牛初乳和牛常乳乳清N-糖蛋白質(zhì)的差異分析

曹雪妍，劉 瑛，楊 梅，楊 寧，梁肖娜，武俊瑞，烏日娜，陶冬冰，劉 彪，葉文慧，岳喜慶,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

牛乳營養(yǎng)豐富，含有多種人體所需的蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、低聚糖和礦物質(zhì)等成分。牛乳作為人類膳食中消費(fèi)最多的動物乳，不僅能夠提供營養(yǎng)成分，還可以提供多種生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)生長發(fā)育、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗病毒和促進(jìn)腸道健康等作用[1]。蛋白質(zhì)是牛乳中的重要成分，約占牛乳的3.5%。牛乳蛋白主要分為酪蛋白、乳清蛋白和乳脂肪球膜蛋白，其中乳清蛋白約占牛乳總蛋白的20%，營養(yǎng)價值高，與酪蛋白相比，更易于被人體消化吸收，被認(rèn)為是人體優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑之一[2-3]。乳清蛋白含有乳球蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白和一些小分子肽等活性物質(zhì)，非常適合嬰幼兒、兒童、青少年、運(yùn)動員和術(shù)后恢復(fù)者等群體，被廣泛應(yīng)用于嬰幼兒配方乳和功能性食品的生產(chǎn)中[4]。

由于乳清蛋白的重要作用，近年來關(guān)于乳清蛋白的研究越來越多。研究者們采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，闡明了人乳、牛乳、羊乳等哺乳動物乳的蛋白質(zhì)組成并比較分析了它們之間的差異[5-8]。然而，生命體內(nèi)許多重要的生物過程除受到蛋白質(zhì)種類及含量的調(diào)控外，還與蛋白質(zhì)的翻譯后修飾密切相關(guān)。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾對于執(zhí)行蛋白質(zhì)特定的功能是極其重要的，它使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、功能更完善、調(diào)控機(jī)制也更精細(xì)[9]。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾主要包括糖基化、磷酸化、乙酰化和泛素化等，其中，糖基化是一種最常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在細(xì)胞識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的作用，研究表明，生物體內(nèi)約有50%以上的蛋白質(zhì)會發(fā)生糖基化[10]。以往對乳汁蛋白質(zhì)糖基化的研究多集中在乳中幾種主要糖蛋白的含量及其隨泌乳期的變化[11]。近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展成熟，大規(guī)模的糖蛋白質(zhì)組學(xué)和糖組學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)糖基化的研究中，動物乳及不同泌乳期人乳蛋白質(zhì)糖基化的研究取得了一定進(jìn)展[12-17]，然而，大規(guī)模的不同泌乳期牛乳蛋白質(zhì)糖基化研究卻鮮有報道。

因此，本研究利用非標(biāo)記定量糖蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析了不同泌乳期牛乳（牛初乳和牛常乳）乳清N-糖蛋白質(zhì)的組成及其糖基化位點(diǎn)差異表達(dá)情況，并利用生物信息學(xué)手段，分析了牛乳乳清N-糖蛋白的功能，為評價和改善牛乳品質(zhì)、研發(fā)嬰幼兒配方乳中糖蛋白質(zhì)的改良及功能食品的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳樣品采集自沈陽輝山乳業(yè)牧場，隨機(jī)選擇年齡1～6 歲之間的健康荷斯坦奶牛，飼養(yǎng)管理條件一致，分別在產(chǎn)后0～5 d和1～6 個月各收集60 頭奶牛的乳樣，記為牛初乳組和牛常乳組。收集的乳樣迅速降溫至－20 ℃，立即運(yùn)送至實驗室并貯藏于－80 ℃?zhèn)溆?。實驗前，分別混合初乳和常乳，以排除個體差異。

