低聚糖和多酚結(jié)合偏最小二乘判別分析鑒別油菜蜜產(chǎn)地

佘 僧，李 熠，宋洪波，陳蘭珍,*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（北京），北京 100093）

油菜屬于十字花科中的一種草本植物，環(huán)境適應(yīng)能力強、花期長、種植范圍廣。由2016年國家統(tǒng)計局公布的數(shù)據(jù)顯示：我國油料產(chǎn)量為3 400.05萬 t，油菜籽產(chǎn)量為1 312.80萬 t，油菜籽播種面積達6 622.80千 公頃[1]。油菜種植在湖北、江蘇、青海、四川等23 個省份基本全部覆蓋，其中湖北屬于我國最大的油菜籽生產(chǎn)區(qū)，江蘇屬于我國傳統(tǒng)油菜籽主產(chǎn)區(qū)，青海隨著新農(nóng)業(yè)經(jīng)濟和旅游資源的開發(fā)，油菜的種植面積也在不斷的擴增[2]。我國主導(dǎo)的蜂蜜采集仍屬于傳統(tǒng)的“追花奪蜜”模式，油菜不僅是我國重要的油料資源，也是優(yōu)質(zhì)的蜜源植物之一。我國油菜花開花時間從三月份的云貴高原、四川盆地至湖北、安徽等長江沿岸，四月份江蘇沿海直至七、八月份青海、內(nèi)蒙古草原，一直有大面積油菜花盛開。廣闊的油菜種植面積和跨越半年的油菜花期，提供了龐大的油菜蜜源，油菜蜜也成為了我國目前產(chǎn)量最高和出口量最大的單花蜜品種。自2007年中國農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志管理條令正式發(fā)布后，具有名優(yōu)產(chǎn)地標(biāo)識的產(chǎn)品被偽冒產(chǎn)品銷售給消費者的現(xiàn)象愈演愈烈，嚴(yán)重?fù)p害了優(yōu)質(zhì)品牌的信譽和消費者的信任，使得蜂蜜的產(chǎn)地溯源研究也變得更加迫切和需要[3-4]。油菜蜜作為我國單花蜜品種中蜜源植株分布最廣，氣候、地理環(huán)境最豐富的單花蜜品種，對研究蜂蜜的產(chǎn)地溯源具有重要的借鑒和參考價值。

蜂蜜的產(chǎn)地溯源技術(shù)主要包括穩(wěn)定同位素技術(shù)、核磁共振技術(shù)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)等[5-6]。色譜技術(shù)可定性分析樣品中營養(yǎng)物質(zhì)成分，結(jié)合質(zhì)譜后可獲得營養(yǎng)成分的定量結(jié)果，對于分析樣本的特定物質(zhì)含量具有優(yōu)勢性。本實驗采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定油菜蜜中的18 種多酚類物質(zhì)，氣相色譜-質(zhì)譜測定油菜蜜中的6 種低聚糖結(jié)合偏最小二乘判別分析（partial least square-discrimination analysis，PLS-DA）實現(xiàn)3 個油菜蜜產(chǎn)區(qū)的地理鑒別。低聚糖是通過2～4 個糖苷鍵將單糖連接而成小分子聚合物[7]。低聚糖含量占蜂蜜營養(yǎng)物質(zhì)的60%～80%，屬于蜂蜜中最主要的成分[8]。蜂蜜中的功能性低聚糖甜度低，耐熱耐酸強，不經(jīng)過胃腸消化便可直接被人體吸收利用，不增加血糖、血脂且改善腸胃吸收消化，提高免疫力等功效[9]。Da Costa Leite等[10]通過測定70 個巴西不同植物蜜源蜂蜜品種的10 種低聚糖物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)松二糖、麥芽三糖、麥芽糖具有顯著的品種鑒別能力。多酚廣泛存在于植物的根、葉、果實當(dāng)中，是植物次生代謝產(chǎn)物。蜂蜜中的多酚全部來源于蜜源植物。多酚類化合物是指分子結(jié)構(gòu)中有若干個酚羥基，主要包括苯酚、酚酸和黃酮類化合物[11-13]，具有清除自由基的抗氧化活性功效，對心血管病、動脈硬化等疾病具有預(yù)防作用[14-17]。Ku?等[18]通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析6 種單花蜜中多酚含量及其抗氧化活性差異，該研究表明石楠蜜和蕎麥蜜在6 種蜂蜜中抗氧化活性最高，且不同品種間的多酚含量具有顯著性差異。Baltrusaityte等[19]通過對35 份蜂蜜樣本中多酚提取物清除自由基能力進行實驗，研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜中多酚清除自由基能力平均在43%～95.7%之間，且抗氧化物質(zhì)的含量與酚類化合物的含量呈顯著相關(guān)。

