姜黃醇提物化學(xué)成分及其抗氧化活性分析

劉 宇，熊 亮，彭 成，李小翠，蒙春旺，劉 菲,*，郭 力,*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，四川 成都 611137）

氧化應(yīng)激反應(yīng)是人類身體衰老和健康問題的最大敵人之一，人體內(nèi)外多種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的過量自由基，可以引發(fā)氧化脅迫反應(yīng)，不僅導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)損傷和功能缺失，促使機體衰老，而且會加劇阿爾茨海默病、心血管疾病、惡性腫瘤等相關(guān)疾病的發(fā)展[1-2]，因此應(yīng)用抗氧化劑保持人體健康和預(yù)防疾病在現(xiàn)代社會具有廣泛的需求[3]，抗氧化劑研究和開發(fā)越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[4-6]。由于合成抗氧化劑具有潛在的身體危害[7-8]，所以從植物中尋找高效、低毒、廉價的天然抗氧化劑成為目前抗氧化劑開發(fā)的必然趨勢[9-10]，目前從植物中提取分離得到的天然抗氧化劑種類繁多，其化學(xué)成分類型包括多酚類、類胡蘿卜素、迷迭香等[11]。其中，酚類成分的抗氧化活性在紛繁復(fù)雜的天然產(chǎn)物中得到的廣泛的肯定和認(rèn)可[12]。

姜黃來源于姜科植物姜黃（Curcuma longa L.）的干燥根莖，富含酚類成分。研究表明姜黃具有良好的抗氧化活性[13]。趙革平等[14]研究發(fā)現(xiàn)姜黃醇提物是有效的抗氧化劑，但是研究限于粗提物，并未深入到具體的單體化合物水平，為進一步闡明姜黃醇提物的抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)，本實驗對其醇提物中的酚類成分進行分離鑒定，并對獲得的單體化合物進行了抗氧化活性篩選。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃飲片購于四川新荷花中藥飲片有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物研究室龍飛教授鑒定為姜黃的干燥根莖。

甲醇（色譜純） 美國Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2 -picrylhydrazyl，DPPH）美國Sigma公司；2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 南京都萊生物技術(shù)有限公司；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇、濃硫酸、VC（均為分析純） 成都市科隆化學(xué)品有限公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠（RPC18，40～60 μmol/L） 月旭科技（上海）股份公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bruker-500核磁共振波譜儀 德國Bruker公司；Synapt G2 高分辨質(zhì)譜儀 美國Waters公司；1220型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Varioska多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo Scientific公司；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠 瑞典Amershan Pharmacia公司；Gradient Former B-687中壓液相色譜儀 瑞士Büchi公司；ZF-90多功能暗箱式紫外透射儀 上海寶山顧村電光儀器廠；Milli-Q Reference超純水儀 德國默克集團；柱色譜硅膠H和薄層色譜硅膠GF254 青島海洋化工廠；GF254硅膠制備薄層板 煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司；Coring Costar 96孔酶標(biāo)板 美國康寧公司。

1.3 方法

1.3.1 提取與分離

將姜黃飲片50 kg，加95%乙醇溶液浸泡過夜，回流提取2 次，第1次2 h，第2次1.5 h，合并提取液，50 ℃減壓濃縮得干燥浸膏7 kg。浸膏加水適量成為混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯反復(fù)萃取，將萃取液于50 ℃減壓濃縮，得石油醚萃取物1.6 kg，乙酸乙酯萃取物3 kg。

取乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜（150 cm×22 cm），分別用石油醚-乙酸乙酯溶液（1∶0、7∶3、4∶6、0∶1，V/V）和乙酸乙酯-甲醇溶液（1∶1、0∶1，V/V）洗脫，每種梯度的洗脫液收集在一起，并依次編號為Fr. 1～Fr. 6，F(xiàn)r. 1～Fr. 6洗脫液經(jīng)50 ℃減壓濃縮至浸膏狀，選擇Fr. 2（500 g）經(jīng)硅膠柱色譜（150 cm×22 cm），用二氯甲烷-乙酸乙酯溶液（100∶1～0∶1，V/V）梯度洗脫，洗脫液每500 mL收集一份，以薄層色譜（10 cm×20 cm）檢視，合并相似洗脫餾分并減壓濃縮，共分得17 個餾分，依次編號為JHA～JHQ；其中，JHI組分經(jīng)中壓液相色譜（30 cm×4 cm），以甲醇溶液（30%～100%）梯度洗脫，洗脫液每50 mL收集一份，以薄層色譜（10 cm×20 cm）檢視，合并相似餾分并減壓濃縮，最后得到15 個餾分（JHI-1～JHI-15），其中JHI-2經(jīng)過葡聚糖凝膠SephadexLH-20柱色譜、硅膠制備薄層色譜（20 cm×20 cm）、高效液相色譜分離得到化合物1～5，JHI-2經(jīng)過葡聚糖凝膠SephadexLH-20柱色譜、硅膠制備薄層色譜反復(fù)制備得到化合物6和化合物7。