二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、十二烷基硫酸鈉、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、尿素、三羥甲基氨基甲烷（Tris） 美國Bio-Rad公司；胰蛋白酶（測序級） 美國Promega公司；C18固相萃取小柱美國Waters公司；伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，ConA）、麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）、蓖麻凝集素（Ricinus communis agglutinin，RCA）、Bradford蛋白定量試劑盒、H218O、NH4HCO3美國Sigma公司；30 kDa超濾離心管 美國Millipore公司；糖苷酶F（N-glycosidase F，PNGase F） 瑞士Roche公司；甲酸、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；鹽酸、氯化錳、氯化鈣、氯化鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher公司；5430R型低溫高速離心機(jī)、微量移液器 德國Eppendorf公司；氮吹儀 美國Organomation公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；真空冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白的制備

分別取牛初乳和牛常乳混合樣品50 mL，4 ℃、10 000×g離心15 min，小心移除上層的乳脂肪層，取下層脫脂乳，4 ℃、150 000×g離心1 h，收集上清液樣品，即乳清樣品。向乳清中加入4 倍體積預(yù)冷丙酮，混勻，－20 ℃過夜后，4 ℃、12 000×g離心15 min，收集下層沉淀，重復(fù)2 次后冷凍干燥，得到乳清蛋白，采用Bradford法測定蛋白含量[18]。

1.3.2 乳清蛋白的蛋白酶酶解

分別取牛初乳和牛常乳乳清蛋白800 μg加入適量的UA buffer（0.1 mol/L NH4HCO3、0.1 mol/L Tris-HCl pH 8.0、8 mol/L尿素），加入DTT溶液至最終濃度10 mmol/L，混合均勻后至于37 ℃孵育2.5 h，然后冷卻至室溫，加入IAA至最終濃度50 mmol/L，暗處靜置孵育30 min。加入5 倍體積的水，將UA濃度稀釋至1.5 mol/L，按照1∶50的比例加入1 mg/mL的胰蛋白酶，37 ℃酶切18 h。酶解液經(jīng)過C18固相萃取小柱脫鹽。

1.3.3 N-糖基化肽段的富集及H218O中脫糖鏈

N-糖基化肽段的富集參考文獻(xiàn)[10,19]的方法。將酶解后的肽段轉(zhuǎn)移至新的30 kDa超濾離心管中，加入50 μL的凝集素混合液CWR（90 μg ConA、90 μg WGA和90 μg RCA），700 r/min振蕩3 min后，室溫放置1 h，14 000×g離心30 min。加入200 μL的結(jié)合緩沖液（20 mmol/L pH 7.3 Tris-HCl、0.5 mol/L CaCl2、0.5 mol/L MnCl2、0.25 mol/L NaCl），14 000×g離心30 min，重復(fù)4 次。加入50 μL的H218O配制的25 mmol/L NH4HCO3，14 000×g離心30 min，重復(fù)1 次。采用50 μL H218O配制的25 mmol/L NH4HCO3溶液溶解2 μg PNGase F，加入超濾離心管，37 ℃酶切3 h，反應(yīng)結(jié)束后，換新收集管，14 000×g離心30 min，再加入40 μL H218O配制的25 mmol/L NH4HCO3溶液，14 000×g離心30 min，收集濾液，凍干待用。

1.3.4 細(xì)管高效液相色譜-質(zhì)譜分析

采用0.1%的甲酸溶液復(fù)溶脫糖肽，取復(fù)溶后的肽段進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析，每個樣品測定3 次。采用納升流速高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動相A液為0.1%甲酸-乙腈溶液（乙腈2%），B液為0.1%甲酸-乙腈溶液（乙腈84%）。上樣柱為Acclaim PepMap100 nanoViper C18柱（100 μm×2 cm，3 μm）；分析柱為EASY column C18柱（75 μm×10 cm，3 μm）。梯度洗脫程序如下：0～110 min，流動相B從0%～55%；110～115 min，流動相B從55%～100%；其后以100%流動相B保持5 min。流速為300 nL/min，脫糖肽經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀分析。