目前，蜂蜜中低聚糖和多酚的研究，主要在于其營養(yǎng)醫(yī)藥價值、品種鑒別等方面，鮮見有關(guān)于兩者相結(jié)合對于產(chǎn)地鑒別效果的研究報道。因此本實驗采集湖北鐘祥市、江蘇鹽城市、青海剛察縣3 個不同地理環(huán)境的油菜蜜樣本，通過定量分析3 個產(chǎn)地油菜蜜中低聚糖和多酚兩個重要營養(yǎng)指標(biāo)的含量差異，并結(jié)合PLS-DA進行產(chǎn)地溯源研究，為蜂蜜的產(chǎn)地溯源研究提供方法參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜蜜樣本采自湖北鐘祥市（ZX）、江蘇鹽城市（YC）、青海剛察縣（GC）3 個不同地理來源的油菜主產(chǎn)區(qū)（表1）。3 個采樣地點的選擇具有顯著代表性，ZX（n=12）屬于內(nèi)陸地區(qū)，位于我國第2階梯高度，屬于亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)；YC（n=13）地處黃海入海口，位于我國第1階梯高度，屬于溫帶海洋性氣候區(qū)；GC（n=26）地處青藏高原，位于我國第3階梯高度，屬于高原大陸性氣候區(qū)。油菜植株均屬于甘藍型油菜，蜜蜂種類屬于意大利蜂；所有樣本均采自于油菜花盛花期，蜂場現(xiàn)場采集的樣本。油菜蜜樣本收集于250 mL玻璃瓶，封口膜密封，待測前貯存在4 ℃。

表1 樣本來源信息Table 1 Information about different geographical origins of rapes honey samples

去離子水（電阻率18.2 MΩ·cm） 美國Agilent公司；乙腈、甲醇、甲酸、氨水、鹽酸羥胺均為國產(chǎn)分析純；吡啶、β-苯基葡萄糖苷 北京百靈威科技有限公司；HMDS＋TMS＋吡啶、麥芽酮糖（純度≥98.0%）、松二糖（純度≥98%）、蔗果三糖（純度≥97.0%）、帕拉金糖（純度≥95.0%）、異麥芽糖（純度≥97%）、吡喃基葡蔗糖（純度≥97%）、沒食子酸（純度≥98.0%）、原兒茶酸（純度≥98.0%）、對羥基苯甲酸（純度≥98.0%）、咖啡酸（純度≥98.0%）、對香豆酸（純度≥98.0%）、阿魏酸（純度≥98.0%）、蘆丁（純度≥98.0%）、苯甲酸（純度≥98.0%）、楊梅酮（純度≥98.0%）、桑色素（純度≥98.0%）、槲皮素（純度≥98.0%）、柚皮苷（純度≥98.0%）、芹菜素（純度≥98.0%）、山柰素（純度≥98.0%）、柯因（純度≥98.0%）、松屬素（純度≥98.0%）、咖啡酸苯乙酯（純度≥98.0%）、高良姜素（純度≥98.0%） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q型純水器 美國Millipore公司；PHS-3E pH計上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；微量移液槍 德國Eppendorf公司；Vortex-Genie 2渦旋儀 美國Scientific Industry公司；PL203電子天平 美國Mettler-Toledo公司；QP2010-PIUS氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 日本Shimadzu公司；6460高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 低聚糖測定