1.3.2 抗氧化活性測定

由于化合物7（香草醛）為植物常見化學(xué)成分，在植物姜黃中不屬于具有代表性的成分，因此本實驗選擇化合物1～6進行抗氧化活性篩選。

1.3.2.1 ABTS陽離子自由基清除測定

參照曾維才等[15]的方法，稍有改變。用超純水配制40 mL含ABTS（7 mmol/L）與過硫酸鉀（2.45 mmol/L）的混合溶液，使其在23 ℃的暗處避光反應(yīng)16 h，制備得到ABTS基液。然后取2 mL基液用超純水稀釋，制得在734 nm波長處吸光度為0.70±0.02的ABTS工作液。取80 μL不同濃度化合物的95%乙醇溶液與400 μL的ABTS工作液混勻，23 ℃孵育6 min，孵育液置于96 孔板中用酶標(biāo)儀測定[16-17]，不同濃度的孵育液分別設(shè)置3 個孔，每孔150 μL，測量反應(yīng)混合物在734 nm波長處的吸光度，吸光度取平均值，以VC作陽性對照，95%乙醇溶液作空白對照。ABTS陽離子自由基清除率按公式（1）計算：

式中：A1為化合物孵育液吸光度；A0為空白對照組孵育液吸光度。

1.3.2.2 DPPH自由基清除率測定

參考曾維才等[15]的方法，稍有改變。以95%乙醇溶液為溶劑配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液，此溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。取250 μL不同濃度的受試物溶液同250 μL DPPH溶液混合，25 ℃避光孵育30 min，孵育液置于96 孔板中測定，不同濃度的孵育液分別設(shè)置3 個孔，每孔150 μL，測量反應(yīng)混合物在517 nm波長處的吸光度，吸光度取平均值，以VC作陽性對照，95%乙醇溶液作空白對照。DPPH自由基清除率按公式（2）計算：

式中：A1為化合物孵育液吸光度；A0為空白對照組孵育液吸光度。

1.3.2.3 還原力測定

參考曾維才等[15]的方法，稍有改變。取100 μL不同濃度的受試物溶液，與100 μL磷酸緩沖液（0.2 mmol/L，pH 6.6）和100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)l%鐵氰化鉀溶液混勻，50 ℃孵育20 min，迅速冷卻，加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液，混合后，加入100 μL超純水和20 μL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，混合液置于96 孔板中測定，不同濃度的混合液分別設(shè)置3 個孔，每孔150 μL，測量反應(yīng)混合物在700 nm波長處的吸光度，吸光度取平均值，以VC為陽性對照，95%乙醇溶液為空白對照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

ABTS陽離子自由基清除實驗和DPPH自由基清除率測定實驗的半抑制濃度IC50值用SPSS 18.0的Probit Regression計算；還原力測定實驗吸光度與給藥濃度之間的關(guān)系以GraphPad Prism 5繪制折線圖表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

本實驗共分離鑒定得到7 個化合物，依次編號為化合物1～7，采用Bruker-500核磁共振波譜儀，以氘代丙酮（CD3COCD3）為溶劑，對化合物1～7進行核磁共振氫譜分析，以Waters Synapt G2高分辨質(zhì)譜儀對化合物1～7進行分子式、分子質(zhì)量分析，將化合物1～7以硅膠GF254為載體進行薄層展開，以多功能暗箱式紫外透射儀、10%硫酸乙醇試劑對化合物進行檢視，研究其理化性質(zhì)，以FeCl3試劑進行酚羥基反應(yīng)驗證其化學(xué)結(jié)構(gòu)中酚羥基的有無。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物4為新天然產(chǎn)物，化合物1、2、3和6為姜黃屬首次發(fā)現(xiàn)，化合物7為香草醛（略去），結(jié)構(gòu)鑒定如圖1所示。