質(zhì)譜分析時長為120 min，采用正離子模式檢測，母離子質(zhì)量掃描范圍m/z 300～1 800，一級質(zhì)譜分辨率70 000（m/z 200）；每次全掃描后采集10 個離子峰進(jìn)行二次采集，二級質(zhì)譜分辨率17 500（m/z 200），碰撞能量27 eV。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用MaxQuant 1.3.0.5軟件對質(zhì)譜分析的RAW文件進(jìn)行鑒定分析。數(shù)據(jù)庫下載自UniProt，物種為牛（Bos taurus）。搜庫參數(shù)如下：酶為胰蛋白酶；最大漏切位點(diǎn)為2；固定修飾為半胱氨酸胺乙酰化；可變修飾為甲硫氨酸氧化和天冬酰胺脫氨基；肽段的質(zhì)量偏差為10×10－6，碎片的質(zhì)量偏差為0.1 Da。

1.5 生物信息學(xué)分析

為確定差異表達(dá)糖蛋白的功能，利用在線DAVID Bioinformatics Resources 6.8數(shù)據(jù)分析平臺進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），分析差異表達(dá)糖蛋白的基因本體論（gene ontology，GO）功能注釋和參與的Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）代謝通路。利用STRING V 10.5軟件（https://string-db.org/）分析差異蛋白之間的相互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳N-糖蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

圖1 鑒定的N-糖肽分子質(zhì)量偏差分布情況Fig. 1 Molecular mass error distribution of the identified N-glycosylated peptides

采用糖蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，鑒定N-糖蛋白及其糖基化位點(diǎn)。牛初乳和牛常乳乳清經(jīng)過蛋白酶解、凝集素富集糖肽和糖苷酶去糖鏈處理后，采用高精度的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，獲得的數(shù)據(jù)使用MaxQuant 1.3.0.5軟件檢索，使用錯誤發(fā)現(xiàn)率低于0.01的過濾結(jié)果[20]，本研究鑒定到的N-糖肽的分子質(zhì)量偏差均小于6×10－6，表明質(zhì)譜鑒定結(jié)果準(zhǔn)確度高（圖1）。

選擇3 次實驗中至少有2 次以上具有鑒定結(jié)果的糖肽進(jìn)行分析。如圖2所示，在牛初乳和牛常乳乳清部分共鑒定到154 個N-糖蛋白和246 個糖基化位點(diǎn)，其中，牛初乳中鑒定到117 個N-糖蛋白和183 個糖基化位點(diǎn)，牛常乳中鑒定到109 個N-糖蛋白和145 個糖基化位點(diǎn)。牛初乳和牛常乳共同鑒定到62 個N-糖蛋白和82 個糖基化位點(diǎn)；牛初乳單獨(dú)鑒定到55 個N-糖蛋白和101 個糖基化位點(diǎn)；牛常乳單獨(dú)鑒定到37 個N-糖蛋白和63 個糖基化位點(diǎn)。

質(zhì)譜技術(shù)在分析蛋白質(zhì)及其糖基化中起到重要作用，Yang Yongxin等[13]采用糖蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在牛常乳乳清中鑒定到72 個N-糖蛋白。除常乳外，本研究還對初乳N-糖蛋白進(jìn)行了鑒定，并得到更多的牛乳乳清N-糖蛋白及其糖基化位點(diǎn)，這對于深入理解牛乳蛋白質(zhì)糖基化修飾具有重要意義。牛乳乳清中幾種主要的糖蛋白在初乳和常乳中均有表達(dá)，包括免疫球蛋白、多聚免疫球蛋白受體、乳鐵蛋白、叢生蛋白和α-乳白蛋白等[21]。Le等[22]分別在牛初乳和牛常乳中鑒定到253 種和257 種蛋白[22]，烏蘭君等[23]分別在牛初乳和牛常乳中鑒定到290 種和325 種蛋白。然而，本實驗在初乳中鑒定到的糖蛋白和糖基化位點(diǎn)數(shù)量均高于常乳。初乳的攝入，是初生小牛能夠存活并健康成長發(fā)育的重要因素。與常乳相比，初乳含有更多的糖蛋白而且一些蛋白含有更多的糖基化位點(diǎn)，這可能與初乳需要提供更多的具有特殊功能的蛋白質(zhì)有關(guān)，因為蛋白質(zhì)糖基化修飾與蛋白質(zhì)的功能密切相關(guān)，這些不同的糖基化位點(diǎn)連接的糖鏈可以提供不同的抗原識別表位，調(diào)控固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[24]。

