• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于GC-MS技術(shù)對不同產(chǎn)地稻米的代謝組學(xué)分析

    2019-07-05 02:13:14富天昕馮玉超張麗媛王長遠
    食品科學(xué) 2019年12期
    關(guān)鍵詞:差異

    富天昕,馮玉超,張麗媛,2,李 雪,王長遠,2,*

    (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室,黑龍江 大慶 163319)

    代謝組學(xué)這一概念由Nicholson在2002年提出,是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新發(fā)展起來的一門學(xué)科,是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[1]。概念提出后,該領(lǐng)域的研究迅速發(fā)展并滲透到多個領(lǐng)域[2-3]。植物代謝組學(xué)是代謝組學(xué)的重要分支,它主要研究的是作為各種代謝路徑的底物和產(chǎn)物的小分子代謝物(mw<1 000 Da),結(jié)合基因、蛋白質(zhì)、表型等綜合分析植物的生理生化過程[4-5]。而植物體的最終表現(xiàn)方式則由代謝產(chǎn)物體現(xiàn),代謝產(chǎn)物在生物體信息傳遞鏈的末端,是植物代謝的最終產(chǎn)物[6]。

    近年來植物代謝得到迅速發(fā)展,而稻米作為主要糧食作物之一,也成為研究的熱點[7-11]。稻米中富含豐富的蛋白質(zhì)、糖類、脂肪和膳食纖維等營養(yǎng)成分且氨基酸組成比較完全,有助于人體的吸收[12]。稻米的品質(zhì)不僅與品種有關(guān),還與其生長環(huán)境密切相關(guān)。不同產(chǎn)地的稻米因其種植的土壤、氣候、水源不同,其營養(yǎng)品質(zhì)和代謝產(chǎn)物的種類、含量也不盡相同[13]。代謝組學(xué)的研究方法,可以從系統(tǒng)生物學(xué)的角度解釋代謝物變化與生命活動現(xiàn)象的關(guān)系,近幾年代謝組學(xué)在農(nóng)產(chǎn)品鑒別與產(chǎn)地區(qū)分方向應(yīng)用廣泛,為農(nóng)產(chǎn)品的溯源提供了新的途徑[14-18]。氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用技術(shù)具有重復(fù)性好、靈敏度高等特點,是目前代謝組學(xué)研究中廣泛運用的分析技術(shù)并且有很長的研究歷史[18-22]。田福林等[23]利用GC-MS技術(shù)對4 種不同產(chǎn)地大米中的脂溶性成分進行分析,結(jié)合主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚類分析,建立一種對不同產(chǎn)地大米進行快速鑒定的方法。本實驗利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對黑龍江省建三江地區(qū)和響水地區(qū)的稻米進行差異代謝物的研究,探討產(chǎn)地對水稻代謝物的影響,并從代謝物的角度著手,篩選對區(qū)分2 個產(chǎn)地具有重要作用的差異代謝物,為通過代謝物對稻米進行產(chǎn)地溯源提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    水稻采自黑龍江省建三江和響水地理標(biāo)志稻米保護區(qū),建三江采樣地點選擇為12 個農(nóng)場布點;響水采樣地點選擇5 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)布點,均選擇主產(chǎn)縣、主產(chǎn)鄉(xiāng)(鎮(zhèn)或管理區(qū))、主產(chǎn)村(屯)的大面積種植地塊進行采樣,采樣點依照種植范圍大小設(shè)置,每塊地塊隨機設(shè)置分點5 個重復(fù),采樣地點按照東、西、南、北、中5 個區(qū)域設(shè)計,依據(jù)代表性采樣原則,每個采樣點按照不同方位采集1~2 kg稻穗,每個產(chǎn)區(qū)選取30 個樣本。響水地區(qū)水稻品種為稻花香,建三江地區(qū)品種主要為龍粳系列,龍粳26、龍粳29、龍粳31、龍粳39、龍粳40、龍粳43、龍粳46,以及綏粳4、松粳9等。

