劉 宇,熊 亮,彭 成,李小翠,蒙春旺,劉 菲,*,郭 力,*
(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,四川 成都 611137;2.成都中醫(yī)藥大學(xué),西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所,四川 成都 611137)
氧化應(yīng)激反應(yīng)是人類身體衰老和健康問題的最大敵人之一,人體內(nèi)外多種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的過量自由基,可以引發(fā)氧化脅迫反應(yīng),不僅導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能缺失,促使機(jī)體衰老,而且會加劇阿爾茨海默病、心血管疾病、惡性腫瘤等相關(guān)疾病的發(fā)展[1-2],因此應(yīng)用抗氧化劑保持人體健康和預(yù)防疾病在現(xiàn)代社會具有廣泛的需求[3],抗氧化劑研究和開發(fā)越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[4-6]。由于合成抗氧化劑具有潛在的身體危害[7-8],所以從植物中尋找高效、低毒、廉價的天然抗氧化劑成為目前抗氧化劑開發(fā)的必然趨勢[9-10],目前從植物中提取分離得到的天然抗氧化劑種類繁多,其化學(xué)成分類型包括多酚類、類胡蘿卜素、迷迭香等[11]。其中,酚類成分的抗氧化活性在紛繁復(fù)雜的天然產(chǎn)物中得到的廣泛的肯定和認(rèn)可[12]。
姜黃來源于姜科植物姜黃(Curcuma longa L.)的干燥根莖,富含酚類成分。研究表明姜黃具有良好的抗氧化活性[13]。趙革平等[14]研究發(fā)現(xiàn)姜黃醇提物是有效的抗氧化劑,但是研究限于粗提物,并未深入到具體的單體化合物水平,為進(jìn)一步闡明姜黃醇提物的抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)對其醇提物中的酚類成分進(jìn)行分離鑒定,并對獲得的單體化合物進(jìn)行了抗氧化活性篩選。
姜黃飲片購于四川新荷花中藥飲片有限公司,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物研究室龍飛教授鑒定為姜黃的干燥根莖。
甲醇(色譜純) 美國Sigma公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2 -picrylhydrazyl,DPPH)美國Sigma公司;2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS) 南京都萊生物技術(shù)有限公司;石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇、濃硫酸、VC(均為分析純) 成都市科隆化學(xué)品有限公司;十八烷基硅烷鍵合硅膠(RPC18,40~60 μmol/L) 月旭科技(上海)股份公司。
Bruker-500核磁共振波譜儀 德國Bruker公司;Synapt G2 高分辨質(zhì)譜儀 美國Waters公司;1220型高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Varioska多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo Scientific公司;Sephadex LH-20葡聚糖凝膠 瑞典Amershan Pharmacia公司;Gradient Former B-687中壓液相色譜儀 瑞士Büchi公司;ZF-90多功能暗箱式紫外透射儀 上海寶山顧村電光儀器廠;Milli-Q Reference超純水儀 德國默克集團(tuán);柱色譜硅膠H和薄層色譜硅膠GF254 青島海洋化工廠;GF254硅膠制備薄層板 煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司;Coring Costar 96孔酶標(biāo)板 美國康寧公司。
1.3.1 提取與分離
將姜黃飲片50 kg,加95%乙醇溶液浸泡過夜,回流提取2 次,第1次2 h,第2次1.5 h,合并提取液,50 ℃減壓濃縮得干燥浸膏7 kg。浸膏加水適量成為混懸液,依次用石油醚、乙酸乙酯反復(fù)萃取,將萃取液于50 ℃減壓濃縮,得石油醚萃取物1.6 kg,乙酸乙酯萃取物3 kg。
取乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜(150 cm×22 cm),分別用石油醚-乙酸乙酯溶液(1∶0、7∶3、4∶6、0∶1,V/V)和乙酸乙酯-甲醇溶液(1∶1、0∶1,V/V)洗脫,每種梯度的洗脫液收集在一起,并依次編號為Fr. 1~Fr. 6,F(xiàn)r. 1~Fr. 6洗脫液經(jīng)50 ℃減壓濃縮至浸膏狀,選擇Fr. 2(500 g)經(jīng)硅膠柱色譜(150 cm×22 cm),用二氯甲烷-乙酸乙酯溶液(100∶1~0∶1,V/V)梯度洗脫,洗脫液每500 mL收集一份,以薄層色譜(10 cm×20 cm)檢視,合并相似洗脫餾分并減壓濃縮,共分得17 個餾分,依次編號為JHA~JHQ;其中,JHI組分經(jīng)中壓液相色譜(30 cm×4 cm),以甲醇溶液(30%~100%)梯度洗脫,洗脫液每50 mL收集一份,以薄層色譜(10 cm×20 cm)檢視,合并相似餾分并減壓濃縮,最后得到15 個餾分(JHI-1~JHI-15),其中JHI-2經(jīng)過葡聚糖凝膠SephadexLH-20柱色譜、硅膠制備薄層色譜(20 cm×20 cm)、高效液相色譜分離得到化合物1~5,JHI-2經(jīng)過葡聚糖凝膠SephadexLH-20柱色譜、硅膠制備薄層色譜反復(fù)制備得到化合物6和化合物7。
1.3.2 抗氧化活性測定
由于化合物7(香草醛)為植物常見化學(xué)成分,在植物姜黃中不屬于具有代表性的成分,因此本實(shí)驗(yàn)選擇化合物1~6進(jìn)行抗氧化活性篩選。
1.3.2.1 ABTS陽離子自由基清除測定
參照曾維才等[15]的方法,稍有改變。用超純水配制40 mL含ABTS(7 mmol/L)與過硫酸鉀(2.45 mmol/L)的混合溶液,使其在23 ℃的暗處避光反應(yīng)16 h,制備得到ABTS基液。然后取2 mL基液用超純水稀釋,制得在734 nm波長處吸光度為0.70±0.02的ABTS工作液。取80 μL不同濃度化合物的95%乙醇溶液與400 μL的ABTS工作液混勻,23 ℃孵育6 min,孵育液置于96 孔板中用酶標(biāo)儀測定[16-17],不同濃度的孵育液分別設(shè)置3 個孔,每孔150 μL,測量反應(yīng)混合物在734 nm波長處的吸光度,吸光度取平均值,以VC作陽性對照,95%乙醇溶液作空白對照。ABTS陽離子自由基清除率按公式(1)計(jì)算:
式中:A1為化合物孵育液吸光度;A0為空白對照組孵育液吸光度。
1.3.2.2 DPPH自由基清除率測定
參考曾維才等[15]的方法,稍有改變。以95%乙醇溶液為溶劑配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液,此溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。取250 μL不同濃度的受試物溶液同250 μL DPPH溶液混合,25 ℃避光孵育30 min,孵育液置于96 孔板中測定,不同濃度的孵育液分別設(shè)置3 個孔,每孔150 μL,測量反應(yīng)混合物在517 nm波長處的吸光度,吸光度取平均值,以VC作陽性對照,95%乙醇溶液作空白對照。DPPH自由基清除率按公式(2)計(jì)算:
式中:A1為化合物孵育液吸光度;A0為空白對照組孵育液吸光度。
1.3.2.3 還原力測定
參考曾維才等[15]的方法,稍有改變。取100 μL不同濃度的受試物溶液,與100 μL磷酸緩沖液(0.2 mmol/L,pH 6.6)和100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)l%鐵氰化鉀溶液混勻,50 ℃孵育20 min,迅速冷卻,加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液,混合后,加入100 μL超純水和20 μL 0.1%三氯化鐵溶液,混勻,混合液置于96 孔板中測定,不同濃度的混合液分別設(shè)置3 個孔,每孔150 μL,測量反應(yīng)混合物在700 nm波長處的吸光度,吸光度取平均值,以VC為陽性對照,95%乙醇溶液為空白對照。
ABTS陽離子自由基清除實(shí)驗(yàn)和DPPH自由基清除率測定實(shí)驗(yàn)的半抑制濃度IC50值用SPSS 18.0的Probit Regression計(jì)算;還原力測定實(shí)驗(yàn)吸光度與給藥濃度之間的關(guān)系以GraphPad Prism 5繪制折線圖表示。
本實(shí)驗(yàn)共分離鑒定得到7 個化合物,依次編號為化合物1~7,采用Bruker-500核磁共振波譜儀,以氘代丙酮(CD3COCD3)為溶劑,對化合物1~7進(jìn)行核磁共振氫譜分析,以Waters Synapt G2高分辨質(zhì)譜儀對化合物1~7進(jìn)行分子式、分子質(zhì)量分析,將化合物1~7以硅膠GF254為載體進(jìn)行薄層展開,以多功能暗箱式紫外透射儀、10%硫酸乙醇試劑對化合物進(jìn)行檢視,研究其理化性質(zhì),以FeCl3試劑進(jìn)行酚羥基反應(yīng)驗(yàn)證其化學(xué)結(jié)構(gòu)中酚羥基的有無。結(jié)果發(fā)現(xiàn),化合物4為新天然產(chǎn)物,化合物1、2、3和6為姜黃屬首次發(fā)現(xiàn),化合物7為香草醛(略去),結(jié)構(gòu)鑒定如圖1所示。
