弧菌[3]等微生物污染，第2種是人為制造的，如獸藥殘留[4]、肉類摻雜摻假[5]等。其中肉類摻雜摻假給我國食品行業(yè)帶來了十分惡劣的影響，其主要表現(xiàn)癥狀為以次充好，因此發(fā)展實用的肉類摻假檢測方法是大勢所趨、而快速、低成本的檢測方法不僅受到商業(yè)化市場的青睞，在進出口肉制品檢測、市場抽查、中小型肉制品企業(yè)生產也有較大發(fā)展空間。

現(xiàn)有的肉類摻假檢測方法主要分為傳統(tǒng)方法和現(xiàn)代技術分析兩大類。傳統(tǒng)方法鑒別肉品質主要依賴于感官判斷和形態(tài)學檢驗[6]，其局限性較大，多用于個人、家庭、肉制品商店等小規(guī)模鑒別?，F(xiàn)代技術分析多以特征性的脂肪、蛋白質、核酸作為靶標物進行肉類摻假檢驗[7]，當前主要分析手段有紅外光譜分析、色譜分析、核磁共振法、質譜分析、免疫分析和核酸分析等[8]。環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）法屬于核酸分析法，此技術是由Notomi等[9]發(fā)明，相比于傳統(tǒng)聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術，具有特異性更強、靈敏度更高等的優(yōu)點，目前廣泛運用于醫(yī)學、植物學、食品學、動物科學等領域，受到國內外專家學者及市場的認可。LAMP法檢測摻假肉的研究中，現(xiàn)已開發(fā)出多種肉類的不同改良的LAMP檢測方法，已有報道研究[10-12]對馬肉、牛肉、牛羊肉成分的摻假進行了LAMP檢測；楊麗霞等[13]建立了雞、鴨源性成分的LAMP可視化檢測方法；徐淑菲等[14]建立了牛源性成分熒光LAMP檢測方法；劉少寧等[15]建立了鑒別綿羊肉中狐貍源性成分的LAMP檢測方法。以上實驗均證明了LAMP檢測法在肉類檢測上的可靠性。

豬肉在我國肉制品中占據(jù)主要地位，我國是世界上最大的豬肉生產國和消費國。近年來豬肉價格持續(xù)走低[16]，使得豬肉摻假的成本越來越低，不法商販往往將廉價的豬肉摻入到牛肉、羊肉、驢肉等價格較高的肉類中，以次充好。部分專家學者采用LAMP檢測法檢測豬肉成分的研究，如Lee等[17]針對線粒體D環(huán)基因和18S rRNA基因設計特異性豬引物，通過便攜式實時熒光檢測器檢測結果，建立了加工肉中豬肉成分檢測的實時熒光LAMP法，優(yōu)點是實驗時間短、可用于現(xiàn)場及時檢測；Roy等[18]將LAMP技術與磁珠技術相結合，LAMP擴增產生大量DNA與磁性物質結合形成聚集體，其表現(xiàn)為在紙上形成肉眼可見的黑點，以達到可視化的目的，成功建立檢測雞、豬肉成分摻假的可視化LAMP法，其優(yōu)點是可視化、對儀器需求低；Ran Guangyao等[19]以鈣黃綠素為染料，建立了檢測豬肉成分可視化LAMP檢測方法；楊麗霞等[20]針對豬肉線粒體DNA COXI基因設計LAMP引物，加入熒光染料SYBR Green I，建立了檢測牛羊肉中豬肉成分的實時熒光LAMP法；李向麗等[21]針對豬、鴨、羊的Cytb基因設計特異性引物，自主研發(fā)恒溫熒光檢測儀，以SYTO-9為染料，建立了豬、鴨、羊源成分的檢測恒溫實時熒光LAMP法。本實驗以間苯二酚鈉鹽為指示劑，目的是建立更簡單、更實用的可視化LAMP豬肉檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉、羊肉均購于河南省許昌市農貿市場，驢肉、馬肉購于淘寶，雞肉、鴨肉及其他豬肉制品購于許昌美高美超市。

