OPO乳脂粉對腸道微生物體外發(fā)酵的影響

侯愛香，成 煥，李宗軍,*，李 月

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128）

1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（1,3-dioleoyl-2-palmitoyl triglyceride，OPO）是棕櫚酸位于sn-2位、油酸位于sn-1,3位的三?；视王?。OPO是人乳脂和豬油的重要成分，也是添加在嬰幼兒配方奶粉中的營養(yǎng)補(bǔ)充劑。添加在嬰幼兒奶粉中的OPO是以植物油為原料，在脂肪酶催化作用下進(jìn)行酯交換，使sn-2位上的棕櫚酸含量達(dá)到40%以上，從脂肪酸組成和分布上接近母乳脂肪[1-3]的結(jié)構(gòu)脂。動物實(shí)驗(yàn)和臨床調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，OPO結(jié)構(gòu)脂的添加，可以減少嬰兒糞鈣流失，降低能量損失，激活免疫細(xì)胞，提高嬰幼兒的抵抗力[4-5]。因此，OPO作為一種有效的營養(yǎng)功能成分已被廣泛添加到嬰幼兒配方乳粉中[6]。通常，OPO以干法或濕法兩種形式添加到嬰幼兒配方奶粉中：一是用棕櫚油和酶作用制成富含OPO的植物乳脂油，濕法加入奶粉中；二是在富含OPO的植物乳脂油中加入乳糖等成分，經(jīng)乳化干燥，制成粉劑營養(yǎng)補(bǔ)充劑[7]，即富含OPO的植物乳脂粉，簡稱OPO乳脂粉，干法加入配方奶粉中。目前中國嬰幼兒配方奶粉中，很多采用干法加入的方式[8]。近年來，隨著學(xué)習(xí)壓力的增大，生活節(jié)奏的變快，電子產(chǎn)品的增多和戶外運(yùn)動量的減少，我國青少年身體素質(zhì)呈持續(xù)下降趨勢[9]。大學(xué)生是國家的人才后備主力，但很大一部分由于遠(yuǎn)離家庭監(jiān)管，飲食和作息不規(guī)律，學(xué)業(yè)競爭激烈，就業(yè)和深造壓力大，身體素質(zhì)也大不如前，現(xiàn)已經(jīng)引起社會的廣泛關(guān)注[10]。OPO乳脂粉作為嬰幼兒配方奶粉的營養(yǎng)補(bǔ)充劑，是否可用于青少年的膳食補(bǔ)充，也成為青少年?duì)I養(yǎng)食品開發(fā)需要關(guān)注的新問題。

研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物與人類健康密切相關(guān)，它在人體疾病發(fā)生、免疫調(diào)控、膳食因子互作等方面都起著至關(guān)重要的作用[11-14]。近年來有大量研究從腸道微生物和代謝組角度關(guān)注食品添加劑、食品乳化劑、益生元、功能性成分、微量元素、多酚類化合物等膳食因子對機(jī)體的影響[15-17]。腸道微生物與膳食因子互作已成為人類闡釋膳食因子調(diào)控健康研究的熱點(diǎn)和著眼點(diǎn)。OPO乳脂粉與人體腸道微生物的互作效應(yīng)也成了闡釋OPO乳脂粉營養(yǎng)機(jī)制的有效途徑。同時，研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物體外厭氧發(fā)酵和腸道內(nèi)發(fā)酵在細(xì)菌數(shù)量、組成、多樣性和代謝產(chǎn)物等方面都相似，體外厭氧發(fā)酵模型已被越來越多研究者采納[18-19]。周笑犁等[20]通過體外發(fā)酵模式，研究發(fā)現(xiàn)大豆寡糖提高了發(fā)酵液微生物的多樣性。謝旻皓等[21]通過體外發(fā)酵模式，發(fā)現(xiàn)苦丁茶冬青苦丁茶及3,5-diCQA具有一定的調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的作用。Guergoletto等[22]利用體外發(fā)酵模型探討了Euterpe edulis的體外發(fā)酵特性。因此，OPO乳脂粉與腸道微生物的互作研究也可以嘗試采用體外發(fā)酵模式來實(shí)現(xiàn)。