圖2 牛初乳和牛常乳乳清N-糖蛋白和N-糖基化位點(diǎn)韋恩圖Fig. 2 Venn diagrams of N-glycoproteins and N-glycosylation sites in bovine colostrum and mature milk whey

初乳中叢生蛋白（P17697）糖基化位點(diǎn)N-283表達(dá)量最高，是牛常乳的6.86 倍。此外，叢生蛋白糖基化位點(diǎn)N-80、N-139、乳凝集素（Q95114）糖基化位點(diǎn)N-227和α-乳白蛋白（P00711）糖基化位點(diǎn)N-93在初乳中表達(dá)量較高；常乳中α-乳白蛋白糖基化位點(diǎn)N-93表達(dá)量最高，是初乳的2.59 倍，此外，分泌球蛋白家族1D成員（A0JNP2）糖基化位點(diǎn)N-87、α-乳白蛋白糖基化位點(diǎn)N-64、α-1-酸性糖蛋白（Q3SZR3）糖基化位點(diǎn)N-136和血小板糖蛋白（P26201）糖基化位點(diǎn)N-172在常乳中表達(dá)量較高。叢生蛋白屬于牛乳中的低豐度蛋白，本研究發(fā)現(xiàn)，其糖肽（FTENNDRTVCKEIRHN283STGCLRMKDQ CEKCQ）表達(dá)量在初乳中最高。叢生蛋白是細(xì)胞外伴侶分子，在刺激反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用，參與補(bǔ)體通路，具有保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激引起的蛋白質(zhì)損害，防止細(xì)胞凋亡和細(xì)胞溶解的作用[25]。α-乳白蛋白是牛乳乳清中的高豐度蛋白，其糖肽（IWCKDD QNPHSSNICN93ISCDKFLDDDLTDDI）表達(dá)量在常乳中最高。α-乳白蛋白具有生物活性，在調(diào)節(jié)乳糖合成及乳汁分泌過程中發(fā)揮著重要作用，同時，乳白蛋白含有豐富的氨基酸，對嬰兒神經(jīng)發(fā)育及健康生長等方面具有重要作用[26]。

2.2 糖基化位點(diǎn)分析

圖3 N-糖基化位點(diǎn)注釋信息和N-糖蛋白分布情況Fig. 3 N-glycosylation sites in UniProt database and their distribution

如圖3A所示，檢索UniProt數(shù)據(jù)庫可知，牛乳鑒定到的246 個N-糖基化位點(diǎn)中，已有文獻(xiàn)支持的糖基化位點(diǎn)有28 個（11.4%），潛在的糖基化位點(diǎn)58 個（23.6%），未知的糖基化位點(diǎn)160 個（65.0%）。如圖3B所示，牛乳中鑒定到的N-糖蛋白含有1～8 個糖基化位點(diǎn)，其中104 個N-糖蛋白（67.5%）含有1 個糖基化位點(diǎn)，30 個N-糖蛋白（19.5%）含有2 個糖基化位點(diǎn)，10 個N-糖蛋白（6.5%）含有3 個糖基化位點(diǎn)，3 個N-糖蛋白（1.9%）含有4 個糖基化位點(diǎn)，7 個N-糖蛋白（4.4%）含有5 個及以上糖基化位點(diǎn)。這與人乳和牛乳乳清N-糖蛋白糖基化位點(diǎn)分布情況相似[13-14]。在牛乳乳清中，叢生蛋白具有最多的N-糖基化位點(diǎn)，在初乳和常乳中分別含有8 個和5 個糖基化位點(diǎn)；多聚免疫球蛋白受體在初乳和常乳中分別含有5 個和2 個糖基化位點(diǎn)，這些蛋白的糖基化位點(diǎn)數(shù)量在初乳中高于常乳。