Buffer緩沖液、BstDNA聚合酶（10 000 U/mL）New England Biolab（北京）有限公司；dNTP（濃度10 mmol/L） 生工生物工程（上海）股份有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Amresco公司；DEPC水 上海翊圣生物科技有限公司；TE緩沖液（pH 8.0） 武漢百浩天生物科技有限公司；SYBR Green I 北京索萊寶科技有限公司；SYBR qPCR Mix 日本東洋紡公司。

指示劑配制（10 mmol/L）：稱取0.002 371 g的4-(2-吡啶偶氮)-間苯二酚鈉鹽于離心管中，加入1 mL DMSO溶解，并混勻。

1.2 儀器與設備

水浴鍋（實驗室定制） 河南康鴻生物科技有限公司；SCO-3201A數(shù)控定時超聲波清洗機 上海聲彥超聲波儀器有限公司；BCD-215KAJ冰箱 青島海爾股份有限公司；1-14K高速離心機 德國Sigma公司；Step one plus實時熒光定量PCR儀 美國ABI公司；FA2004B電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；NanoDrop One微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 LAMP引物設計與配制

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫豬源基因，選取保守序列線粒體細胞b（GenBank: X56295.1）通過BLAST在線比對軟件進行分析，選取保守性和特異性都較好的片段，利用Primer Explorer Version 5在線設計軟件設計一套LAMP引物，如表1所示，交由安徽通用生物公司合成，所有引物均用TE緩沖液（pH 8.0）稀釋至100 μmol/L，按體積比FIP（BIP）∶LF（LB）∶F3（B3）為8∶4∶1混合均勻，作為最終引物混合液。

表1 豬引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of the porcine mitochondrial cytochrome b gene

1.3.2 DNA制備

1.3.2.1 線粒體提取

選擇使用試劑盒提取豬線粒體DNA，稍加改良。將不超過500 mg肌肉組織剪成小塊，加入1 mL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.9）洗滌并用濾紙吸干，然后加入1 mL溶液I，冰浴研磨50 次；將研磨好的混合物移至離心管中4 ℃、1 000×g離心5 min，取上清液移至新離心管；將上清液4 ℃、12 000×g離心10 min，再棄上清液，留下白色沉淀；向白色沉淀中加入0.5 mL溶液I，劇烈搖晃使沉淀溶于液體，后4 ℃、1 000×g離心5 min；取上清液至新離心管，4 ℃、12 000×g離心10 min，再棄上清液，留下白色沉淀就是線粒體。

1.3.2.2 線粒體純化

向含有線粒體的離心管中加入190 μL buffer LC，10 μL蛋白酶K，充分混勻；加入200 μL buffer CQ到裂解液中，混勻；加入200 μL無水乙醇，充分混勻；取全部混合液加入到DNA純化柱，室溫放置2 min，10 000 r/min離心1 min，棄收集的廢液；向純化柱加入300 μL buffer WB，10 000 r/min離心1 min，再次棄廢液；加400 μL buffer WB到DNA純化柱，14 000 r/min離心2.5 min，棄廢液；將DNA純化柱放入新管，懸空滴加80 μL buffer EB到柱膜上，室溫溫育5 min，10 000 r/min離心1 min；重復上一步驟，buffer EB添加量從80 μL變?yōu)?0 μL，收集的液體即為線粒體DNA提取液，即可直接用于實驗。

1.3.2.3 簡化DNA提取步驟

將不超過500 mg肌肉組織剪成小塊，加入1 mL PBS（pH 7.9）洗滌并用濾紙吸干；加入1 mL TE緩沖液（pH 8.0），冰浴研磨50 次；將研磨好的混合物移至離心管中4 ℃、1 000×g離心5 min，取上清液移至新離心管；將上清液4 ℃、12 000×g離心10 min，再棄上清液，留下白色沉淀；向白色沉淀中加入0.5 mL TE緩沖液（pH 8.0），劇烈搖晃使沉淀溶于液體，后4 ℃、1 000×g離心5 min；取上清液至新離心管，4 ℃、12 000×g離心10 min，再棄上清液；加入50～100 μL TE緩沖液（pH 8.0），劇烈振蕩使沉淀溶于液體；超聲波振蕩6 min，充分破碎線粒體使線粒體DNA釋放出來，此提取液即可直接用于LAMP實驗。