圖1 化合物1～6化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of compounds 1 to 6

化合物1：無色油狀物，[α]D25=＋9.76（c 0.27,EtOH），以多功能暗箱式紫外透射儀進行薄層檢視，在254 nm波長處呈現(xiàn)明顯的暗斑，硫酸乙醇顯色為藍紫色，與FeCl3反應(yīng)呈陽性，HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 219.089 6[M＋Na]＋，提示其分子式為C11H16O3（理論計算值C11H16O3Na，219.099 7），不飽和度為4。1H NMR（500 MHz，CD3COCD3）δ：7.23（1H，s，Ar-OH），6.81（1H，s，H-2’），6.72（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5’），6.64（1H，d，J = 8.0 Hz，H-6’），3.82（3H，s，—OCH3），3.72（1H，m，H-2），3.47（1H，d，J = 5.0 Hz，—OH），2.66（1H，m，H-4a），2.56（1H，m，H-4b），1.67（2H，m，H-3a，H-3b），1.14（3H，d，J = 6.0 Hz，—CH3）。以上數(shù)據(jù)和文獻[18]對照一致，鑒定為Zingerol，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物2：無色油狀物，以多功能暗箱式紫外透射儀進行薄層檢視，在254 nm波長處呈現(xiàn)明顯的暗斑，硫酸乙醇顯色為藍紫色，與FeCl3反應(yīng)呈陽性，HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 247.095 3[M＋Na]＋，提示其分子組成為C12H16O4（理論計算值C12H16O4Na，247.084 1），不飽和度為5。1H NMR（500 MHz，CD3COCD3）δ：7.33（1H，br s，Ar-OH），6.85（1H，d，J = 2.0 Hz，H-2’），6.73（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5’），6.67（1H，dd，J = 8.0，2.0 Hz，H-6’），4.07（2H，q，J = 7.0 Hz，—CH2—），3.83（3H，s，—OCH3），2.82（2H，t，J = 7.5 Hz，H-3a，H-3b），2.56（2H，t，J = 7.5 Hz，H-2a，H-2b），1.19（3H，t，J = 7.0 Hz，—CH3）。以上數(shù)據(jù)和文獻[19]對照一致，鑒定為Dihydroferulic acid ethyl ester，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物3：無色油狀物，以多功能暗箱式紫外透射儀進行薄層檢視，在254 nm波長處呈現(xiàn)明顯的暗斑，硫酸乙醇顯色為藍紫色，與FeCl3反應(yīng)呈陽性，HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 217.082 5[M＋Na]＋，推測其分子式為C11H14O3（理論計算值C11H14O3Na，217.084 1），不飽和度為5。1H NMR（500 MHz，CD3COCD3）δ：8.16（1H，br s，Ar-OH），7.05（2H，d，J = 8.5 Hz，H-2’，H-6’），6.74（2H，d，J = 8.5 Hz，H-3’，H-5’），4.06（2H，q，J = 7.0 Hz，—CH2—），2.81（2H，t，J = 7.5 Hz，H-3a，H-3b），2.53（2H，t，J = 7.5 Hz，H-2a，H-2b），1.18（3H，t，J = 7.0 Hz，—CH3）。以上數(shù)據(jù)和文獻[20]對照一致，鑒定為乙基-3-(4-羥基-苯基)-丙酸乙酯，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物4：無色油狀物，以多功能暗箱式紫外透射儀進行薄層檢視，在254 nm波長處呈現(xiàn)明顯的暗斑，硫酸乙醇顯色為藍紫色，與FeCl3反應(yīng)呈陽性，HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 409.163 4[M＋Na]＋，提示其分子式為C22H26O6（理論計算值C22H26O6Na，409.162 7），不飽和度為10。1H NMR（500 MHz，CD3COCD3）δ：6.84（2H，d，J = 2.0 Hz，H-2，H-2’），6.71（2H，d，J = 2.0 Hz，H-4，H-4’），3.86（6H，s，—OCH3×2），2.79（8H，s，H-1a，H-1b，H-1a’，H-1b’，H-2a，H-2b，H-2a’，H-2b’），2.10（6H，s，—CH3×2）。以上數(shù)據(jù)和文獻[21]對照，鑒定為化合物Zingerone dimer [4,4’-(6,6’-dihydroxy-5,5’-dimethoxy-[1,1’-biphenyl]-3,3’-diyl)bis(butan-2-one)]，該化合物為首次從植物中分離鑒定，為新穎的天然產(chǎn)物，且為化合物5的二聚體，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物5：無色油狀物，以多功能暗箱式紫外透射儀進行薄層檢視，在254 nm波長處呈現(xiàn)明顯的暗斑，硫酸乙醇顯色為藍紫色，與FeCl3反應(yīng)呈陽性，HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 217.083 8[M＋Na]＋，提示其分子式為C11H14O3（理論計算值C11H14O3Na，217.084 1），不飽和度為5。1H NMR（500 MHz，CD3COCD3）δ：7.28（1H，s，Ar-OH），6.82（1H，d，J = 2.0 Hz，H-2’），6.71（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5’），6.64（1H，dd，J = 8.0，2.0 Hz，H-6’），3.82（3H，s，—OCH3），2.74（4H，s，H-3a，H-3b，H-4a，H-4b)，2.08（3H，s，—CH3）。以上數(shù)據(jù)和文獻[22]對照一致，鑒定為姜酮，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物6：無色油狀物，以多功能暗箱式紫外透射儀進行薄層檢視，在254 nm波長處呈現(xiàn)明顯的暗斑，硫酸乙醇顯色為藍紫色，與FeCl3反應(yīng)呈陰性，HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 231.099 6[M＋Na]＋，提示其分子式為C12H16O3（理論計算值C12H16O3Na，231.099 7），不飽和度為5。1H NMR（500 MHz，CD3COCD3）δ：6.83（1H，s，H-2’），6.82（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5’），6.72（1H，dd，J = 8.0，2.0 Hz，H-6’），3.78（3H，s，—OCH3at C4’），3.76（3H，s，—OCH3at C3’），2.76（4H，s，H-3a，H-3b，H-4a，H-4b），2.08（3H，s，—CH3）。以上數(shù)據(jù)和文獻[23]對照，鑒定為化合物4-(3,4-二甲氧基苯基)丁烷-2-酮，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物7：無色油狀物，有特殊香味，以多功能暗箱式紫外透射儀進行薄層檢視，在254 nm波長處呈現(xiàn)明顯的暗斑，硫酸乙醇顯色為藍紫色，與FeCl3反應(yīng)呈陽性，HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 175.031 4[M＋Na]＋，提示其分子式為C8H8O3（理論計算值C8H8O3Na，175.037 1），不飽和度為6。1H NMR（500 MHz，CD3COCD3）δ：9.82（1H，s，—CHO），7.45（1H，d，J = 8.0 Hz，H-6），7.44（1H，s，H-2），7.00（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5），3.93（3H，s，—OCH3）。以上數(shù)據(jù)和文獻[24]對照，鑒定為香草醛。

