果膠多糖水熱法降解及其產(chǎn)物體外抗氧化性評(píng)價(jià)

姜美云，唐 碩，王 婷，賴晨歡，范一民，勇 強(qiáng),*

（1.南京林業(yè)大學(xué) 林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037）

果膠是一種天然大分子酸性多糖，分子質(zhì)量介于10～400 kDa之間，主要由半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖-I（rhamnogalacturonans I，RG-I）和鼠李半乳糖醛酸聚糖-II（rhamnogalacturonans II，RG-II）組成[1]。其中，HG主要是由D-半乳糖醛酸通過(guò)α-1,4糖苷鍵連接而成，且半乳糖醛酸殘基易被乙?；图柞セG-I主鏈?zhǔn)怯墒罄钐呛桶肴樘侨┧峤惶娼M成的重復(fù)單位，并帶有中性糖基側(cè)鏈。RG-II主鏈為聚半乳糖醛酸，側(cè)鏈含有4 種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的寡糖[2]。由于果膠結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子質(zhì)量大，溶解性差，導(dǎo)致其生物利用率低，限制了其生物活性的發(fā)揮。為提高果膠多糖的生物活性，降低果膠多糖分子質(zhì)量可顯著改善其生物活性和生物利用率[3]。目前，果膠多糖降解產(chǎn)物作為穩(wěn)定劑、增稠劑、凝膠劑和抗氧化劑廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)[4-6]。因此，近年來(lái)果膠多糖限制性水解技術(shù)成為果膠多糖高值化利用的研究熱點(diǎn)之一。

目前果膠多糖限制性水解的方法主要包括酶水解[7-8]、酸水解[9-11]和水熱法[12-13]。酶水解法雖然條件溫和，反應(yīng)專一性高，但由于果膠結(jié)構(gòu)復(fù)雜，導(dǎo)致酶法限制性水解果膠所需的果膠酶種類(lèi)繁多，且成本高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。酸水解法條件劇烈，水解程度不易控制，水解產(chǎn)物中單糖含量較高，且半乳糖醛酸容易形成內(nèi)酯[14]，降低了果膠多糖的限制性水解效率。水熱法是一種環(huán)保清潔的限制性水解方法，由于在水解過(guò)程中不添加外源酸，避免了設(shè)備腐蝕和環(huán)境污染等問(wèn)題，利于工業(yè)化放大生產(chǎn)。在果膠多糖的水熱法限制性水解過(guò)程中，果膠多糖中的部分酸性糖基以及乙?；撀洌尫潘嵝蕴呛鸵宜?，從而作為水熱過(guò)程中的弱酸催化劑，催化果膠多糖的限制性水解[15]。目前，水熱法已經(jīng)成功應(yīng)用于多種多糖的限制性水解[16-18]。Miyazawa等[17]報(bào)道了以聚半乳糖醛酸為原料，通過(guò)水熱法降解得到聚合度為2～10的低聚物；Saravana等[18]采用水熱法降解制備低分子質(zhì)量的褐藻糖膠，并發(fā)現(xiàn)水熱降解后的褐藻糖膠抗氧化性、抗菌性、抗凝活性等生物活性提高。但果膠多糖的水熱法可控降解報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)以商品果膠多糖為原料，采用水熱法降解果膠多糖。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察水熱處理溫度、水熱處理時(shí)間、pH值等因素對(duì)果膠多糖降解產(chǎn)物得率的影響；采用乙醇分級(jí)沉淀的方法分離制備出不同分子質(zhì)量的果膠多糖降解產(chǎn)物，并通過(guò)化學(xué)抗氧化法評(píng)價(jià)其體外抗氧化性。研究結(jié)果可為制備不同分子質(zhì)量的果膠多糖降解產(chǎn)物和開(kāi)拓活性果膠多糖降解產(chǎn)物的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商品果膠 上海麥克林生化科技有限公司；半乳糖醛酸等單糖標(biāo)準(zhǔn)樣品 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-3000型高效液相離子交換色譜儀（配有脈沖安培檢測(cè)器） 美國(guó)戴安公司；1200型高效液相色譜儀（配有示差檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent公司；油浴蒸煮罐35 mL。