    吡啶(純度≥99.9%)、甲醇(均為色譜純) 美國阿拉丁試劑有限公司;2-氯苯丙氨酸(純度98.5%)、甲氧基胺鹽酸鹽(純度98%)、99% N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷) 上海麥克林試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    7890A/5975C GC-MS聯(lián)用儀、HP-5ms色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm) 美國Agilent公司;QP2010 GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;MTN-2800D氮吹濃縮裝置 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;恒溫箱 上海森信實驗儀器有限公司;TGL-16B臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

    1.3 方法

    樣品制備根據(jù)王玲[24]的方法加以改進。稻種子液氮研磨后稱取50 mg粉末于2 mL的EP管中,加入800 μL甲醇和10 μL內(nèi)標(biāo)(2-氯苯丙氨酸),渦旋混勻30 s,置于4 ℃離心機中,12 000 r/min離心15 min,吸取200 μL上清液,轉(zhuǎn)入進樣小瓶中氮氣吹干。衍生化:取30 μL甲氧氨鹽酸吡啶溶液至濃縮后的樣品中,渦旋混勻至完全溶解,置于37 ℃恒溫箱90 min,取出后加入30 μL N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺,置于70 ℃烘箱60 min,取出后待檢測。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    數(shù)據(jù)的特征峰提取和預(yù)處理在R軟件平臺采用XCMS軟件包條件下進行,將處理的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P軟件,進行PCA[24]、正交偏最小二乘-判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)等多元統(tǒng)計分析,再根據(jù)變量對分組貢獻值(variable importance in the projection,VIP)的大小和組間變化的顯著性(P<0.05)進行差異性代謝產(chǎn)物的篩選。差異性代謝物的定性方法為:根據(jù)保留時間及質(zhì)荷比(m/z)在NIST商業(yè)數(shù)據(jù)庫和Wiley Registry代謝組數(shù)據(jù)庫進行注釋。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 GC-MS分析

    2.1.1 典型離子流色譜分析

    由圖1可以看出,色譜峰基線平穩(wěn),峰分離效果良好,儀器穩(wěn)定性良好。

    圖1 典型樣本的總離子流色譜圖Fig. 1 Typical total ion chromatogram of rice metabolites

    2.1.2 代謝組分的質(zhì)譜分析

    通過對GC-MS原始數(shù)據(jù)的處理,兩產(chǎn)地60 個稻米種子樣品中共掃描到143 個峰,根據(jù)保留時間及m/z在NIST商業(yè)數(shù)據(jù)庫和Wiley Registry代謝組數(shù)據(jù)庫進行注釋,共注釋到39 個代謝產(chǎn)物,其中建三江地區(qū)有29 個代謝產(chǎn)物,響水地區(qū)有26 個代謝產(chǎn)物,如表1所示。

    表1中1~16號為建三江地區(qū)和響水地區(qū)共同存在的代謝物,17~29號為建三江地區(qū)稻米樣品相對于響水地區(qū)樣品具有的代謝物,30~39號為響水地區(qū)稻米樣品相對于建三江地區(qū)樣品具有的代謝物,除共同存在的代謝物外,2 個產(chǎn)地單獨具有的代謝物并不一定是相應(yīng)產(chǎn)地特有的代謝物,可能還與稻米樣品的品種有關(guān),由此可知,產(chǎn)地不同,稻米的代謝物的數(shù)量不也相同。如表2所示,建三江地區(qū)與響水地區(qū)相比,多元醇、有機酸類物質(zhì)含量要高于響水地區(qū),而響水地區(qū)的糖類、脂肪酸、氨基酸和其他類物質(zhì)要高于建三江地區(qū),核苷酸類物質(zhì)含量相差不多,可見產(chǎn)地不同對稻米代謝物的種類也會有影響。

    表2 建三江地區(qū)和響水地區(qū)稻米代謝物分類Table 2 Classification of metabolites in rice samples from Jiansanjiang and Xiangshui%