2.3 牛初乳、牛常乳差異表達(dá)N-糖蛋白

采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對牛初乳和牛常乳乳清N-糖蛋白進(jìn)行比較分析[14]。選取N-糖基化位點(diǎn)表達(dá)量差異3 倍以上的糖蛋白整理為定量差異表達(dá)糖蛋白，共有40 個糖蛋白的53 個糖基化位點(diǎn)在初乳和常乳中差異表達(dá)，其中27 個糖蛋白的37 個糖基化位點(diǎn)在初乳中表達(dá)上調(diào)，15 個糖蛋白的16 個糖基化位點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。選取牛初乳、牛常乳乳清的3 次重復(fù)樣本中，其中3 次分析均無定量數(shù)據(jù)，而另一組中有2 次及以上定量數(shù)據(jù)的N-糖基化位點(diǎn)整理為特異性表達(dá)糖基化位點(diǎn)并記為有無差異，將初乳、常乳特異性表達(dá)糖蛋白分別歸入上調(diào)組及下調(diào)組。初乳和常乳中共有106 個糖蛋白的137 個特異性表達(dá)糖基化位點(diǎn)，其中初乳中鑒定到64 個糖蛋白的85 個特異性表達(dá)糖基化位點(diǎn)，常乳中鑒定到46 個糖蛋白的52 個特異性表達(dá)糖基化位點(diǎn)。綜合考慮定量差異及有無差異，初乳和常乳乳清中共鑒定到129 個糖蛋白的190 個差異表達(dá)糖基化位點(diǎn)，其中70 個糖蛋白在初乳中上調(diào)，49 個糖蛋白下調(diào)，10 個蛋白既有上調(diào)又有下調(diào)糖基化位點(diǎn)。

2.4 差異表達(dá)N-糖蛋白的GO功能注釋分析

利用生物信息學(xué)軟件對鑒定到的牛初乳和牛常乳乳清中差異表達(dá)的N-糖蛋白進(jìn)行分析，可以進(jìn)一步了解不同泌乳期牛乳蛋白質(zhì)糖基化的功能。采用在線DAVID數(shù)據(jù)分析平臺對乳清129 個差異表達(dá)糖蛋白進(jìn)行GO功能注釋分析，包括生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能3 個方面。如圖4所示，牛乳乳清差異表達(dá)糖蛋白參與的生物學(xué)過程是生物調(diào)節(jié)（24.5%）、刺激性反應(yīng)（22.8%）、多細(xì)胞生物過程（15.2%）、定位（14.1%）、免疫系統(tǒng)過程（9.3%）、多生物過程（7.2%）和生物黏附作用（6.9%）；這些差異表達(dá)糖蛋白主要分布為細(xì)胞外區(qū)域（29.8%）、細(xì)胞器（25.9%）、細(xì)胞外區(qū)域部分（24.3%）和膜（17.4%），少量蛋白分布在細(xì)胞外基質(zhì)（2.6%）；差異表達(dá)糖蛋白主要的分子功能是結(jié)合作用（47.6%）、催化活性（21.0%）、分子功能調(diào)節(jié)（11.9%）和轉(zhuǎn)運(yùn)活性（8.4%），此外還有分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、信號轉(zhuǎn)的活性、結(jié)構(gòu)分子活性和抗氧化活性。人乳乳清N-糖蛋白GO分析表明，不同泌乳期差異表達(dá)糖蛋白參與的生物學(xué)過程主要是定位、免疫系統(tǒng)過程刺激反應(yīng)和生物調(diào)節(jié)等；細(xì)胞成分是細(xì)胞外區(qū)域部分；分子功能主要是結(jié)合作用和調(diào)節(jié)作用[14]，這些GO功能注釋類別與牛乳差異N-糖蛋白注釋類別很多是重合的，包括刺激性反應(yīng)、定位、免疫系統(tǒng)過程、生物調(diào)節(jié)等，說明牛乳作為生產(chǎn)嬰幼兒配方乳的主要原料，其乳清差異表達(dá)糖蛋白的某些功能與人乳乳清是相似的，可以提供一些與免疫和生長發(fā)育相關(guān)的糖蛋白。