1.3 方法

1.3.1 商品果膠的成分分析

1.3.1.1 糖基組成的測(cè)定

采用高效液相離子交換色譜法測(cè)定果膠多糖及其降解產(chǎn)物的糖基組成[19]。操作如下：稱取10 mg絕干質(zhì)量商品果膠或經(jīng)冷凍干燥處理的果膠多糖降解產(chǎn)物于5 mL水解瓶中，加入2 mL去離子水，每10 min搖勻一次。待果膠充分溶解后，加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的硫酸溶液并置于高溫滅菌鍋中于121 ℃反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束后，加入0.16 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的NaOH溶液進(jìn)行中和，并梯度稀釋到100 倍，采用DINOXICS-3000型高效液相離子交換色譜儀進(jìn)行定量分析（CarboPac PA10色譜柱和脈沖安培檢測(cè)器）。其中，葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖的分析條件為：柱溫30 ℃，流動(dòng)相200 mmol/L NaOH，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量10 μL；鼠李糖和半乳糖醛酸的分析條件為：柱溫30 ℃，流動(dòng)相200 mmol/L NaOH和500 mmol/L CH3COONa，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.1.2 酯化度的測(cè)定

采用化學(xué)滴定法對(duì)果膠酯化度進(jìn)行測(cè)定[20]。操作如下：稱取0.5 g絕干質(zhì)量果膠于燒杯中，分別加入95%乙醇溶液5.0 mL、氯化鈉1.0 g、去離子水100 mL和酚酞試劑3 滴，充分搖勻至果膠溶解。采用0.1 mol/L NaOH溶液進(jìn)行滴定直至體系變色，并記錄消耗量（記為VA）；然后，加入0.3 mol/L NaOH溶液25 mL，充分混合并靜置30 min，隨后加入0.3 mol/L鹽酸溶液25 mL并充分搖勻，最后用0.1 mol/L NaOH溶液滴定直至體系顏色變?yōu)榧t色，并記錄消耗量（記為VB）。果膠酯化度按公式（1）計(jì)算：

1.3.1.3 果膠多糖相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

采用凝膠滲透色譜測(cè)定商品果膠及其水熱降解產(chǎn)物的分子質(zhì)量[21-22]。操作條件如下：Agilent 1200型高效液相色譜儀，Ultrahydrogel 120和Ultrahydrogel 250串聯(lián)，柱溫55 ℃，流動(dòng)相0.6 mol/L KH2PO4溶液，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器。

1.3.2 水熱法降解果膠多糖條件優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

于35 mL的油浴蒸煮罐中，加入25 mL料液比為1∶25（g/mL）的初始商品果膠，分別于不同水熱處理?xiàng)l件下（水熱處理溫度分別為100、120、140、160 ℃和180 ℃，水熱處理時(shí)間分別為5、20、35、50 min和65 min，pH值分別為2、4、6、8、10和12）進(jìn)行果膠限制性水解反應(yīng)，以研究水熱處理溫度、水熱處理時(shí)間、pH值對(duì)果膠多糖降解產(chǎn)物得率的影響。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以商品果膠多糖降解產(chǎn)物得率為考察指標(biāo)，選取水熱處理溫度、水熱處理時(shí)間、pH值進(jìn)行3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)，以確定水熱法降解果膠多糖的最佳工藝條件，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.3.3 果膠多糖降解產(chǎn)物得率的計(jì)算

為避免未水解果膠多糖對(duì)果膠多糖降解產(chǎn)物得率計(jì)算的影響，采用乙醇沉淀法[23]對(duì)果膠水熱處理液進(jìn)行預(yù)處理，操作如下：于商品果膠水熱處理液中添加乙醇至乙醇終體積分?jǐn)?shù)為20%，充分混勻后靜置離心，以去除未水解的果膠多糖沉淀。果膠多糖降解產(chǎn)物仍溶解于上清液中，為計(jì)算果膠多糖降解產(chǎn)物得率，取10 mL的上清液，蒸發(fā)除去乙醇后加水定容至原體積。取5 mL上述樣品溶液，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%硫酸于121 ℃反應(yīng)1 h后，利用高效液相離子色譜測(cè)定酸解前后半乳糖醛酸的含量。果膠多糖降解產(chǎn)物得率和單糖得率（游離的半乳糖醛酸）按公式（2）、（3）計(jì)算：

式中：Ca為上清液酸解后半乳糖醛酸質(zhì)量濃度/（g/L）；Cb為上清液酸解前半乳糖醛酸質(zhì)量濃度/（g/L）；Cg為商品果膠酸解后半乳糖醛酸質(zhì)量濃度/（g/L）。

1.3.4 不同分子質(zhì)量果膠多糖降解產(chǎn)物的乙醇分級(jí)分離

將商品果膠于140 ℃和pH 6的條件下進(jìn)行水熱降解30 min，所得水熱處理液用于不同分子質(zhì)量果膠多糖降解產(chǎn)物的乙醇分級(jí)分離。當(dāng)體系中乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%和70%時(shí)，離心分離所得沉淀經(jīng)冷凍干燥、稱質(zhì)量計(jì)量后，分別標(biāo)記為組分S1、S2、S3，并對(duì)各組分的分子質(zhì)量和糖基組成進(jìn)行測(cè)定。具體操作過(guò)程如圖1所示。

