富天昕,馮玉超,張麗媛,2,李 雪,王長(zhǎng)遠(yuǎn),2,*
(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 大慶 163319)
代謝組學(xué)這一概念由Nicholson在2002年提出,是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新發(fā)展起來(lái)的一門學(xué)科,是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[1]。概念提出后,該領(lǐng)域的研究迅速發(fā)展并滲透到多個(gè)領(lǐng)域[2-3]。植物代謝組學(xué)是代謝組學(xué)的重要分支,它主要研究的是作為各種代謝路徑的底物和產(chǎn)物的小分子代謝物(mw<1 000 Da),結(jié)合基因、蛋白質(zhì)、表型等綜合分析植物的生理生化過(guò)程[4-5]。而植物體的最終表現(xiàn)方式則由代謝產(chǎn)物體現(xiàn),代謝產(chǎn)物在生物體信息傳遞鏈的末端,是植物代謝的最終產(chǎn)物[6]。
近年來(lái)植物代謝得到迅速發(fā)展,而稻米作為主要糧食作物之一,也成為研究的熱點(diǎn)[7-11]。稻米中富含豐富的蛋白質(zhì)、糖類、脂肪和膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)成分且氨基酸組成比較完全,有助于人體的吸收[12]。稻米的品質(zhì)不僅與品種有關(guān),還與其生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)。不同產(chǎn)地的稻米因其種植的土壤、氣候、水源不同,其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和代謝產(chǎn)物的種類、含量也不盡相同[13]。代謝組學(xué)的研究方法,可以從系統(tǒng)生物學(xué)的角度解釋代謝物變化與生命活動(dòng)現(xiàn)象的關(guān)系,近幾年代謝組學(xué)在農(nóng)產(chǎn)品鑒別與產(chǎn)地區(qū)分方向應(yīng)用廣泛,為農(nóng)產(chǎn)品的溯源提供了新的途徑[14-18]。氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用技術(shù)具有重復(fù)性好、靈敏度高等特點(diǎn),是目前代謝組學(xué)研究中廣泛運(yùn)用的分析技術(shù)并且有很長(zhǎng)的研究歷史[18-22]。田福林等[23]利用GC-MS技術(shù)對(duì)4 種不同產(chǎn)地大米中的脂溶性成分進(jìn)行分析,結(jié)合主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚類分析,建立一種對(duì)不同產(chǎn)地大米進(jìn)行快速鑒定的方法。本實(shí)驗(yàn)利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)黑龍江省建三江地區(qū)和響水地區(qū)的稻米進(jìn)行差異代謝物的研究,探討產(chǎn)地對(duì)水稻代謝物的影響,并從代謝物的角度著手,篩選對(duì)區(qū)分2 個(gè)產(chǎn)地具有重要作用的差異代謝物,為通過(guò)代謝物對(duì)稻米進(jìn)行產(chǎn)地溯源提供理論依據(jù)。
水稻采自黑龍江省建三江和響水地理標(biāo)志稻米保護(hù)區(qū),建三江采樣地點(diǎn)選擇為12 個(gè)農(nóng)場(chǎng)布點(diǎn);響水采樣地點(diǎn)選擇5 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)布點(diǎn),均選擇主產(chǎn)縣、主產(chǎn)鄉(xiāng)(鎮(zhèn)或管理區(qū))、主產(chǎn)村(屯)的大面積種植地塊進(jìn)行采樣,采樣點(diǎn)依照種植范圍大小設(shè)置,每塊地塊隨機(jī)設(shè)置分點(diǎn)5 個(gè)重復(fù),采樣地點(diǎn)按照東、西、南、北、中5 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì),依據(jù)代表性采樣原則,每個(gè)采樣點(diǎn)按照不同方位采集1~2 kg稻穗,每個(gè)產(chǎn)區(qū)選取30 個(gè)樣本。響水地區(qū)水稻品種為稻花香,建三江地區(qū)品種主要為龍粳系列,龍粳26、龍粳29、龍粳31、龍粳39、龍粳40、龍粳43、龍粳46,以及綏粳4、松粳9等。