    2.2 兩產(chǎn)地稻米的代謝組學(xué)差異分析

    2.2.1 PCA結(jié)果

    圖2 2 種樣品的PCA得分圖Fig. 2 PCA scores plot of two rice samples

    為判別建三江地區(qū)和響水地區(qū)稻米樣品間的差異,首先采用PCA方法進行分析,共得到3 個主成分,累計R2X=0.675,Q2=0.52,2 個參數(shù)數(shù)值均大于0.5,且二者數(shù)值相差不大,說明PCA效果較好。如圖2所示,兩產(chǎn)地稻米樣品除個別異常樣品外絕大部分的樣品均處于在置信區(qū)間內(nèi),但兩產(chǎn)地樣品并未完全分開,還存在個別的重疊樣品,說明這些樣本中所含有的分子的組成和濃度越接近,而分子組成和濃度接近可能是相同品種間的聚集,也有可能是不同品種但是組分含量上相近。PCA這種無監(jiān)督分析方法不能忽略組內(nèi)誤差、消除與研究目的無關(guān)的隨機誤差,所以不利于發(fā)現(xiàn)組間差異,之后將采用有監(jiān)督的方法進行進一步研究。

    2.2.2 OPLS-DA結(jié)果

    通過OPLS-DA可以過濾掉代謝物中,與分類變量不相關(guān)的正交變量,并對非正交變量和正交變量分別分析,從而獲取更加可靠的代謝物的組間差異與實驗組的相關(guān)程度信息[26]。如圖3所示,建三江地區(qū)的稻米樣品主要分布在置信區(qū)間的左側(cè),響水地區(qū)的稻米樣品主要分布在置信區(qū)間的右側(cè),兩產(chǎn)地稻米樣品區(qū)分效果很好。本次OPLS-DA得到2 個主成分,R2X=0.575,R2Y=0.63,Q2=0.479,3 個參數(shù)數(shù)值接近或大于0.5,且相差不多,說明OPLS-DA模型可解釋度較好,相比于PCA模型效果更好。

    圖3 兩產(chǎn)地樣本OPLS-DA得分圖Fig. 3 OPLS-DA score plot of two rice samples

    2.2.3 OPLS-DA置換檢驗結(jié)果

    置換檢驗通過隨機改變分類變量Y的排列順序,多次建立對應(yīng)的OPLS-DA模型以獲取隨機模型的R2和Q2值,在避免檢驗?zāi)P偷倪^擬合以及評估模型的統(tǒng)計顯著性上有重要作用。對OPLS-DA模型的置換檢驗結(jié)果如4圖所示。

    圖4 建三江地區(qū)與響水地區(qū)稻米樣品OPLS-DA置換檢驗結(jié)果圖Fig. 4 OPLS-DA replacement test results of rice samples collected from Jiansanjiang and Xiangshui

    由圖4可知,所有R2點從左到右均低于最右的原始的R2點,所有Q2點均低于右側(cè)的原始Q2點,且點的回歸線與橫坐標(biāo)交叉或者小于0,說明OPLS-DA模型是可靠的,可以較好地解釋兩組樣本之間的差異。同時隨著置換保留度逐漸降低,置換的Y變量比例增大,隨機模型的R2和Q2均逐漸下降,說明原模型不存在過擬合現(xiàn)象,模型穩(wěn)健性較好。

    2.2.4 兩地區(qū)稻米樣品的差異代謝物鑒定

    采用OPLS-DA模型的VIP值(閾值>1),并結(jié)合學(xué)生氏t檢驗(t-test)的P值(閾值<0.05)來尋找差異性表達代謝物。差異性代謝物的定性方法為:根據(jù)保留時間及m/z在NIST庫和Wiley Registry代謝組數(shù)據(jù)庫中查找與其匹配的物質(zhì)。兩地區(qū)樣品差異代謝物的定性結(jié)果見表3。由表3可知,兩產(chǎn)地水稻樣品共篩選出16 種差異代謝產(chǎn)物,由log2(fc-XS/JSJ)值可知,篩選出的16 種差異代謝物中除α-D-甲基呋喃果糖苷外,其余15 種差異代謝物含量均是響水地區(qū)稻米樣品高于建三江地區(qū)的稻米樣品,且倍數(shù)在1.54~3.05之間,含量差異顯著,雖然α-D-甲基呋喃果糖苷的含量是建三江地區(qū)高于響水地區(qū),但是可以看出高出的倍數(shù)為0.02,數(shù)值很小。整體看來響水地區(qū)稻米中差異代謝物的含量要高于建三江地區(qū),說明稻米的產(chǎn)地不同,相同代謝產(chǎn)物的含量也有明顯差異,稻米代謝產(chǎn)物受產(chǎn)地的影響顯著。