油菜蜜中6 種低聚糖含量的測定方法參考文獻[20-21]方法。稱取油菜蜜樣本0.5 g于25 mL離心管中，置于40 ℃水浴鍋中溶解完全。隨后在溶解液中加入25 mL 80%乙醇溶液，攪拌至溶解完全，10 000 r/min離心10 min。取上清液100 μL，50 ℃氮氣吹干，置于60 ℃烘箱烘干，加入20 μL β-苯基葡萄糖苷（0.25 mg/mL，溶于吡啶）。加入200 μL 2.0%鹽酸羥氨溶液，70 ℃反應(yīng)30 min，然后加入衍生劑HMDS＋TMS＋吡啶300 μL，70 ℃反應(yīng)40 min，以4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液待測。

1.3.2 多酚測定

油菜蜜中18 種多酚含量的測定參考文獻[19,22-23]方法。稱取蜂蜜樣本5.0 g，置于50 mL離心管中，加入30 mL鹽酸溶液。將離心管置于渦旋儀上徹底溶解后，10 000 r/min離心10 min，取上清液等待固相微萃取。首先用甲醇和鹽酸溶液活化Oasis HLB固相萃取柱，然后將樣本上清液倒入已經(jīng)活化后的Oasis HLB固相萃取柱，隨后以純水清洗萃取柱。清洗結(jié)束后以10 mL甲醇洗脫多酚類物質(zhì)。洗脫液在40 ℃氮吹干，用1.0 mL甲酸-乙腈（7∶3，V/V）混合液溶解。將復(fù)溶液0.22 μm濾膜過濾后放入1.5 mL進樣瓶中，上機前待測。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個實驗樣本都預(yù)備3 個平行，3 次測定值差值不超過0.02，以均值作為最后分析數(shù)據(jù)。利用SPSS v.17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）[24]。數(shù)據(jù)服從于正態(tài)分布且齊次，單因素方差分析被用于研究不同產(chǎn)地油菜蜜低聚糖和多酚含量的顯著性差異，在α=0.05的置信區(qū)間服從Duncan檢測，數(shù)據(jù)分析的結(jié)果以 ±s的形式表示。利用PCA不同參數(shù)的載荷因子得分率，并利用Origin v.8.5軟件繪制柱形圖。利用SIMCA v.17.0軟件進行PLS-DA[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低聚糖含量分析

油菜蜜中含有多種低聚糖物質(zhì)，對ZX、YC、GC 3 個產(chǎn)地油菜蜜中含量較高的麥芽酮糖、松二糖、帕拉金糖、異麥芽糖、蔗果三糖、吡喃基葡蔗糖6 種低聚糖進行研究。由表2可知，ZX、YC、GC 3 個產(chǎn)地的油菜蜜樣本中6 種低聚糖含量均顯示：松二糖＞麥芽酮糖＞異麥芽糖＞帕拉金糖＞蔗果三糖＞吡喃基葡蔗糖。本實驗研究結(jié)果顯示油菜蜜中6 種功能性低聚糖，松二糖的含量最高，ZX、YC、 GC 3 個產(chǎn)地樣本中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（1.251±0.05）%、（1.344±0.03）%、（2.505±0.07）%、（0.027±0）%、（0.026±0.01）%、（0.128±0）%；吡喃基葡蔗糖的含量相對偏低，分別為（0.027±0）%、（0.026±0.01）%、（0.128±0）%。其次，3 個地區(qū)油菜蜜中的低聚糖含量存在一定差異，吡喃基葡蔗糖的含量為GC＞ZX＞YC；麥芽酮糖、松二糖、帕拉金糖、異麥芽糖、蔗果三糖5 種低聚糖的含量為GC＞YC＞ZX。單因素方差分析的結(jié)果顯示：麥芽酮糖、帕拉金糖、異麥芽糖、蔗果三糖、吡喃基葡蔗糖5 種低聚糖，GC與ZX、YC差異顯著，ZX與YC差異不顯著；ZX、YC、GC的松二糖含量差異顯著。

表2 不同產(chǎn)地油菜蜜中低聚糖的方差分析Table 2 ANOVA of oligosaccharide contents of rape honey from different geographical origins%