吡啶(純度≥99.9%)、甲醇(均為色譜純) 美國(guó)阿拉丁試劑有限公司;2-氯苯丙氨酸(純度98.5%)、甲氧基胺鹽酸鹽(純度98%)、99% N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷) 上海麥克林試劑有限公司。
7890A/5975C GC-MS聯(lián)用儀、HP-5ms色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm) 美國(guó)Agilent公司;QP2010 GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;MTN-2800D氮吹濃縮裝置 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;恒溫箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;TGL-16B臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。
樣品制備根據(jù)王玲[24]的方法加以改進(jìn)。稻種子液氮研磨后稱取50 mg粉末于2 mL的EP管中,加入800 μL甲醇和10 μL內(nèi)標(biāo)(2-氯苯丙氨酸),渦旋混勻30 s,置于4 ℃離心機(jī)中,12 000 r/min離心15 min,吸取200 μL上清液,轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶中氮?dú)獯蹈伞Q苌喝?0 μL甲氧氨鹽酸吡啶溶液至濃縮后的樣品中,渦旋混勻至完全溶解,置于37 ℃恒溫箱90 min,取出后加入30 μL N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺,置于70 ℃烘箱60 min,取出后待檢測(cè)。
數(shù)據(jù)的特征峰提取和預(yù)處理在R軟件平臺(tái)采用XCMS軟件包條件下進(jìn)行,將處理的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P軟件,進(jìn)行PCA[24]、正交偏最小二乘-判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)等多元統(tǒng)計(jì)分析,再根據(jù)變量對(duì)分組貢獻(xiàn)值(variable importance in the projection,VIP)的大小和組間變化的顯著性(P<0.05)進(jìn)行差異性代謝產(chǎn)物的篩選。差異性代謝物的定性方法為:根據(jù)保留時(shí)間及質(zhì)荷比(m/z)在NIST商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)和Wiley Registry代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋。
2.1.1 典型離子流色譜分析
由圖1可以看出,色譜峰基線平穩(wěn),峰分離效果良好,儀器穩(wěn)定性良好。
圖1 典型樣本的總離子流色譜圖Fig. 1 Typical total ion chromatogram of rice metabolites
2.1.2 代謝組分的質(zhì)譜分析
通過(guò)對(duì)GC-MS原始數(shù)據(jù)的處理,兩產(chǎn)地60 個(gè)稻米種子樣品中共掃描到143 個(gè)峰,根據(jù)保留時(shí)間及m/z在NIST商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)和Wiley Registry代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋,共注釋到39 個(gè)代謝產(chǎn)物,其中建三江地區(qū)有29 個(gè)代謝產(chǎn)物,響水地區(qū)有26 個(gè)代謝產(chǎn)物,如表1所示。