    表3 兩地區(qū)樣品差異代謝物的定性結(jié)果Table 3 Qualitative analysis of differential metabolites in rice samples collected from two regions

    2.3 差異性代謝產(chǎn)物分析

    2.3.1 差異代謝物熱圖分析

    圖5 差異代謝物熱圖Fig. 5 Heatmap of the differential metabolites

    通過R(v3.3.2)中pheatmap程序包對數(shù)據(jù)集進行數(shù)據(jù)縮放,同時對樣本和代謝物進行雙向聚類。由圖5可知,圖中紅色區(qū)域表示差異代謝物的高表達區(qū),綠色部分表示差異代謝產(chǎn)物的低表達區(qū)。通過篩選出的差異代謝物將兩產(chǎn)地的樣品進行聚類分析,響水地區(qū)的稻米樣品主要集中在紅色的高表達區(qū)域,而建三江地區(qū)的稻米樣品則主要集中在綠色低表達區(qū),說明響水地區(qū)的稻米樣品中差異代謝物的含量普遍高于建三江地區(qū),響水稻米樣品中的差異代謝物的代謝機能更為活躍,同時也可以看出同產(chǎn)地樣品的代謝物具有相近的表達程度,可見產(chǎn)地對稻米的代謝具有很大的影響。影響水稻生長的因素非常復(fù)雜,其中溫度與光照是最為重要的因素[27]。響水地區(qū)所處的地理位置位于火山爆發(fā)出的巖漿凝結(jié)的熔巖臺地,地溫、水溫比一般的稻田地高2~3 ℃左右,在晝夜溫差大的北方,形成了有利的稻米生長環(huán)境,使其具備更好的溫度和濕度條件,較高的溫度條件能增強水稻的光合作用和根葉的呼吸作用,從而提高了稻米的代謝速率[28],這可能是導(dǎo)致響水地區(qū)的稻米代謝產(chǎn)物高表達的原因。

    2.3.2 差異代謝物通路分析

    京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)注釋分析僅找到所有差異代謝物參與的通路,MetPA數(shù)據(jù)庫通過代謝通路濃縮和拓?fù)浞治觯茏R別出可能的受生物擾動的代謝通路,可以對通路進行進一步的篩選,找到與代謝物差異相關(guān)性最高的關(guān)鍵通路,結(jié)果如表4所示。

    表4 差異代謝物參與的代謝途徑明細(xì)Table 4 List of metabolic pathways with the involvement of differential metabolites

    富集分析和拓?fù)浞治龉矘?biāo)注到4 個較為重要的代謝途徑,包括脂肪酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、嘧啶代謝、氨酰-tRNA生物合成。脂肪酸可為稻米提供能量,且對植物本身的抗逆性起重要的作用,使其可以適應(yīng)寒冷的生長環(huán)境[29]。精氨酸和脯氨酸是稻米氨基酸重要組成,脯氨酸是稻米代謝產(chǎn)物中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),它起到保持原生質(zhì)和環(huán)境滲透平衡、阻止水分喪失的作用。此外,脯氨酸還直接影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,還可作為含氮的儲藏物質(zhì)和恢復(fù)生長的能源,還有研究表明,低溫下水稻幼苗脯氨酸含量會隨著脅迫時間的延長而增加[30-31]。不同產(chǎn)地環(huán)境特點不同,盡管建三江地區(qū)與響水地區(qū)位于同省份內(nèi),且均適合水稻的生長,但建三江地處三江平原腹地,屬寒溫帶濕潤季風(fēng)氣候,年平均氣溫1~2 ℃,平均降水量為550~600 mm,而響水大米產(chǎn)區(qū)寧安市屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候,年平均氣溫3.5 ℃,平均降水量為400~600 mm,氣溫、降水量均有較大差異,所以其產(chǎn)地生長的稻米為適應(yīng)環(huán)境會通過調(diào)節(jié)代謝水平來適應(yīng)環(huán)境,以便更好地生長,從而其各種代謝物的含量會出現(xiàn)差異,同時也會賦予稻米不同的品質(zhì)。氨酰-tRNA生物合成是形成蛋白質(zhì)的重要通路。在蛋白質(zhì)的生物合成中,氨酰-tRNA作為氨基酸轉(zhuǎn)移到肽鏈的羧末端過程的中間物而發(fā)揮重要的作用[32-33]。氨酰-tRNA合成酶在識別它所催化的氨基酸時需要ATP,所以光照是氨酰-tRNA生物合成途徑的關(guān)鍵因素[34],響水大米的光照周期明期與暗期比為7∶17,建三江大米的光照周期明期與暗期比為6∶18,兩地區(qū)均有充足的光照可滿足氨酰-tRNA生物合成途徑,但光照情況還是有所差異。產(chǎn)地的差異對水稻機體的多種終端代謝途徑造成了一定影響,但產(chǎn)地影響稻米代謝途徑及其機理尚未清楚,有待進一步研究。