2.2 化合物的抗氧化活性

2.2.1 ABTS陽離子自由基的清除

表1 化合物1～6對ABTS陽離子自由基、DPPH自由基的IC50Table 1 Half maximal inhibitory concentration (IC50) of compounds 1 to 6 against ABTS radical cations and DPPH radicals

根據(jù)不同濃度受試物對ABTS溶液吸光度的影響測定天然產(chǎn)物對ABTS陽離子自由基的清除能力，該方法最早由Miller等提出[25]。如表1所示，陽性對照VC的IC50為（13±1.1）μmol/L，化合物1～6中，化合物1對ABTS陽離子自由基的清除效果最好，IC50為（3±0.2）μmol/L，效果遠強于陽性對照，化合物2效果和VC效果相當(dāng)，化合物3效果為VC的1/2，化合物4對ABTS陽離子自由基有一定的清除效果，化合物5對ABTS陽離子自由基清除作用較弱，化合物6與陽性對照對比清除作用非常弱，幾乎無效。

2.2.2 DPPH自由基的清除

DPPH自由基清除實驗中，受試物給出的氫原子與DPPH自由基結(jié)合，使反應(yīng)溶液的吸光度發(fā)生變化，通過比較實驗組與空白組溶液吸光度的變化評價受試物的抗氧化活性結(jié)果[26]。如表1所示，陽性對照VC對DPPH自由基清除率的IC50為（7±0.3）μmol/L，效果最好的是2號化合物，IC50為（16±1.2）μmol/L，清除效果約為陽性對照的1/2，另外化合物1清除DPPH自由基的效果也較好，IC50為（65±4.4）μmol/L，化合物4、5對DPPH自由基有一定的清除效果，化合物6對DPPH幾乎無清除作用。