表1中1~16號(hào)為建三江地區(qū)和響水地區(qū)共同存在的代謝物,17~29號(hào)為建三江地區(qū)稻米樣品相對(duì)于響水地區(qū)樣品具有的代謝物,30~39號(hào)為響水地區(qū)稻米樣品相對(duì)于建三江地區(qū)樣品具有的代謝物,除共同存在的代謝物外,2 個(gè)產(chǎn)地單獨(dú)具有的代謝物并不一定是相應(yīng)產(chǎn)地特有的代謝物,可能還與稻米樣品的品種有關(guān),由此可知,產(chǎn)地不同,稻米的代謝物的數(shù)量不也相同。如表2所示,建三江地區(qū)與響水地區(qū)相比,多元醇、有機(jī)酸類物質(zhì)含量要高于響水地區(qū),而響水地區(qū)的糖類、脂肪酸、氨基酸和其他類物質(zhì)要高于建三江地區(qū),核苷酸類物質(zhì)含量相差不多,可見(jiàn)產(chǎn)地不同對(duì)稻米代謝物的種類也會(huì)有影響。
表2 建三江地區(qū)和響水地區(qū)稻米代謝物分類Table 2 Classification of metabolites in rice samples from Jiansanjiang and Xiangshui%
2.2.1 PCA結(jié)果
圖2 2 種樣品的PCA得分圖Fig. 2 PCA scores plot of two rice samples
為判別建三江地區(qū)和響水地區(qū)稻米樣品間的差異,首先采用PCA方法進(jìn)行分析,共得到3 個(gè)主成分,累計(jì)R2X=0.675,Q2=0.52,2 個(gè)參數(shù)數(shù)值均大于0.5,且二者數(shù)值相差不大,說(shuō)明PCA效果較好。如圖2所示,兩產(chǎn)地稻米樣品除個(gè)別異常樣品外絕大部分的樣品均處于在置信區(qū)間內(nèi),但兩產(chǎn)地樣品并未完全分開(kāi),還存在個(gè)別的重疊樣品,說(shuō)明這些樣本中所含有的分子的組成和濃度越接近,而分子組成和濃度接近可能是相同品種間的聚集,也有可能是不同品種但是組分含量上相近。PCA這種無(wú)監(jiān)督分析方法不能忽略組內(nèi)誤差、消除與研究目的無(wú)關(guān)的隨機(jī)誤差,所以不利于發(fā)現(xiàn)組間差異,之后將采用有監(jiān)督的方法進(jìn)行進(jìn)一步研究。
2.2.2 OPLS-DA結(jié)果
通過(guò)OPLS-DA可以過(guò)濾掉代謝物中,與分類變量不相關(guān)的正交變量,并對(duì)非正交變量和正交變量分別分析,從而獲取更加可靠的代謝物的組間差異與實(shí)驗(yàn)組的相關(guān)程度信息[26]。如圖3所示,建三江地區(qū)的稻米樣品主要分布在置信區(qū)間的左側(cè),響水地區(qū)的稻米樣品主要分布在置信區(qū)間的右側(cè),兩產(chǎn)地稻米樣品區(qū)分效果很好。本次OPLS-DA得到2 個(gè)主成分,R2X=0.575,R2Y=0.63,Q2=0.479,3 個(gè)參數(shù)數(shù)值接近或大于0.5,且相差不多,說(shuō)明OPLS-DA模型可解釋度較好,相比于PCA模型效果更好。
圖3 兩產(chǎn)地樣本OPLS-DA得分圖Fig. 3 OPLS-DA score plot of two rice samples
2.2.3 OPLS-DA置換檢驗(yàn)結(jié)果
置換檢驗(yàn)通過(guò)隨機(jī)改變分類變量Y的排列順序,多次建立對(duì)應(yīng)的OPLS-DA模型以獲取隨機(jī)模型的R2和Q2值,在避免檢驗(yàn)?zāi)P偷倪^(guò)擬合以及評(píng)估模型的統(tǒng)計(jì)顯著性上有重要作用。對(duì)OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)結(jié)果如4圖所示。
圖4 建三江地區(qū)與響水地區(qū)稻米樣品OPLS-DA置換檢驗(yàn)結(jié)果圖Fig. 4 OPLS-DA replacement test results of rice samples collected from Jiansanjiang and Xiangshui
由圖4可知,所有R2點(diǎn)從左到右均低于最右的原始的R2點(diǎn),所有Q2點(diǎn)均低于右側(cè)的原始Q2點(diǎn),且點(diǎn)的回歸線與橫坐標(biāo)交叉或者小于0,說(shuō)明OPLS-DA模型是可靠的,可以較好地解釋兩組樣本之間的差異。同時(shí)隨著置換保留度逐漸降低,置換的Y變量比例增大,隨機(jī)模型的R2和Q2均逐漸下降,說(shuō)明原模型不存在過(guò)擬合現(xiàn)象,模型穩(wěn)健性較好。
2.2.4 兩地區(qū)稻米樣品的差異代謝物鑒定