    3 結(jié) 論

    本研究基于GC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)對黑龍江省響水地區(qū)和建三江地區(qū)的60 個的稻米樣品進行代謝組學(xué)分析,考察不同產(chǎn)地對稻米代謝產(chǎn)物的影響。實驗共鑒定出39 個代謝產(chǎn)物,其中響水地區(qū)包括26 個代謝產(chǎn)物,建三江地區(qū)包括29 個代謝產(chǎn)物。對樣品進行PCA和OPLSDA等多元分析,兩產(chǎn)地共篩選出16 種差異代謝物,響水地區(qū)稻米差異代謝物含量要高于建三江地區(qū),且倍數(shù)在1.54~3.05 倍之間,通過差異代謝物可以對兩產(chǎn)地的稻米樣品進行較好的區(qū)分,說明不同產(chǎn)地生長的稻米其代謝產(chǎn)物的種類和含量均不相同,產(chǎn)地對稻米的代謝具有重要的影響,而稻米的代謝產(chǎn)物可能攜帶著其產(chǎn)地的信息。綜上所述,基于GC-MS技術(shù)的代謝組學(xué)分析方法用于分析產(chǎn)地對水稻代謝產(chǎn)物的影響具有一定的可行性,可為因環(huán)境不同而導(dǎo)致的稻米品質(zhì)差別提供可視化的理論基礎(chǔ)。實驗證明利用基于GC-MS聯(lián)用技術(shù),結(jié)合多元統(tǒng)計分析的方法,可用于分析環(huán)境對水稻代謝產(chǎn)物的影響,可為稻米的溯源提供理論基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    差異
    “再見”和bye-bye等表達的意義差異
    英語世界(2023年10期)2023-11-17 09:19:16
    JT/T 782的2020版與2010版的差異分析
    相似與差異
    音樂探索(2022年2期)2022-05-30 21:01:37
    關(guān)于中西方繪畫差異及對未來發(fā)展的思考
    收藏界(2019年3期)2019-10-10 03:16:40
    找句子差異
    DL/T 868—2014與NB/T 47014—2011主要差異比較與分析
    生物為什么會有差異?
    法觀念差異下的境外NGO立法效應(yīng)
    構(gòu)式“A+NP1+NP2”與“A+NP1+(都)是+NP2”的關(guān)聯(lián)和差異
    論言語行為的得體性與禮貌的差異
    久久久国产精品麻豆| 亚洲五月婷婷丁香| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 九九在线视频观看精品| 91麻豆精品激情在线观看国产| 中文字幕熟女人妻在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产成人精品久久二区二区免费| 一区二区三区高清视频在线| 国产成年人精品一区二区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 午夜成年电影在线免费观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 长腿黑丝高跟| 操出白浆在线播放| 国产成人精品久久二区二区免费| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美日韩乱码在线| 婷婷丁香在线五月| 欧美日韩精品网址| 一进一出好大好爽视频| 男插女下体视频免费在线播放| 久久久久精品国产欧美久久久| 757午夜福利合集在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 天天添夜夜摸| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美高清成人免费视频www| 日本免费一区二区三区高清不卡| 极品教师在线免费播放| 婷婷丁香在线五月| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产野战对白在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲成人久久爱视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 制服人妻中文乱码| 欧美高清成人免费视频www| 国产乱人视频| 91av网站免费观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 99视频精品全部免费 在线 | 在线观看舔阴道视频| 波多野结衣高清无吗| 欧美性猛交黑人性爽| 国产麻豆成人av免费视频| 成人欧美大片| 男女午夜视频在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产综合懂色| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产av不卡久久| 亚洲欧美日韩高清专用| 黑人操中国人逼视频| 波多野结衣高清无吗| 舔av片在线| 国产日本99.免费观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲真实伦在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品久久久久久久电影 | 久久性视频一级片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产爱豆传媒在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| av片东京热男人的天堂| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 精品熟女少妇八av免费久了| 国产av麻豆久久久久久久| 日韩人妻高清精品专区| 我要搜黄色片| 99久久成人亚洲精品观看| 99热6这里只有精品| 国产av一区在线观看免费| 国产亚洲av高清不卡| 色综合亚洲欧美另类图片| 中文字幕熟女人妻在线| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 深夜精品福利| 桃红色精品国产亚洲av| 真人做人爱边吃奶动态| 午夜福利18| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲av电影不卡..