圖4 牛乳乳清差異N-糖蛋白的GO注釋圖Fig. 4 GO annotation of the differentially expressed whey N-glycoproteins in bovine milk

2.5 差異表達(dá)N-糖蛋白的KEGG通路分析

圖5牛乳乳清差異N-糖蛋白的KEGG通路圖Fig. 5 KEGG pathway analysis of the differentially expressed whey N-glycoproteins in bovine milk

在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)構(gòu)成信號通路以行使其生物學(xué)功能。因此，對牛初乳和牛常乳乳清差異表達(dá)糖蛋白進(jìn)行KEGG分析可以更全面地了解它們參與的代謝通路，進(jìn)而闡明其功能。對129 個差異表達(dá)糖蛋白進(jìn)行KEGG代謝通路分析，共匹配到48 個代謝通路，其中主要的代謝通路如圖5所示，包括補(bǔ)體與凝血級聯(lián)、金黃色葡萄球菌感染、溶酶體、PI3K-Akt信號通路、吞噬作用、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、肺結(jié)核、百日咳、造血細(xì)胞譜系、糖胺聚糖和其他聚糖降解。結(jié)合人乳乳清N-糖蛋白的研究與本研究發(fā)現(xiàn)，人乳乳清差異表達(dá)N-糖蛋白參與的KEGG代謝通路與牛乳乳清差異表達(dá)N-糖蛋白均參與了補(bǔ)體與凝血級聯(lián)、金黃色葡萄球菌感染、溶酶體、PI3K-Akt信號通路、吞噬作用、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用和肺結(jié)核通路[14]，說明牛乳與人乳乳清蛋白N-糖基化的部分功能具有重疊。

生物體內(nèi)存在一套重要的免疫系統(tǒng)，它可以識別和排除抗原性異物，通過與機(jī)體其他系統(tǒng)相互作用來實現(xiàn)機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和生理平衡。補(bǔ)體系統(tǒng)是一種重要的先天免疫途徑，起到破壞和清除病原微生物的作用。補(bǔ)體系統(tǒng)由40多種蛋白質(zhì)組成，其中大部分補(bǔ)體蛋白是糖蛋白，它們共同形成了一個蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)體系[27]。在牛乳乳清差異表達(dá)N-糖蛋白中有18 種蛋白參與了補(bǔ)體與凝血級聯(lián)通路，主要包括一些補(bǔ)體成分、補(bǔ)體因子和凝血因子等。牛乳乳清中，甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸肽酶的2 個糖基化位點(diǎn)在初乳中上調(diào)表達(dá)，補(bǔ)體成分C1,r亞組分的2 個糖基化位點(diǎn)和纖維蛋白原γ-B鏈的1 個糖基化位點(diǎn)下調(diào)表達(dá)。這些補(bǔ)體系統(tǒng)的上游因子對于激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑和凝集素途徑以及活化補(bǔ)體C3具有重要作用[27]。C3是哺乳動物補(bǔ)體系統(tǒng)最重要的組成部分，是該通路的激活和效應(yīng)中心[28]。牛初乳乳清中鑒定到C3的兩個上調(diào)糖基化位點(diǎn)，表明初乳的C3糖基化位點(diǎn)N-938和N-1649的修飾程度要高于常乳。同時，補(bǔ)體系統(tǒng)的激活不足與過度均可能造成有害影響，因此需要補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子對其進(jìn)行嚴(yán)格的調(diào)控[29]。本研究鑒定到與補(bǔ)體調(diào)節(jié)相關(guān)的補(bǔ)體因子H和I的1 個糖基化位點(diǎn)在牛初乳乳清中上調(diào)表達(dá)，因子B的1 個糖基化位點(diǎn)下調(diào)表達(dá)，這些差異表達(dá)糖蛋白反映了不同生長階段小牛對蛋白質(zhì)糖基化的不同需求，對于理解蛋白質(zhì)糖基化在小牛生長發(fā)育過程中起到的作用具有重要意義。