采用OPLS-DA模型的VIP值(閾值>1),并結(jié)合學(xué)生氏t檢驗(yàn)(t-test)的P值(閾值<0.05)來(lái)尋找差異性表達(dá)代謝物。差異性代謝物的定性方法為:根據(jù)保留時(shí)間及m/z在NIST庫(kù)和Wiley Registry代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)中查找與其匹配的物質(zhì)。兩地區(qū)樣品差異代謝物的定性結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,兩產(chǎn)地水稻樣品共篩選出16 種差異代謝產(chǎn)物,由log2(fc-XS/JSJ)值可知,篩選出的16 種差異代謝物中除α-D-甲基呋喃果糖苷外,其余15 種差異代謝物含量均是響水地區(qū)稻米樣品高于建三江地區(qū)的稻米樣品,且倍數(shù)在1.54~3.05之間,含量差異顯著,雖然α-D-甲基呋喃果糖苷的含量是建三江地區(qū)高于響水地區(qū),但是可以看出高出的倍數(shù)為0.02,數(shù)值很小。整體看來(lái)響水地區(qū)稻米中差異代謝物的含量要高于建三江地區(qū),說(shuō)明稻米的產(chǎn)地不同,相同代謝產(chǎn)物的含量也有明顯差異,稻米代謝產(chǎn)物受產(chǎn)地的影響顯著。
表3 兩地區(qū)樣品差異代謝物的定性結(jié)果Table 3 Qualitative analysis of differential metabolites in rice samples collected from two regions
2.3.1 差異代謝物熱圖分析
圖5 差異代謝物熱圖Fig. 5 Heatmap of the differential metabolites
通過(guò)R(v3.3.2)中pheatmap程序包對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行數(shù)據(jù)縮放,同時(shí)對(duì)樣本和代謝物進(jìn)行雙向聚類。由圖5可知,圖中紅色區(qū)域表示差異代謝物的高表達(dá)區(qū),綠色部分表示差異代謝產(chǎn)物的低表達(dá)區(qū)。通過(guò)篩選出的差異代謝物將兩產(chǎn)地的樣品進(jìn)行聚類分析,響水地區(qū)的稻米樣品主要集中在紅色的高表達(dá)區(qū)域,而建三江地區(qū)的稻米樣品則主要集中在綠色低表達(dá)區(qū),說(shuō)明響水地區(qū)的稻米樣品中差異代謝物的含量普遍高于建三江地區(qū),響水稻米樣品中的差異代謝物的代謝機(jī)能更為活躍,同時(shí)也可以看出同產(chǎn)地樣品的代謝物具有相近的表達(dá)程度,可見(jiàn)產(chǎn)地對(duì)稻米的代謝具有很大的影響。影響水稻生長(zhǎng)的因素非常復(fù)雜,其中溫度與光照是最為重要的因素[27]。響水地區(qū)所處的地理位置位于火山爆發(fā)出的巖漿凝結(jié)的熔巖臺(tái)地,地溫、水溫比一般的稻田地高2~3 ℃左右,在晝夜溫差大的北方,形成了有利的稻米生長(zhǎng)環(huán)境,使其具備更好的溫度和濕度條件,較高的溫度條件能增強(qiáng)水稻的光合作用和根葉的呼吸作用,從而提高了稻米的代謝速率[28],這可能是導(dǎo)致響水地區(qū)的稻米代謝產(chǎn)物高表達(dá)的原因。
2.3.2 差異代謝物通路分析
京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)注釋分析僅找到所有差異代謝物參與的通路,MetPA數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)代謝通路濃縮和拓?fù)浞治?,能識(shí)別出可能的受生物擾動(dòng)的代謝通路,可以對(duì)通路進(jìn)行進(jìn)一步的篩選,找到與代謝物差異相關(guān)性最高的關(guān)鍵通路,結(jié)果如表4所示。
表4 差異代謝物參與的代謝途徑明細(xì)Table 4 List of metabolic pathways with the involvement of differential metabolites