1.3.3 模擬樣品的制備

向其他肉類按比例添加豬肉，制造摻假模擬樣品，因受到電子天平精度（0.000 1 g）限制，最低可制造摻假比0.1%的摻假樣品；用核酸蛋白測定儀對1.3.2.3節(jié)純化后的純豬肉線粒體DNA模板溶液進行測定，確定濃度并按照一定比例進行稀釋，稀釋液為TE（pH 8）緩沖液，制成模板濃度為100、10、1 pg模板溶液。將上述提取的摻假樣品和模板溶液于－20 ℃保存。

1.3.4 LAMP豬肉成分檢測體系優(yōu)化

將增強劑、混合引物、buffer、dNTP、Mg2＋、Mn2＋、指示劑、BstDNA聚合酶、DEPC水、模板DNA于冰浴條件下依次加入到1.5 mL EP管中，混合均勻，放入水浴鍋反應1 h。待反應結束后于白色背景下觀察顏色變化，若結果為橘紅色則說明DNA未擴增，為陰性結果；若結果為明黃色則說明DNA已擴增，為陽性結果。

1.3.4.1 LAMP溫度優(yōu)化

根據(jù)預實驗結果，調整實驗溫度，若預實驗的陰性對照和陽性對照均發(fā)生變色反應則提高反應溫度，若陰性、陽性對照均未發(fā)生變色反應則降低溫度，若陰性對照不變色，陽性對照變色則說明此溫度較為合適，上下調整溫度選擇無假陽性，反應較快的溫度為最適反應溫度。

1.3.4.2 LAMP體系優(yōu)化

根據(jù)預實驗結果，參考1.3.4.1節(jié)的方法，對LAMP體系進行優(yōu)化，間苯二酚鈉鹽和Mn2＋結合作為指示劑，其配方較為固定，只需要對Mg2＋濃度進行優(yōu)化，觀察不同Mg2＋濃度下空白實驗、陽性對照結果，選擇無假陽性、反應較快的一組Mg2＋為最適Mg2＋濃度。

1.3.5 LAMP特異性實驗

為驗證該引物的特異性是否能區(qū)分不同肉類，按1.3.2節(jié)方法提取牛、羊、雞、鴨、馬、驢等其他肉類線粒體DNA，以優(yōu)化好的體系配制反應液，加入不同肉的模板DNA，兩兩對照，在最適溫度下反應1 h，觀察顏色變化。最后用該引物進行熒光定量LAMP實驗，通過分析擴增曲線和熔解曲線進一步確定特異性。

1.3.6 LAMP靈敏度實驗

為驗證該方法的最低檢測限，用不同比例的摻假樣品和不同濃度的模板溶液進行靈敏度實驗，以優(yōu)化好的體系配制反應液，按豬肉線粒體DNA含量從高到低依次排序，在最適溫度下反應1 h，觀察顏色變化，以能穩(wěn)定變色的該組檢測限為最低檢測限。由于樣品新鮮度、研磨是否充分、人為因素誤差等會對DNA提取效果產生一定的影響，因此，多次提取DNA并重復靈敏度實驗，確保該實驗結果準確可靠。

1.3.7 LAMP適應性、穩(wěn)定性實驗

從最常見的豬肉制品中提取線粒體DNA，于優(yōu)化體系下反應60 min，觀測反應結果，判斷該實驗方法的適應性。重提DNA、重配試劑，并在不同時間、多次重復該實驗，觀察是否有假陽性出現(xiàn)，測定該體系的穩(wěn)定性。

1.3.8 其他方法比較驗證

1.3.8.1 實時熒光定量LAMP

為驗證可視化LAMP的可靠性，同時進行實時熒光定量LAMP實驗，引物同可視化LAMP引物，體系稍作改變，將Mn2＋、間苯二酚鈉鹽改為SYBR Green I，每20 μL反應體系中加入0.2 μL（50×），用DEPC水補足體系，反應溫度同可視化LAMP最佳反應溫度，設置120 個循環(huán)，每個循環(huán)30 s，即總反應時間為1 h，觀察擴增曲線。