圖1 化合物1~6化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of compounds 1 to 6
化合物1:無色油狀物,[α]D25=+9.76(c 0.27,EtOH),以多功能暗箱式紫外透射儀進(jìn)行薄層檢視,在254 nm波長處呈現(xiàn)明顯的暗斑,硫酸乙醇顯色為藍(lán)紫色,與FeCl3反應(yīng)呈陽性,HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 219.089 6[M+Na]+,提示其分子式為C11H16O3(理論計(jì)算值C11H16O3Na,219.099 7),不飽和度為4。1H NMR(500 MHz,CD3COCD3)δ:7.23(1H,s,Ar-OH),6.81(1H,s,H-2’),6.72(1H,d,J = 8.0 Hz,H-5’),6.64(1H,d,J = 8.0 Hz,H-6’),3.82(3H,s,—OCH3),3.72(1H,m,H-2),3.47(1H,d,J = 5.0 Hz,—OH),2.66(1H,m,H-4a),2.56(1H,m,H-4b),1.67(2H,m,H-3a,H-3b),1.14(3H,d,J = 6.0 Hz,—CH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[18]對照一致,鑒定為Zingerol,結(jié)構(gòu)式見圖1。
化合物2:無色油狀物,以多功能暗箱式紫外透射儀進(jìn)行薄層檢視,在254 nm波長處呈現(xiàn)明顯的暗斑,硫酸乙醇顯色為藍(lán)紫色,與FeCl3反應(yīng)呈陽性,HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 247.095 3[M+Na]+,提示其分子組成為C12H16O4(理論計(jì)算值C12H16O4Na,247.084 1),不飽和度為5。1H NMR(500 MHz,CD3COCD3)δ:7.33(1H,br s,Ar-OH),6.85(1H,d,J = 2.0 Hz,H-2’),6.73(1H,d,J = 8.0 Hz,H-5’),6.67(1H,dd,J = 8.0,2.0 Hz,H-6’),4.07(2H,q,J = 7.0 Hz,—CH2—),3.83(3H,s,—OCH3),2.82(2H,t,J = 7.5 Hz,H-3a,H-3b),2.56(2H,t,J = 7.5 Hz,H-2a,H-2b),1.19(3H,t,J = 7.0 Hz,—CH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[19]對照一致,鑒定為Dihydroferulic acid ethyl ester,結(jié)構(gòu)式見圖1。
化合物3:無色油狀物,以多功能暗箱式紫外透射儀進(jìn)行薄層檢視,在254 nm波長處呈現(xiàn)明顯的暗斑,硫酸乙醇顯色為藍(lán)紫色,與FeCl3反應(yīng)呈陽性,HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 217.082 5[M+Na]+,推測其分子式為C11H14O3(理論計(jì)算值C11H14O3Na,217.084 1),不飽和度為5。1H NMR(500 MHz,CD3COCD3)δ:8.16(1H,br s,Ar-OH),7.05(2H,d,J = 8.5 Hz,H-2’,H-6’),6.74(2H,d,J = 8.5 Hz,H-3’,H-5’),4.06(2H,q,J = 7.0 Hz,—CH2—),2.81(2H,t,J = 7.5 Hz,H-3a,H-3b),2.53(2H,t,J = 7.5 Hz,H-2a,H-2b),1.18(3H,t,J = 7.0 Hz,—CH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[20]對照一致,鑒定為乙基-3-(4-羥基-苯基)-丙酸乙酯,結(jié)構(gòu)式見圖1。
化合物4:無色油狀物,以多功能暗箱式紫外透射儀進(jìn)行薄層檢視,在254 nm波長處呈現(xiàn)明顯的暗斑,硫酸乙醇顯色為藍(lán)紫色,與FeCl3反應(yīng)呈陽性,HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 409.163 4[M+Na]+,提示其分子式為C22H26O6(理論計(jì)算值C22H26O6Na,409.162 7),不飽和度為10。1H NMR(500 MHz,CD3COCD3)δ:6.84(2H,d,J = 2.0 Hz,H-2,H-2’),6.71(2H,d,J = 2.0 Hz,H-4,H-4’),3.86(6H,s,—OCH3×2),2.79(8H,s,H-1a,H-1b,H-1a’,H-1b’,H-2a,H-2b,H-2a’,H-2b’),2.10(6H,s,—CH3×2)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[21]對照,鑒定為化合物Zingerone dimer [4,4’-(6,6’-dihydroxy-5,5’-dimethoxy-[1,1’-biphenyl]-3,3’-diyl)bis(butan-2-one)],該化合物為首次從植物中分離鑒定,為新穎的天然產(chǎn)物,且為化合物5的二聚體,結(jié)構(gòu)式見圖1。