在线观看| 午夜两性在线视频| a级毛片a级免费在线| xxxwww97欧美| av福利片在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| aaaaa片日本免费| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产免费av片在线观看野外av| 又大又爽又粗| 看黄色毛片网站| 免费看a级黄色片| 偷拍熟女少妇极品色| 婷婷丁香在线五月| 熟女电影av网| 国产三级黄色录像| 色综合欧美亚洲国产小说| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲av成人av| 色视频www国产| 天天一区二区日本电影三级| 男女床上黄色一级片免费看| 国产亚洲欧美98| www日本在线高清视频| 亚洲片人在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 一进一出好大好爽视频| 黄色片一级片一级黄色片| 国产午夜精品论理片| 国产又色又爽无遮挡免费看| 真人一进一出gif抽搐免费| 99国产精品99久久久久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| a在线观看视频网站| 成人鲁丝片一二三区免费| 看片在线看免费视频| 999精品在线视频| 美女午夜性视频免费| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品电影一区二区三区| 精华霜和精华液先用哪个| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 99热这里只有是精品50| 日本与韩国留学比较| cao死你这个sao货| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 9191精品国产免费久久| 国产又色又爽无遮挡免费看| 在线观看免费午夜福利视频| 老司机在亚洲福利影院| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲avbb在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 九色国产91popny在线| 精品电影一区二区在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 在线视频色国产色| 久久午夜亚洲精品久久| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 丰满的人妻完整版| 首页视频小说图片口味搜索| 欧美日韩黄片免| 黄色视频,在线免费观看| 99久久综合精品五月天人人| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 成在线人永久免费视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久久久久人人人人人| 男女之事视频高清在线观看| 中文字幕久久专区| 国产一区在线观看成人免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 香蕉久久夜色| 国产欧美日韩一区二区三| 国产真实乱freesex| 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品久久久久久精品电影| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 搞女人的毛片| 亚洲熟妇熟女久久| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国语自产精品视频在线第100页| 一a级毛片在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲国产看品久久| 五月玫瑰六月丁香| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲七黄色美女视频| 美女高潮的动态| 男女那种视频在线观看| 一本久久中文字幕| 欧美3d第一页| 真人做人爱边吃奶动态| 成年女人看的毛片在线观看| 国产成年人精品一区二区| 久久九九热精品免费| 天堂影院成人在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 丁香欧美五月| 免费看美女性在线毛片视频| 又爽又黄无遮挡网站| 成年版毛片免费区| 宅男免费午夜| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 免费在线观看影片大全网站| 88av欧美| 午夜福利在线观看吧| 校园春色视频在线观看| 成人国产综合亚洲| www.自偷自拍.com| 99国产精品一区二区蜜桃av| 小说图片视频综合网站| 无遮挡黄片免费观看| 中国美女看黄片| 看片在线看免费视频| 国产av在哪里看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 91麻豆av在线| 激情在线观看视频在线高清| 久久人人精品亚洲av| 免费一级毛片在线播放高清视频| 一个人看视频在线观看www免费 | 熟女人妻精品中文字幕| 精品久久蜜臀av无| 国产亚洲精品一区二区www| av在线蜜桃| 久久精品综合一区二区三区| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美黄色片欧美黄色片| x7x7x7水蜜桃| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲18禁久久av| 午夜精品在线福利| 91老司机精品| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| av视频在线观看入口| 亚洲精品456在线播放app | 国产精品av视频在线免费观看| 1024手机看黄色片| 久久久久精品国产欧美久久久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久香蕉精品热| 精品人妻1区二区| 国产精品九九99| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产亚洲欧美98| 又黄又爽又免费观看的视频| 一a级毛片在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 精品久久久久久成人av| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 在线永久观看黄色视频| 亚洲精华国产精华精| 最新美女视频免费是黄的| 国内精品美女久久久久久| 久久精品综合一区二区三区| 日本黄色片子视频| 岛国在线观看网站| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产不卡一卡二| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 色老头精品视频在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲片人在线观看| 成年免费大片在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 婷婷精品国产亚洲av在线| www.www免费av| 国产免费男女视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 