1.3.8.2 實時熒光定量PCR[22]

為進一步驗證可視化LAMP的可靠性，同時還進行實時熒光定量PCR實驗，以LAMP反應的兩條外引物（F3、B3）為熒光PCR的引物，按照THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix說明書配制反應體系，觀察擴增曲線和熔解曲線。

qPCR條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸1 min，40 個循環(huán)；熔解曲線從60 ℃開始，速率為1.5%。

2 結果與分析

2.1 不同線粒體DNA提取方法對比

圖1 不同提取方式提取豬線粒體DNA的LAMP實驗Fig. 1 Comparison of pig mitochondrial DNAs extracted by different extraction methods

如圖1所示，不同提取方法提取DNA的LAMP實驗結果均為明黃色，簡化后的豬線粒體DNA提取方法實際LAMP效果與試劑盒法相似，提取時間僅為原來的一半，且試劑更為安全，此后實驗均用簡化后的DNA提取法。

2.2 預實驗結果

圖2 預實驗結果Fig. 2 Pretest results

如圖2所示，反應60 min后空白對照未變色呈橘紅色，陽性對照完全變色，呈明黃色。

2.3 LAMP溫度優(yōu)化實驗結果

如圖3所示，在56 ℃時，作為空白對照的1變?yōu)槊鼽S色，出現(xiàn)假陽性，不是最適溫度。57 、58 ℃在60 min均為空白對照全不變色、陽性對照全部變色，結果均符合實驗要求，因此選擇反應時間較短的57 ℃為最適反應溫度。

圖3 溫度優(yōu)化實驗Fig. 3 Temperature optimization

2.4 LAMP體系優(yōu)化實驗結果

圖4 Mg2＋優(yōu)化實驗Fig. 4 Optimization of Mg2+ concentration

如圖4所示，LAMP反應60 min后，僅Mg2＋濃度3 mmol/L的未變色，出現(xiàn)假陰性結果，而Mg2＋濃度3、3.5、4、4.5、5 mmol/L均為空白對照不變色、陽性樣品全部變色。Mg2＋是較為重要的試劑之一，反應過程中起到降低反應所需要的活化能的作用，較高時容易出現(xiàn)假陽性，較少時混合溶液顏色偏淡難以區(qū)分，Mg2＋濃度4 mmol/L變色時間較3.5 mmol/L組少10 min且顏色對比更明顯。因此選擇Mg2＋較少、對比明顯、反應時間較短，即Mg2＋濃度4 mmol/L為最適Mg2＋濃度。

綜上，LAMP豬肉成分檢測最優(yōu)體系如表2所示。

表2 LAMP反應最優(yōu)體系Table 2 Optimal system of LAMP reaction

2.5 LAMP特異性實驗結果

圖5 LAMP特異性實驗Fig. 5 Specificity evaluation of LAMP

圖6 實時熒光定量LAMP特異性實驗Fig. 6 Results of real-time fluorescent quantitative LAMP detection

如圖5、6所示，LAMP反應60 min后，只有加入豬DNA的1和2變色，而空白對照15、16以及陰性對照3～14均不變色，且熒光定量LAMP實驗表明，僅加入豬DNA的1有明顯的擴增曲線，其他組均未出現(xiàn)，說明該引物特異性良好，實驗能有效區(qū)分豬DNA與其他DNA，不受其他動物線粒體DNA的干擾。

2.6 LAMP靈敏度實驗結果

圖7 模擬樣品豬LAMP靈敏度實驗Fig. 7 Sensitivity of LAMP to model porcine samples

模擬樣品的靈敏度實驗結果見圖7，在57 ℃反應60 min后，1～4均為明黃色，呈陽性結果，而5～6為橘紅色為陰性結果；不同模板DNA濃度的靈敏度實驗結果見圖8，57 ℃水浴加熱60 min后，2、3、4均變色且變色明顯，1、6、7、8完全不變，5微變，說明該方法可以有效檢測DNA質量濃度10 pg/μL以上摻假樣品，檢測1 pg/μL則不穩(wěn)定，難以檢測DNA質量濃度在1 pg/μL以下的樣品。因此，此方法能檢測豬肉含量1%及其以上的樣品，靈敏度為10 pg/μL。