圖1 水熱處理液經(jīng)乙醇分級(jí)沉淀獲得S1、S2和S3組分的操作步驟示意圖Fig. 1 Flow chart of the ethanol fractionation of the hydrothermal hydrolsate

1.3.5 果膠多糖降解產(chǎn)物體外抗氧化性的測(cè)定

1.3.5.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）自由基清除能力的測(cè)定

于15 mL試管中依次加入2 mL不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L）的多糖溶液，加入2 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L，溶于80%乙醇溶液中），混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為A0[24]。對(duì)照組為不同質(zhì)量濃度多糖樣品2 mL，分別加入2 mL無(wú)水乙醇，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為A1。空白組為2 mL無(wú)水乙醇，加入2 mL DPPH溶液，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為A2。以相同質(zhì)量濃度的VC做陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)2 次。DPPH自由基清除率按公式（4）計(jì)算：

1.3.5.2 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

利用鄰苯三酚的自氧化方法檢測(cè)多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用。于15 mL試管中依次加入1 mL不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L）的多糖溶液，加入4.5 mL 0.05 mol/L（pH 8.2）的Tris-HCl緩沖液，然后在25 ℃水浴中預(yù)熱20 min。取0.5 mL預(yù)熱好的45 mmol/L鄰苯三酚，加入到樣品中，迅速混勻，5 min內(nèi)于325 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為A0[25]。用蒸餾水代替鄰苯三酚時(shí)測(cè)得的吸光度記為A1?？瞻捉M以蒸餾水代替多糖樣品，吸光度記為A2。以相同質(zhì)量濃度的VC做陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)2 次。超氧陰離子自由基清除率按公式（5）計(jì)算：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以 ±s表示，采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、Origin Pro 2017軟件作圖。采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析和方差分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 商品果膠糖基成分分析

為分析果膠多糖中的糖基組成，本實(shí)驗(yàn)中采用高效液相離子交換色譜法分析商品果膠多糖完全水解產(chǎn)物，結(jié)果如表2所示。

表2 商品果膠的糖基組成分析Table 2 Glycosyl composition analysis of commercial pectin

由表2可知，商品果膠的主要成分是酸性糖半乳糖醛酸基，占果膠多糖干基的62.10%；中性糖基總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.29%，包括葡萄糖基、半乳糖基、木糖基、鼠李糖基和阿拉伯糖基。Wang Xin等[26]報(bào)道了商品蘋(píng)果果膠糖基組成，其中半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66.00%，中性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.50%，與本實(shí)驗(yàn)中商品果膠的糖基組成基本一致。

2.2 水熱法降解果膠多糖單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 水熱處理溫度對(duì)果膠多糖降解產(chǎn)物得率的影響

在商品果膠料液比1∶25（g/mL）、pH 2.6（果膠溶液自然pH值）、水熱處理35 min條件下，分別考察水熱處理溫度（100、120、140、160 ℃和180 ℃）對(duì)果膠多糖降解產(chǎn)物得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 水熱處理溫度對(duì)果膠多糖降解產(chǎn)物得率的影響Fig. 2 Effect of hydrothermal treatment temperature on the degradation efficiency of pectic polysaccharide

由圖2可知，當(dāng)水熱預(yù)處理溫度在100～140 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，果膠多糖降解產(chǎn)物得率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，由16.7%提高至42.0%，單糖得率從0.4%提高到5.5%。而當(dāng)溫度從140 ℃升高至180 ℃時(shí)，果膠多糖降解產(chǎn)物得率急劇下降，從42.0%下降至0.4%；而單糖得率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，并在160 ℃時(shí)，單糖得率達(dá)到最高（6.5%）。這可能是由于在較高的水熱處理強(qiáng)度（140～160 ℃）下，部分果膠多糖徹底降解為單糖，使得單糖得率提高；而當(dāng)水熱處理溫度進(jìn)一步升高至180 ℃時(shí)，單糖得率急劇下降至0.1%，這是由于過(guò)高的預(yù)處理溫度使得單糖進(jìn)一步降解產(chǎn)生糠醛等衍生物[27]；此外，半乳糖醛酸易形成內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致糖得率顯著下降[14]。Martínez等[28]報(bào)道了以橘皮廢液為原料的水熱法制備果膠多糖，其水熱條件優(yōu)化結(jié)果表明，水熱處理最適溫度同樣為140 ℃。因此果膠多糖水熱法降解的適宜溫度為140 ℃左右。