2.6 差異表達(dá)N-糖蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析

蛋白質(zhì)之間具有結(jié)合作用或相互作用是蛋白質(zhì)彼此間相互調(diào)節(jié)和介導(dǎo)以行使其功能的基礎(chǔ)。因此，對蛋白質(zhì)之間的相互作用及其互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究，對于揭示蛋白質(zhì)的功能并找到具有重要功能的蛋白質(zhì)具有重要意義。牛初乳和牛常乳129 個差異表達(dá)N-糖蛋白中有108 個N-糖蛋白在String數(shù)據(jù)庫中收錄，選取蛋白質(zhì)互作得分大于0.9的篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得到36 個差異表達(dá)糖蛋白（表1）的70 種相互作用（圖6）。其中，F(xiàn)5、SERPINA1、ALB、APOH、CLU、LGALS3BP和SERPINF2連接度較高，具有9～12 個互作蛋白，這些具有高連接度的蛋白很可能是影響整個系統(tǒng)代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵點(diǎn)，具有重要作用[30]。

表1 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的差異表達(dá)糖蛋白Table 1 Differentially expressed whey N-glycoproteins in proteinprotein interaction network

圖6 牛乳乳清差異N-糖蛋白的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 6 Protein-protein interaction network analysis of the differentially expressed whey N-glycoproteins in bovine milk

3 結(jié) 論

采用糖蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對不同泌乳期牛乳乳清N-糖蛋白的組成及其糖基化位點(diǎn)進(jìn)行鑒定和差異分析，發(fā)現(xiàn)與常乳相比，初乳含有更多的糖蛋白，而且一些蛋白含有更多的糖基化位點(diǎn)?；诜菢?biāo)記定量，在牛初乳和牛常乳中鑒定到129 個糖蛋白的190 個差異表達(dá)糖基化位點(diǎn)。生物信息學(xué)分析表明，不同泌乳期牛乳乳清差異表達(dá)N-糖蛋白與不同泌乳期人乳乳清差異表達(dá)N-糖蛋白的GO功能注釋和參與的KEGG代謝通路部分重疊，說明牛乳作為生產(chǎn)嬰幼兒配方乳的主要原料，其乳清差異表達(dá)糖蛋白的某些功能與人乳乳清是相似的，可以提供一些與免疫和生長發(fā)育相關(guān)的糖蛋白，并參與到補(bǔ)體與凝血級聯(lián)、吞噬作用和溶酶體等重要代謝通路中。本研究對蛋白質(zhì)糖基化進(jìn)行深入的研究，不僅豐富了乳N-糖蛋白質(zhì)組成及其糖基化位點(diǎn)的相關(guān)信息，還闡明了不同泌乳期牛乳乳清差異表達(dá)糖蛋白的功能，找到了一些具有重要功能的糖蛋白，這為評價和改善牛乳品質(zhì)、研發(fā)嬰幼兒配方乳中糖蛋白質(zhì)的改良及功能食品的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。