2.7 LAMP穩(wěn)定性、適應性實驗結果

圖9 豬肉制品LAMP實驗Fig. 9 Detection of pork products by LAMP

豬肉制品LAMP實驗結果見圖9，含豬肉制品的各類反應均顯示陽性結果，證實該方法能有效檢測常見狀態(tài)的豬肉成分。經(jīng)過長時間、多次實驗，在60 min的實驗時間內，該體系能且只能對豬線粒體DNA進行擴增，對其他常見各種肉類均無擴增，且實驗過程中未出現(xiàn)假陽性，表明該LAMP法穩(wěn)定性良好。

2.8 其他方法比較驗證

由圖10可知，當實驗進行到45 個循環(huán)（即22.5 min）時，陽性組開始擴增，到75 個循環(huán)（即37.5 min）達到擴增峰值，隨后進入平臺期，陰性實驗組在120 個循環(huán)內均未出現(xiàn)明顯的擴增，反應曲線平緩，未出現(xiàn)峰值。

圖10 實時熒光定量LAMP擴增曲線Fig. 10 Real time fluorescence quantitative LAMP amplification curves

2.9 實時熒光定量PCR分析

圖11 實時熒光定量PCR擴增曲線（A）和熔解曲線（B）Fig. 11 Real-time fluorescence quantitative PCR amplification curve (A) and melting curve (B)

如圖11所示，陽性實驗組在40 個循環(huán)內完成擴增，熔解曲線Tm為79.25 ℃，與陰性實驗組對比明顯，陰性實驗組未擴增，且無Tm值，進一步證明了引物特異性良好。

3 討 論

提取DNA的方法有很多，如磁珠法、離心柱法、苯酚氯仿抽提法、CTAB法、差速離心法等，不同提取方法優(yōu)缺點較為明顯，在實際使用時實驗人員往往根據(jù)實驗室條件進行改良[23-25]，如劉昊等[26]在檢測開心果過敏原成分中提DNA用改良后的CTAB法提DNA，本實驗前期所用為商品化的試劑盒法，其原理是先通過差速離心提取目的基因，后用離心柱法進行純化，其優(yōu)點是安全、所提DNA純度較高，常用于PCR實驗，缺點是較為繁瑣、耗時較長、成本較高，LAMP技術較PCR技術等常規(guī)其他核酸擴增技術特異性更強，大量文獻表明LAMP實驗只需要幾十個拷貝甚至幾拷貝模板即可擴增[27-29]，在實際實驗過程中LAMP無需高純度的模板DNA，本實驗將提取過程簡化改良，原理是用差速離心法提取線粒體，而后通過超聲振蕩破碎線粒體直接釋放目的基因，此方法提取出來的DNA可在4 ℃穩(wěn)定保存1 d，－20 ℃穩(wěn)定保存7 d，如需長時間保存，依然需要用步驟1.3.2.1節(jié)和1.3.2.2節(jié)方法（即試劑盒法）提取DNA并于－20 ℃保存。

本實驗1.3.2.3節(jié)所提線粒體DNA未經(jīng)過純化，因此用于檢測模擬摻假樣品的檢測限僅有1%，相較Shi Ya等[30]建立的LAMP鴨源摻假檢測方法低一個數(shù)量級，但考慮到實際應用方面，低于1%的摻假率難以產生經(jīng)濟價值，因此1%已滿足現(xiàn)場快速定性檢測，若需要更低的檢測限，可用步驟1.3.2.1節(jié)和1.3.2.2節(jié)提取純化樣品DNA，本方法用純化提取的DNA靈敏度為10 pg/μL，優(yōu)于Taqman探針實時熒光PCR檢測方法[31]（0.5 ng/μL）、實時熒光PCR法[32]（0.5 ng/μL）。