2.2.2 水熱處理時(shí)間對(duì)果膠多糖降解產(chǎn)物得率的影響

在商品果膠料液比1∶25（g/mL）、pH 2.6（果膠溶液自然pH值）、水熱處理溫度140 ℃條件下，分別考察水熱處理時(shí)間（5、20、35、50、65 min）對(duì)果膠多糖降解產(chǎn)物得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 水熱處理時(shí)間對(duì)果膠多糖降解產(chǎn)物得率的影響Fig. 3 Effect of hydrothermal treatment time on the degradation efficiency of pectic polysaccharide

由圖3可知，當(dāng)水熱處理時(shí)間由5 min延長(zhǎng)至20 min時(shí)，果膠多糖降解產(chǎn)物得率由21.5%提高至43.3%；與此同時(shí)，單糖得率由0.3%增加至3.0%。然而，進(jìn)一步延長(zhǎng)水熱處理時(shí)間至65 min時(shí)，果膠多糖降解產(chǎn)物得率呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)，由43.3%下降至21.7%；單糖得率卻呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，由3.0%提高至13.8%，說(shuō)明水熱處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致果膠多糖限制性降解產(chǎn)物進(jìn)一步水解為單糖，從而降低果膠多糖降解產(chǎn)物得率。因此選擇果膠多糖水熱法降解的適宜時(shí)間為20 min左右。

2.2.3 pH值對(duì)果膠多糖降解產(chǎn)物得率的影響

在商品果膠料液比1∶25（g/mL）、水熱處理溫度140 ℃、水熱處理20 min條件下，考察pH值（2、4、6、8、10、12）對(duì)果膠多糖降解產(chǎn)物得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4所示，若控制pH值在2～12時(shí)，果膠多糖降解產(chǎn)物得率和單糖得率無(wú)明顯變化，果膠多糖降解產(chǎn)物得率維持在41.1%～42.5%范圍內(nèi)，單糖得率維持在5.9%～7.5%范圍內(nèi)。說(shuō)明水熱處理的pH值對(duì)果膠多糖降解產(chǎn)物得率和單糖得率無(wú)顯著影響。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)水熱處理pH值為2～12時(shí)，水熱處理30 min后，體系的pH值均處于2.1～2.8。這說(shuō)明在140 ℃水熱處理過(guò)程中，果膠多糖的乙?；桶肴樘侨┧峄罅棵撀鋄15]，使整個(gè)處理體系的pH值急劇降低，從而削弱了pH值對(duì)果膠多糖降解得率的影響。

圖4 pH值對(duì)果膠多糖降解產(chǎn)物得率的影響Fig. 4 Effect of pH on the degradation efficiency of pectic polysaccharide

2.3 水熱降解法正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 果膠多糖降解L9（33）的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal array design L9 (33) with experimental results

按照正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳工藝條件（表3），即水熱處理溫度140 ℃、水熱處理時(shí)間30 min、pH 6，重復(fù)3 次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，果膠多糖得率分別為45.8%、46.3%、46.5%，平均得率為46.2%，表明該方法穩(wěn)定可靠。由表4可知，對(duì)果膠多糖降解得率的影響：水熱處理溫度＞水熱處理時(shí)間＞pH值。

表4 方差分析與顯著性分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance of regression equation and significance test

2.4 不同分子質(zhì)量范圍果膠多糖降解產(chǎn)物的分離

采用乙醇分級(jí)沉淀法，將商品果膠多糖水熱降解產(chǎn)物進(jìn)行分離，分別于乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%和70%下獲得果膠多糖降解產(chǎn)物S1、S2和S3三個(gè)組分。采用凝膠排阻色譜分析商品果膠多糖和3 種果膠多糖降解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，結(jié)果如圖5所示。

圖5 果膠多糖活性降解產(chǎn)物中S1、S2和S3組分的分子質(zhì)量分布Fig. 5 Molecular mass distribution of S1, S2 and S3

由圖5可知，3 種果膠多糖降解產(chǎn)物的信號(hào)峰呈現(xiàn)典型的正態(tài)分布，表明此3 種組分經(jīng)乙醇分級(jí)分離后分子質(zhì)量相對(duì)均一。此外，經(jīng)GPC Addon軟件分析結(jié)果表明，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸增加，其沉淀分離所得的果膠多糖降解產(chǎn)物分子質(zhì)量逐漸降低（表5）。與商品果膠相比，果膠多糖經(jīng)過(guò)水熱法降解后，分子質(zhì)量大大降低。