99re在线观看精品视频| 国产亚洲欧美98| 老熟妇仑乱视频hdxx| 在线观看午夜福利视频| 国产毛片a区久久久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 真人做人爱边吃奶动态| 九色成人免费人妻av| 一本精品99久久精品77| 国产精品av视频在线免费观看| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲专区中文字幕在线| 日韩有码中文字幕| 亚洲成人久久性| 久久久久国内视频| 日本熟妇午夜| 黄频高清免费视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产精品av久久久久免费| 脱女人内裤的视频| 五月玫瑰六月丁香| 级片在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美在线黄色| 又爽又黄无遮挡网站| 国产乱人视频| 一进一出抽搐动态| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲成人久久爱视频| 久久精品91蜜桃| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 一级黄色大片毛片| 免费搜索国产男女视频| 国产毛片a区久久久久| 91av网站免费观看| 亚洲无线观看免费| a级毛片a级免费在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久天堂一区二区三区四区| 国产av一区在线观看免费| 一a级毛片在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 欧美日本亚洲视频在线播放| 色视频www国产| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产欧美日韩一区二区精品| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 在线观看午夜福利视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产精品亚洲美女久久久| a级毛片a级免费在线| 丁香六月欧美| 国产精品日韩av在线免费观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 日韩欧美三级三区| 91老司机精品| 亚洲熟妇熟女久久| 真人做人爱边吃奶动态| 变态另类丝袜制服| 中文字幕高清在线视频| 欧美性猛交黑人性爽| 国产伦精品一区二区三区四那| 波多野结衣高清作品| 国产综合懂色| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产 一区 欧美 日韩| 热99在线观看视频| 国产av一区在线观看免费| 国内揄拍国产精品人妻在线| www.精华液| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美一级毛片孕妇| 午夜a级毛片| 成人三级做爰电影| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 色av中文字幕| 热99在线观看视频| 级片在线观看| 国产高清视频在线观看网站| 中文字幕久久专区| 亚洲熟妇熟女久久| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品精品国产色婷婷| 看黄色毛片网站| 一个人免费在线观看的高清视频| 中文资源天堂在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲国产精品合色在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 麻豆国产97在线/欧美| 国产探花在线观看一区二区| 久久久久久大精品| 国产伦在线观看视频一区| 久久中文字幕一级| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 成人午夜高清在线视频| 亚洲av五月六月丁香网| 麻豆av在线久日| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 99riav亚洲国产免费| 久久香蕉精品热| 国产成人精品久久二区二区91| 99久久精品一区二区三区| 免费av不卡在线播放| 成年女人看的毛片在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 免费在线观看成人毛片| 麻豆成人av在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 黄色丝袜av网址大全| 午夜影院日韩av| 真实男女啪啪啪动态图| 午夜福利18| 欧美色视频一区免费| 国产毛片a区久久久久| 两性夫妻黄色片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 精品久久久久久成人av| 日韩欧美国产一区二区入口| 黄片大片在线免费观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 视频区欧美日本亚洲| 99国产精品99久久久久| 日本免费a在线| 超碰成人久久| 欧美黑人巨大hd| 国产视频一区二区在线看| 美女cb高潮喷水在线观看 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 午夜两性在线视频| 日韩有码中文字幕| 村上凉子中文字幕在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 99热只有精品国产| 少妇的逼水好多| 嫩草影院精品99| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 熟女电影av网| 成人性生交大片免费视频hd| 欧美黑人欧美精品刺激| www.