2.2 多酚含量分析

本研究通過對油菜蜜中含量較高的18 種多酚類物質(zhì)進行產(chǎn)地差異性研究分析。酚酸物質(zhì)分別包括：沒食子酸、原兒茶酸、羥甲基苯甲酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、苯甲酸、楊梅酮、桑色素、槲皮素、柚皮苷、芹菜素、山柰酚、柯因、松屬素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯。由表3可知，不同的多酚物質(zhì)其含量在油菜蜜中差異較大，3 個產(chǎn)地油菜蜜中18 種多酚類物質(zhì)含量的測定結(jié)果顯示：對羥基苯甲酸＞苯甲酸＞咖啡酸＞松屬素＞柯因＞山柰酚＞原兒茶酸＞槲皮素＞蘆丁＞柚皮苷＞咖啡酸苯乙酯＞高良姜素＞阿魏酸＞桑色素＞芹菜素＞沒食子酸＞楊梅酮。ZX、YC和GC 3 個產(chǎn)地的油菜蜜樣本中對羥基苯甲酸的含量最高，分別可達到（68.172±2.76）、（46.22±1.7）、（55.701±0.83）μg/100 g；其次是苯甲酸的含量，分別可達到（55.658±0.91）、（40.283±1.78）、（31.137±1.2）μg/100 g；此外，油菜蜜的18 種多酚類物質(zhì)含量最低的有芹菜素、沒食子酸、楊梅酮等。3 個地區(qū)油菜蜜樣本中芹菜素含量分別為（0.161±0.01）、（0.019±0）、（0.113±0.01）μg/100 g；沒食子酸含量分別為（0.14±0.01）、（0.117±0.01）、（0.108±0）μg/100 g；楊梅酮含量分別為（0.034±0）、（0.013±0.01）、（0.024±0）μg/100 g。

ZX、YC和GC 3 個地區(qū)油菜蜜中多酚的單因素方差分析結(jié)果顯示：油菜蜜中原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、楊梅酮、槲皮素、柚皮苷、芹菜素、山柰酚、柯因、松屬素的多酚含量，不同產(chǎn)地間存在顯著差異性；沒食子酸和蘆丁的含量，青海與湖北、江蘇存在顯著性差異，ZX與YC無顯著性差異；咖啡酸含量，YC與ZX、GC存在顯著性差異，ZX與GC無顯著性差異；桑色素、高良姜素，ZX與YC、GC存在顯著性差異，YC與GC無顯著性差異。綜合而言，本研究中ZX的多酚類物質(zhì)含量略高于YC、GC。

2.3 PCA結(jié)果

圖1 PCA的載荷因子得分圖Fig. 1 Loading plots of principal component analysis

PCA是一種無監(jiān)督分析模式，目前廣泛應(yīng)用于食品、化學(xué)、生物、數(shù)理統(tǒng)計分析等研究領(lǐng)域[26]。本實驗利用SPSS軟件對湖北、江蘇、青海3 個產(chǎn)地油菜蜜中6 種低聚糖和18 種多酚類物質(zhì)進行PCA研究。PCA中累積貢獻率越高則，說明其對于不同產(chǎn)地油菜蜜的鑒別程度越高[27]。本研究中前兩個主成分特征根值大于1，PC1、PC2、PC3貢獻率分別為55.51%、21.80%、3.99%，前3 個主成分的累積貢獻率達到81.3%。圖1顯示，PC1中多酚類物質(zhì)全部都為正值，其中原兒茶酸、松屬素、桑色素、槲皮素、柚皮苷、柯因最具有地理判別特征性。PC2中咖啡酸、咖啡酸苯乙酯、芹菜素、吡喃基葡蔗糖、阿魏酸、麥芽酮糖、松二糖、蔗果三糖的地理特征性最為顯著，其中沒食子酸、對香豆酸、苯甲酸、柚皮苷4 種酚酸類物質(zhì)均為負(fù)相關(guān)性。低聚糖對于PC1無貢獻率，在PC2中低聚糖的貢獻率較高。綜合而言，在產(chǎn)地判別率中，多酚類物質(zhì)的產(chǎn)地判別能力較為顯著。同時，低聚糖也是一個重要的輔助參數(shù)。