2.2.3 還原力

研究表明，還原能力是表征物質(zhì)在氧化還原反應(yīng)中給出電子自身發(fā)生氧化的能力，既是物質(zhì)抗氧化活性的重要表現(xiàn)，又是對其抗氧化能力的合理解釋[27]，研究中通常采用三價鐵離子還原法觀察物質(zhì)的還原能力，吸光度越高，還原能力越強[28]，化合物1、2、4及VC還原能力篩選時選擇的濃度分別為0.250、0.125、0.063、0.032、0.016 μmol/mL，結(jié)果如圖2所示?；衔?還原能力最強，其5 個濃度梯度的吸光度均高于VC，化合物2在濃度低于0.125 μmol/mL時還原能力強于VC，超出0.125 μmol/mL時還原力與VC逐漸接近，在篩選濃度范圍內(nèi)，化合物4具有一定的還原能力，但是比VC更弱?；衔?、5、6還原能力篩選時，選擇的濃度為1.000、0.500、0.250、0.125、0.063 μmol/mL，如圖2所示，其還原能力遠弱于VC，因此其抗氧化能力很弱。

圖2 化合物1～6還原力Fig. 2 Reducing power of compounds 1-6

3 討 論

本實驗對姜黃醇提物乙酸乙酯部位的化學(xué)成分進行了分離，共分離得到了7 個單體化合物，分別為Zingerol（1）、Dihydroferulic acid ethyl ester（2）、乙基-3-(4-羥基-苯基)-丙酸乙酯（3）、Zingerone dimer[4,4’-(6,6’-dihydroxy-5,5’-dimethoxy-[1,1’-biphenyl]-3,3’-diyl)bis(butan-2-one)]（4）、姜酮（5）、4-(3,4-二甲氧基苯基)丁烷-2-酮（6）、香草醛（7）。從生源途徑看，姜黃中含有大量的姜黃素，其母核為二苯庚烷，骨架可通過化合物1、化合物5、化合物6脂肪鏈上C-1位聚合一個相同母核的化合物而形成，化合物2、3為化合物1、5、6類似物，由此可見本實驗分離得到的一系列化合物不是姜黃素，而是姜黃素的前體化合物；不同的是，化合物4為化合物5為通過C-5’位自身聚合而形成的二聚體，這種聚合方式在姜黃及姜黃屬植物化學(xué)成分的形成途徑中非常罕見新穎，通過美國化學(xué)學(xué)會SciFinder數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，雖然化合物4已有化學(xué)合成產(chǎn)物，但卻是首次從自然界中發(fā)現(xiàn)的新天然產(chǎn)物，這對于將來姜黃屬植物化學(xué)成分及其生物合成途徑研究具有重要的指導(dǎo)意義。

本實驗采用ABTS陽離子自由基清除實驗、DPPH自由基清除實驗、還原力實驗對分離得到的化合物1～6進行了抗氧化能力評價，綜合3 種實驗結(jié)果可以看出，化合物1的抗氧化能力最強，且活性總體強于陽性對照VC，另外化合物2的抗氧化能力也較強，稍微弱于陽性對照VC，除化合物6以外，其余化合物均有一定的抗氧化能力，不同方法活性略有不同。6 種化合物中，只有化合物1脂肪鏈的2位被羥基取代，其余均為羰基，根據(jù)文獻報道，化合物羥基取代的有無及位置對其抗氧化活性具有影響[29]，因此本實驗推測化合物1抗氧化能力最強的原因可能是由于其脂肪鏈上有羥基取代，脂肪鏈2位上的羥基有無對其抗氧化活性具有重要影響。在此研究基礎(chǔ)上，結(jié)合化合物6在3 種抗氧化實驗中抗氧化能力都極其微弱，其結(jié)構(gòu)式中羥基全部甲基化，而另外5 個化合物具有一定的抗氧化活性，其結(jié)構(gòu)式中只有部分羥基甲基化，均具有1～2 個羥基，張華等[30]報道過酚羥基的甲基化會降低一些酚類物質(zhì)的自由基清除能力，酚羥基數(shù)目越多，抗氧化活性越強，本研究也印證了其觀點。同時，本次分離得到的酚類化合物均顯示了一定程度的抗氧化活性，表明姜黃醇提物中的酚類成分是姜黃抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。