化合物5:無色油狀物,以多功能暗箱式紫外透射儀進(jìn)行薄層檢視,在254 nm波長處呈現(xiàn)明顯的暗斑,硫酸乙醇顯色為藍(lán)紫色,與FeCl3反應(yīng)呈陽性,HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 217.083 8[M+Na]+,提示其分子式為C11H14O3(理論計(jì)算值C11H14O3Na,217.084 1),不飽和度為5。1H NMR(500 MHz,CD3COCD3)δ:7.28(1H,s,Ar-OH),6.82(1H,d,J = 2.0 Hz,H-2’),6.71(1H,d,J = 8.0 Hz,H-5’),6.64(1H,dd,J = 8.0,2.0 Hz,H-6’),3.82(3H,s,—OCH3),2.74(4H,s,H-3a,H-3b,H-4a,H-4b),2.08(3H,s,—CH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[22]對照一致,鑒定為姜酮,結(jié)構(gòu)式見圖1。
化合物6:無色油狀物,以多功能暗箱式紫外透射儀進(jìn)行薄層檢視,在254 nm波長處呈現(xiàn)明顯的暗斑,硫酸乙醇顯色為藍(lán)紫色,與FeCl3反應(yīng)呈陰性,HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 231.099 6[M+Na]+,提示其分子式為C12H16O3(理論計(jì)算值C12H16O3Na,231.099 7),不飽和度為5。1H NMR(500 MHz,CD3COCD3)δ:6.83(1H,s,H-2’),6.82(1H,d,J = 8.0 Hz,H-5’),6.72(1H,dd,J = 8.0,2.0 Hz,H-6’),3.78(3H,s,—OCH3at C4’),3.76(3H,s,—OCH3at C3’),2.76(4H,s,H-3a,H-3b,H-4a,H-4b),2.08(3H,s,—CH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[23]對照,鑒定為化合物4-(3,4-二甲氧基苯基)丁烷-2-酮,結(jié)構(gòu)式見圖1。
化合物7:無色油狀物,有特殊香味,以多功能暗箱式紫外透射儀進(jìn)行薄層檢視,在254 nm波長處呈現(xiàn)明顯的暗斑,硫酸乙醇顯色為藍(lán)紫色,與FeCl3反應(yīng)呈陽性,HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 175.031 4[M+Na]+,提示其分子式為C8H8O3(理論計(jì)算值C8H8O3Na,175.037 1),不飽和度為6。1H NMR(500 MHz,CD3COCD3)δ:9.82(1H,s,—CHO),7.45(1H,d,J = 8.0 Hz,H-6),7.44(1H,s,H-2),7.00(1H,d,J = 8.0 Hz,H-5),3.93(3H,s,—OCH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[24]對照,鑒定為香草醛。
2.2.1 ABTS陽離子自由基的清除
表1 化合物1~6對ABTS陽離子自由基、DPPH自由基的IC50Table 1 Half maximal inhibitory concentration (IC50) of compounds 1 to 6 against ABTS radical cations and DPPH radicals
根據(jù)不同濃度受試物對ABTS溶液吸光度的影響測定天然產(chǎn)物對ABTS陽離子自由基的清除能力,該方法最早由Miller等提出[25]。如表1所示,陽性對照VC的IC50為(13±1.1)μmol/L,化合物1~6中,化合物1對ABTS陽離子自由基的清除效果最好,IC50為(3±0.2)μmol/L,效果遠(yuǎn)強(qiáng)于陽性對照,化合物2效果和VC效果相當(dāng),化合物3效果為VC的1/2,化合物4對ABTS陽離子自由基有一定的清除效果,化合物5對ABTS陽離子自由基清除作用較弱,化合物6與陽性對照對比清除作用非常弱,幾乎無效。
2.2.2 DPPH自由基的清除
DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中,受試物給出的氫原子與DPPH自由基結(jié)合,使反應(yīng)溶液的吸光度發(fā)生變化,通過比較實(shí)驗(yàn)組與空白組溶液吸光度的變化評價受試物的抗氧化活性結(jié)果[26]。如表1所示,陽性對照VC對DPPH自由基清除率的IC50為(7±0.3)μmol/L,效果最好的是2號化合物,IC50為(16±1.2)μmol/L,清除效果約為陽性對照的1/2,另外化合物1清除DPPH自由基的效果也較好,IC50為(65±4.4)μmol/L,化合物4、5對DPPH自由基有一定的清除效果,化合物6對DPPH幾乎無清除作用。
2.2.3 還原力
研究表明,還原能力是表征物質(zhì)在氧化還原反應(yīng)中給出電子自身發(fā)生氧化的能力,既是物質(zhì)抗氧化活性的重要表現(xiàn),又是對其抗氧化能力的合理解釋[27],研究中通常采用三價鐵離子還原法觀察物質(zhì)的還原能力,吸光度越高,還原能力越強(qiáng)[28],化合物1、2、4及VC還原能力篩選時選擇的濃度分別為0.250、0.125、0.063、0.032、0.016 μmol/mL,結(jié)果如圖2所示?;衔?還原能力最強(qiáng),其5 個濃度梯度的吸光度均高于VC,化合物2在濃度低于0.125 μmol/mL時還原能力強(qiáng)于VC,超出0.125 μmol/mL時還原力與VC逐漸接近,在篩選濃度范圍內(nèi),化合物4具有一定的還原能力,但是比VC更弱?;衔?、5、6還原能力篩選時,選擇的濃度為1.000、0.500、0.250、0.125、0.063 μmol/mL,如圖2所示,其還原能力遠(yuǎn)弱于VC,因此其抗氧化能力很弱。
圖2 化合物1~6還原力Fig. 2 Reducing power of compounds 1-6
本實(shí)驗(yàn)對姜黃醇提物乙酸乙酯部位的化學(xué)成分進(jìn)行了分離,共分離得到了7 個單體化合物,分別為Zingerol(1)、Dihydroferulic acid ethyl ester(2)、乙基-3-(4-羥基-苯基)-丙酸乙酯(3)、Zingerone dimer[4,4’-(6,6’-dihydroxy-5,5’-dimethoxy-[1,1’-biphenyl]-3,3’-diyl)bis(butan-2-one)](4)、姜酮(5)、4-(3,4-二甲氧基苯基)丁烷-2-酮(6)、香草醛(7)。從生源途徑看,姜黃中含有大量的姜黃素,其母核為二苯庚烷,骨架可通過化合物1、化合物5、化合物6脂肪鏈上C-1位聚合一個相同母核的化合物而形成,化合物2、3為化合物1、5、6類似物,由此可見本實(shí)驗(yàn)分離得到的一系列化合物不是姜黃素,而是姜黃素的前體化合物;不同的是,化合物4為化合物5為通過C-5’位自身聚合而形成的二聚體,這種聚合方式在姜黃及姜黃屬植物化學(xué)成分的形成途徑中非常罕見新穎,通過美國化學(xué)學(xué)會SciFinder數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn),雖然化合物4已有化學(xué)合成產(chǎn)物,但卻是首次從自然界中發(fā)現(xiàn)的新天然產(chǎn)物,這對于將來姜黃屬植物化學(xué)成分及其生物合成途徑研究具有重要的指導(dǎo)意義。
本實(shí)驗(yàn)采用ABTS陽離子自由基清除實(shí)驗(yàn)、DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)、還原力實(shí)驗(yàn)對分離得到的化合物1~6進(jìn)行了抗氧化能力評價,綜合3 種實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,化合物1的抗氧化能力最強(qiáng),且活性總體強(qiáng)于陽性對照VC,另外化合物2的抗氧化能力也較強(qiáng),稍微弱于陽性對照VC,除化合物6以外,其余化合物均有一定的抗氧化能力,不同方法活性略有不同。6 種化合物中,只有化合物1脂肪鏈的2位被羥基取代,其余均為羰基,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,化合物羥基取代的有無及位置對其抗氧化活性具有影響[29],因此本實(shí)驗(yàn)推測化合物1抗氧化能力最強(qiáng)的原因可能是由于其脂肪鏈上有羥基取代,脂肪鏈2位上的羥基有無對其抗氧化活性具有重要影響。在此研究基礎(chǔ)上,結(jié)合化合物6在3 種抗氧化實(shí)驗(yàn)中抗氧化能力都極其微弱,其結(jié)構(gòu)式中羥基全部甲基化,而另外5 個化合物具有一定的抗氧化活性,其結(jié)構(gòu)式中只有部分羥基甲基化,均具有1~2 個羥基,張華等[30]報(bào)道過酚羥基的甲基化會降低一些酚類物質(zhì)的自由基清除能力,酚羥基數(shù)目越多,抗氧化活性越強(qiáng),本研究也印證了其觀點(diǎn)。同時,本次分離得到的酚類化合物均顯示了一定程度的抗氧化活性,表明姜黃醇提物中的酚類成分是姜黃抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。