2.4 PLS-DA結(jié)果

圖2 油菜蜜中PLS-DA產(chǎn)地溯源模型得分圖Fig. 2 PLS-DA score plot for geographical traceability of rape honey

本實驗采用油菜蜜中低聚糖和多酚總計24 個參數(shù)結(jié)合PLS-DA對ZX、YC和GC 3 個不同地理來源的油菜蜜樣本進行產(chǎn)地鑒別研究。由圖2可知，湖北、江蘇、青海3 個地區(qū)的油菜蜜樣本完全分離，分類效果非常好；且樣本分布集中，鑒別率均為100%。PLS-DA模型潛變量1的R2X（自變量擬合指數(shù)）、R2Y（因變量擬合指數(shù)）、Q2（模型預(yù)測精度）以及特征根值分別為0.553、0.497、0.493、13.3；潛變量2的R2X、R2Y、Q2以及特征根值分別為0.773、0.975、0.97、5.29；潛變量3的R2X、R2Y、Q2以及特征根值分別為0.798、0.981、0.967、0.603。根據(jù)R2X、R2Y、Q2以及特征根值的分析，建立PLS-DA溯源模型的潛變量個數(shù)為2，該模型的產(chǎn)地識別預(yù)測精度可達到最高97%且內(nèi)部交叉驗證均方差為0.08，PLS-DA溯源模型的判別結(jié)果非常準(zhǔn)確且穩(wěn)定。

圖3 油菜蜜中PLS-DA產(chǎn)地溯源模型VIP圖Fig. 3 PLS-DA VIP plot for geographical traceability of rape honey

本研究的PLS-DA模型選定的潛變量個數(shù)為2，一般而言潛變量1對于整個模型的貢獻率最高，但為更加詳細(xì)的顯示各參數(shù)的重要性[28]，因此圖3將3 個潛變量的變量投影重要度（variable importance in the project，VIP）值全部展示出（3 個潛變量中VIP值均小于1的參數(shù)則不展示）。VIP值大于1則表示該參數(shù)屬于產(chǎn)地鑒定中重要的標(biāo)記指標(biāo)，而VIP值小于0.5則表示該參數(shù)對于鑒定結(jié)果不重要[29]。由此可知，在潛變量1中對于產(chǎn)地判別占據(jù)重要影響作用的指標(biāo)主要有對香豆酸、柚皮苷、原兒茶酸等16 種多酚，而低聚糖中僅松二糖、吡喃基葡蔗糖的VIP值大于1。其次，潛變量2和潛變量3的VIP圖中各參數(shù)重要性基本一致，對于產(chǎn)地判別重要性影響提供貢獻率最高的參數(shù)均是咖啡酸，最不重要的參數(shù)均為沒食子酸。低聚糖對于潛變量2、3中顯示為重要的參數(shù)與潛變量1對比，增加了麥芽酮糖與蔗果三糖。異麥芽糖與蔗果三糖，在3 個潛變量中均介于重要與不重要之間的灰色區(qū)域。

3 結(jié) 論

本研究對ZX、YC和GC 3 個完全不同的氣候和地理環(huán)境，油菜蜜樣本中低聚糖和多酚含量進行差異性研究分析。方差分析結(jié)果顯示6 種低聚糖和18 種多酚類物質(zhì)均存在一定的地理差異性。采用PCA對具有顯著貢獻率的參數(shù)進行分析，研究發(fā)現(xiàn)對香豆酸、柚皮苷、原兒茶酸、咖啡酸等具有顯著的地理特征性。而PLS-DA模型的研究結(jié)果顯示，3 個地方的判別正確率均為100%，無任何誤判樣本出現(xiàn)。同時，該模型留一法交叉驗證結(jié)果顯示其預(yù)測準(zhǔn)確率可達到97%，模型具有非常好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度。綜上可知，低聚糖和多酚結(jié)合PLS-DA技術(shù)對于不同地理來源油菜蜜的鑒別具有極大的研究價值和參考意義。