表5 不同分子質(zhì)量果膠多糖的性質(zhì)分析Table 5 Properties of degradation products of pectic polysaccharide with different molecular masses

在此基礎(chǔ)上，采用高效液相離子交換色譜法分析3 種果膠多糖降解產(chǎn)物的糖基組成，結(jié)果如表5所示。經(jīng)乙醇分級(jí)沉淀技術(shù)分離制備的3 種組分S1、S2、S3糖基組成與商品果膠的糖基組成基本相似。并且這3 種降解產(chǎn)物占水熱總糖的質(zhì)量百分比分別為37.8%、19.2%和41.3%。綜上所述，采用乙醇分級(jí)沉淀技術(shù)可實(shí)現(xiàn)果膠多糖降解產(chǎn)物的有效分離與制備，并通過(guò)高效液相離子交換色譜法分析還可實(shí)現(xiàn)不同分子質(zhì)量果膠多糖降解產(chǎn)物的定量分析，為不同分子質(zhì)量范圍果膠多糖降解產(chǎn)物的抗氧化性研究提供技術(shù)支持。

2.5 不同分子質(zhì)量果膠多糖降解產(chǎn)物的抗氧化活性

2.5.1 DPPH自由基清除能力

如圖6所示，果膠多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力與其聚合度和質(zhì)量濃度的大小有關(guān)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～3.0 g/L時(shí)，商品果膠對(duì)DPPH自由基的清除率均低于15.0%；而果膠多糖降解產(chǎn)物S1、S2和S3組分對(duì)DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增大而顯著增強(qiáng)。當(dāng)果膠多糖降解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為3.0 g/L時(shí)，S1、S2和S3組分的DPPH自由基清除率分別達(dá)49.8%、45.1%和39.8%，分別是商品果膠清除率的4.0、3.6 倍和3.2 倍。這一研究結(jié)果與李健軍[29]的研究結(jié)果一致。綜上所述，采用水熱法降解果膠多糖可顯著提高其清除DPPH自由基的能力。

圖6 不同分子質(zhì)量的果膠多糖降解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig. 6 DPPH radical scavenging effects of peptic oligosaccharides with different molecular masses on

2.5.2 超氧陰離子自由基清除能力

圖7 不同分子質(zhì)量的果膠多糖降解產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig. 7 Superoxide anion scavenging effects of pectic oligosaccharides with different molecular masses

如圖7所示，商品果膠與其水熱降解產(chǎn)物均具有清除超氧陰離子自由基的能力。在質(zhì)量濃度0.5～3.0 g/L范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的不斷增大，商品果膠超氧陰離子自由基清除率從69.2%下降到5.5%。S1、S2、S3組分對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力隨分子質(zhì)量的增大而減小，可能是因?yàn)樯唐饭z和各組分隨著質(zhì)量濃度的提高，增加了鄰苯三酚的氧化速率，從而提供了更多的超氧陰離子，但S1、S2、S3組分下降速率緩慢，因此清除能力均高于商品果膠。當(dāng)質(zhì)量濃度為3.0 g/L時(shí)，S3組分清除率可達(dá)到58.7%，是商品果膠超氧陰離子自由基清除能力的10 倍，這一研究結(jié)果與郝杰等[30]的研究結(jié)果一致。綜上所述，水熱法降解果膠多糖顯著提高了其對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力。

3 結(jié) 論

采用水熱法對(duì)果膠多糖進(jìn)行限制性水解，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定水熱法降解果膠多糖的最佳工藝條件為：水熱處理溫度140 ℃、水熱處理時(shí)間30 min、pH 6；在此條件下，果膠多糖降解產(chǎn)物得率最高為46.2%。

通過(guò)乙醇分級(jí)沉淀可實(shí)現(xiàn)果膠多糖降解產(chǎn)物的有效分離，分別獲得重均分子質(zhì)量為13.4、7.5 kDa和5.7 kDa的3 個(gè)果膠多糖降解產(chǎn)物組分。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)高效液相離子交換色譜法分析可實(shí)現(xiàn)不同分子質(zhì)量果膠多糖降解產(chǎn)物的定量分析。

抗氧化活性研究表明，果膠多糖降解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力顯著高于商品果膠。其中，S1組分對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，清除率可達(dá)到49.8%，是商品果膠多糖清除率的4 倍；在質(zhì)量濃度0.5～3 g/L范圍內(nèi)，與商品果膠和S1、S2組分相比，S3組分對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力最強(qiáng)。由此可見(jiàn)，水熱降解有效提高了果膠多糖對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力。