富集分析和拓?fù)浞治龉矘?biāo)注到4 個(gè)較為重要的代謝途徑,包括脂肪酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、嘧啶代謝、氨酰-tRNA生物合成。脂肪酸可為稻米提供能量,且對(duì)植物本身的抗逆性起重要的作用,使其可以適應(yīng)寒冷的生長(zhǎng)環(huán)境[29]。精氨酸和脯氨酸是稻米氨基酸重要組成,脯氨酸是稻米代謝產(chǎn)物中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),它起到保持原生質(zhì)和環(huán)境滲透平衡、阻止水分喪失的作用。此外,脯氨酸還直接影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,還可作為含氮的儲(chǔ)藏物質(zhì)和恢復(fù)生長(zhǎng)的能源,還有研究表明,低溫下水稻幼苗脯氨酸含量會(huì)隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加[30-31]。不同產(chǎn)地環(huán)境特點(diǎn)不同,盡管建三江地區(qū)與響水地區(qū)位于同省份內(nèi),且均適合水稻的生長(zhǎng),但建三江地處三江平原腹地,屬寒溫帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候,年平均氣溫1~2 ℃,平均降水量為550~600 mm,而響水大米產(chǎn)區(qū)寧安市屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候,年平均氣溫3.5 ℃,平均降水量為400~600 mm,氣溫、降水量均有較大差異,所以其產(chǎn)地生長(zhǎng)的稻米為適應(yīng)環(huán)境會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)代謝水平來(lái)適應(yīng)環(huán)境,以便更好地生長(zhǎng),從而其各種代謝物的含量會(huì)出現(xiàn)差異,同時(shí)也會(huì)賦予稻米不同的品質(zhì)。氨酰-tRNA生物合成是形成蛋白質(zhì)的重要通路。在蛋白質(zhì)的生物合成中,氨酰-tRNA作為氨基酸轉(zhuǎn)移到肽鏈的羧末端過(guò)程的中間物而發(fā)揮重要的作用[32-33]。氨酰-tRNA合成酶在識(shí)別它所催化的氨基酸時(shí)需要ATP,所以光照是氨酰-tRNA生物合成途徑的關(guān)鍵因素[34],響水大米的光照周期明期與暗期比為7∶17,建三江大米的光照周期明期與暗期比為6∶18,兩地區(qū)均有充足的光照可滿足氨酰-tRNA生物合成途徑,但光照情況還是有所差異。產(chǎn)地的差異對(duì)水稻機(jī)體的多種終端代謝途徑造成了一定影響,但產(chǎn)地影響稻米代謝途徑及其機(jī)理尚未清楚,有待進(jìn)一步研究。
本研究基于GC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)黑龍江省響水地區(qū)和建三江地區(qū)的60 個(gè)的稻米樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析,考察不同產(chǎn)地對(duì)稻米代謝產(chǎn)物的影響。實(shí)驗(yàn)共鑒定出39 個(gè)代謝產(chǎn)物,其中響水地區(qū)包括26 個(gè)代謝產(chǎn)物,建三江地區(qū)包括29 個(gè)代謝產(chǎn)物。對(duì)樣品進(jìn)行PCA和OPLSDA等多元分析,兩產(chǎn)地共篩選出16 種差異代謝物,響水地區(qū)稻米差異代謝物含量要高于建三江地區(qū),且倍數(shù)在1.54~3.05 倍之間,通過(guò)差異代謝物可以對(duì)兩產(chǎn)地的稻米樣品進(jìn)行較好的區(qū)分,說(shuō)明不同產(chǎn)地生長(zhǎng)的稻米其代謝產(chǎn)物的種類和含量均不相同,產(chǎn)地對(duì)稻米的代謝具有重要的影響,而稻米的代謝產(chǎn)物可能攜帶著其產(chǎn)地的信息。綜上所述,基于GC-MS技術(shù)的代謝組學(xué)分析方法用于分析產(chǎn)地對(duì)水稻代謝產(chǎn)物的影響具有一定的可行性,可為因環(huán)境不同而導(dǎo)致的稻米品質(zhì)差別提供可視化的理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)證明利用基于GC-MS聯(lián)用技術(shù),結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析的方法,可用于分析環(huán)境對(duì)水稻代謝產(chǎn)物的影響,可為稻米的溯源提供理論基礎(chǔ)。