精华液| 午夜免费观看网址| 欧美最黄视频在线播放免费| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产精品99久久久久久久久| 欧美黑人巨大hd| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日本三级黄在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久中文字幕一级| 网址你懂的国产日韩在线| 黄片大片在线免费观看| 好男人电影高清在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 校园春色视频在线观看| 国产成年人精品一区二区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 中国美女看黄片| 99视频精品全部免费 在线 | 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久人妻av系列| 国产成人欧美在线观看| 美女大奶头视频| 欧美中文综合在线视频| 波多野结衣高清作品| 中文字幕高清在线视频| cao死你这个sao货| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 天堂√8在线中文| 午夜日韩欧美国产| 啪啪无遮挡十八禁网站| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美色欧美亚洲另类二区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 搞女人的毛片| 男插女下体视频免费在线播放| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲精品456在线播放app | 午夜日韩欧美国产| 欧美在线一区亚洲| 国产午夜福利久久久久久| 三级毛片av免费| 国产真人三级小视频在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 久久久久国内视频| 嫩草影视91久久| 校园春色视频在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲精华国产精华精| 悠悠久久av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 黑人欧美特级aaaaaa片| 听说在线观看完整版免费高清| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品久久久久久,| 国产高清videossex| 成年女人永久免费观看视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 午夜精品在线福利| 色在线成人网| 国产精品一区二区免费欧美| 中文字幕熟女人妻在线| 欧美日韩综合久久久久久 | 午夜视频精品福利| 性欧美人与动物交配| 一进一出好大好爽视频| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产一级毛片七仙女欲春2| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品国产三级普通话版| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 精品国产亚洲在线| 国产日本99.免费观看| 久久久成人免费电影| 国产1区2区3区精品| 国产高清有码在线观看视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产亚洲欧美98| 他把我摸到了高潮在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲五月天丁香| 国产精品综合久久久久久久免费| 校园春色视频在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 婷婷亚洲欧美| 99精品久久久久人妻精品| 五月伊人婷婷丁香| 欧美一级a爱片免费观看看| av在线天堂中文字幕| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 99久久国产精品久久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 一级毛片高清免费大全| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产高潮美女av| 少妇的丰满在线观看| 99久久精品热视频| 亚洲av成人一区二区三| 高清毛片免费观看视频网站| 男女午夜视频在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 99国产综合亚洲精品| 亚洲熟女毛片儿| 首页视频小说图片口味搜索| 天堂动漫精品| 亚洲国产精品合色在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 热99在线观看视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 在线观看午夜福利视频| 免费看a级黄色片| 真实男女啪啪啪动态图| 精品免费久久久久久久清纯| 老汉色∧v一级毛片| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 激情在线观看视频在线高清| 午夜激情欧美在线| 丰满的人妻完整版| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 精品久久久久久,| 啦啦啦观看免费观看视频高清| av视频在线观看入口| 大型黄色视频在线免费观看| 级片在线观看| 日韩欧美免费精品| 999精品在线视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 黄色丝袜av网址大全| 最近视频中文字幕2019在线8| 一区二区三区激情视频| 欧美中文日本在线观看视频| 变态另类丝袜制服| 亚洲专区国产一区二区| 99久久精品国产亚洲精品| 97超视频在线观看视频| 99国产精品一区二区三区| 丝袜人妻中文字幕| 色哟哟哟哟哟哟| 老司机午夜十八禁免费视频| 成人三级黄色视频| 伦理电影免费视频| av欧美777| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲精品美女久久av网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 99国产精品一区二区三区| 老鸭窝网址在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产一区二区在线av高清观看| 91在线观看av| 夜夜爽天天搞| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 免费在线观看成人毛片| 国产一区在线观看成人免费| 久久人妻av系列| 欧美一区二区国产精品久久精品| 特级一级黄色大片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久久久久人人人人人| 最新在线观看一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产欧美日韩精品一区二区| av在线天堂中文字幕| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产亚洲精品久久久com| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲av免费在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 色播亚洲综合网| 久久久久久人人人人人| 欧美丝袜亚洲另类 | 午夜日韩欧美国产| 欧美乱妇无乱码|