快速、冰浴、充分研磨是保證提取線粒體DNA成功的關鍵要素，其中最為關鍵的是充分研磨，在摻假率較低時（1%），未能充分研磨很可能導致豬肌肉組織中的線粒體無法充分釋放，從而導致提取量少，產生假陰性。

自Notomi等[9]發(fā)明LAMP檢測技術到如今已有近20年的發(fā)展，最初通常以檢測焦磷酸鎂沉淀或凝膠電泳檢測擴增基因判斷結果，然而焦磷酸鎂沉淀難以肉眼觀測因此隨后發(fā)明了實時濁度儀用于檢測擴增，實時濁度儀用途狹窄、價格昂貴不利于推廣；而凝膠電泳耗時長且必須開蓋容易污染產生假陽性，因此部分學者開發(fā)出加入染料通過變色反應來檢測基因是否擴增，此方法具有低成本、耗時短、不易受到污染等優(yōu)點，目前常用的染料有 SYBR Green I[33]、鈣黃綠素[34]、疊氮溴化丙錠[35]以及羥基萘酚藍等，然而以上染料也有明顯的缺點限制，例如SYBR Green I是熒光染料，需要在特殊環(huán)境下進行觀察結果，而且這些都有較大的毒性，處理不慎容易對人體造成損害或是污染環(huán)境，4-(2-吡啶偶氮)間苯二酚鈉鹽是一種金屬離子顯色劑，本實驗以間苯二酚鈉鹽為染料，與Mn2＋螯合作為LAMP實驗的指示劑，可與LAMP反應產物焦磷酸根反應，從原來的橘紅色變?yōu)槊鼽S色，此染料具有顏色變化明顯，易于保存，毒性相較更低且價格低廉等優(yōu)點，在實際使用中較其他染料有明顯優(yōu)勢。

目前從事LAMP研究的專家學者除了研究對象的創(chuàng)新外，其主要創(chuàng)新點為檢測結果方法的改良，LAMP擴增的直接表現(xiàn)為焦磷酸根和目的基因的大量擴增，二者都無法通過肉眼直接觀測，如今一類方法通過觀察焦磷酸根的變化量判斷LAMP反應是否發(fā)生，如實時濁度儀等；另一類通過觀察目的基因是否擴增，如凝膠電泳、加入熒光染料等，目前這兩類改良研究頗多、較為成熟，然而目前針對LAMP技術的前處理方面研究較少，LAMP技術在食品檢測方面的實際應用一大難點是前處理復雜，目的微生物的培養(yǎng)和模板基因的提取存在提取時間長、純化步驟復雜、試劑毒性大等缺點，此類問題的出現(xiàn)并非LAMP技術本身的問題，而是因為現(xiàn)有的基因提取純化技術起初是針對PCR技術設計的，PCR對提取液純度要求較高，眾所周知，LAMP技術相較于PCR技術最大的優(yōu)點是靈敏度更高、特異性更強，本實驗證明了LAMP不需要過于復雜的DNA提取純化方法，純度不高的提取液依然可以用于LAMP實驗。簡化后的提取方法有效縮短整體實驗時間，提高了效率。可應用于本實驗建立起的豬肉成分LAMP檢測法，至于是否通用于其他LAMP檢測實驗還待進一步研究。

4 結 論

本實驗建立了檢測常見肉制品中豬肉成分的可視化LAMP檢測方法，并針對該方法進行了模板基因提取方法的簡化，極大地簡化了實驗過程，降低了實驗時間和條件，靈敏度為10 pg/μL，避免了常規(guī)LAMP法易出現(xiàn)假陽性的問題。進一步降低了成本，縮短了實驗時間，簡化實驗條件。豬肉成分摻假檢測中，從提取DNA到觀測結果時間最短為2 h，并且重復性和穩(wěn)定性效果良好，相較于其他豬肉檢測方法具有成本更低、操作更簡單、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，相較于其他LAMP檢測法具有可視化、不易污染、基因提取方便的特點，適用于多種常見肉制品豬肉摻假快速檢測。