目前，OPO乳脂粉的應(yīng)用范圍相對較小，主要集中在嬰幼兒奶粉中，為進(jìn)一步發(fā)揮OPO乳脂粉的營養(yǎng)作用，拓寬應(yīng)用范圍，強(qiáng)健青少年體魄，本研究以富含OPO的植物乳脂粉為原料，以健康普通大學(xué)生的新鮮糞便為菌源，采用體外厭氧發(fā)酵模式，研究不同含量OPO的添加在不同發(fā)酵階段對pH值、微生物結(jié)構(gòu)數(shù)量及代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的影響，為OPO乳脂粉產(chǎn)品在青少年食品中的推廣應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為大學(xué)生營養(yǎng)食品的開發(fā)提供前期研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OPO乳脂粉：含有50%植物精煉油（精煉油為含40%OPO的棕櫚油）、41.63%乳糖、4.21%蛋白質(zhì)、3.72%水，穩(wěn)定劑、乳化劑、維生素、和礦物質(zhì)等成分合計為0.44%，由中國無錫某食品添加劑公司提供。

糞便樣品：20～22 歲3 名健康女大學(xué)生志愿者的新鮮糞便，所選志愿者飲食正常，兩個月內(nèi)未服用或注射過抗生素、未患腹瀉及腸炎等疾病，且采樣時未在生理期。

含氮基礎(chǔ)發(fā)酵液：1 L純凈水，酵母粉2 g，蛋白胨2 g，NaHCO32 g，L-半胱氨酸0.5 g，膽汁酸鹽0.5 g，吐溫-80 2 mL，NaCl 0.l g，氯化血紅素0.05 g，K2HPO40.04 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，CaCl2·7H2O 0.01 g，VK 10 μL，0.025 g/100 mL刃天青4 mL。

選擇性培養(yǎng)基：Wilkins and Chalgren瓊脂用于計數(shù)總厭氧菌[23]；BBL培養(yǎng)基用于計數(shù)雙歧桿菌[24]；Rogosa培養(yǎng)基用于計數(shù)乳酸桿菌[25]；Sulfite-polymyxin-milk瓊脂用于計數(shù)梭狀芽孢桿菌[26]；擬桿菌礦物鹽瓊脂用于計數(shù)擬桿菌[27]；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂用于計數(shù)腸桿菌科菌[28]；營養(yǎng)瓊脂用于計數(shù)總需氧菌[29]。培養(yǎng)基均購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

酵母粉、蛋白胨、L-半胱氨酸、膽汁酸鹽、吐溫-80 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaHCO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·7H2O 成都市科龍化工試劑廠；氯化血紅素、刃天青、VK 天津市密歐化學(xué)試劑有限公司；除特殊規(guī)定外，本研究所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-8電熱恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；TP-213分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SP500高壓蒸氣滅菌鍋 日本Yamato公司；SW-CJ-2D超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；YQX-I厭氧培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SPX-250B-Z恒溫生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TG16-WS高速臺式離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；C-43圓底立式培養(yǎng)袋、C-1厭氧產(chǎn)氣袋 日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社；7890A氣相色譜儀美國安捷倫科技有限公司；Testo205 pH計 德國Testo AG集團(tuán)；旋渦振蕩器 邁菱貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糞便處理

糞便取樣器、壓舌板、一次性手套、鑷子、牛皮紙、自封袋、EP管離心管、試劑瓶等采樣工具提前滅菌，部分塑料取樣用具再用DEPC水浸泡24 h以上；采集每位志愿者的新鮮糞便10 g，在厭氧操作箱中將3 名志愿者的糞樣混勻，取混合糞樣10 g加入到100 mL無菌的稀釋液中按1∶10稀釋，加幾粒無菌玻璃珠渦旋，使糞便充分分散。稀釋的糞液用4 層無菌紗布過濾取濾液為菌源液，所有新鮮糞便樣品的采集和處理需在1 h內(nèi)完成。

1.3.2 OPO厭氧發(fā)酵

參考Li Yanqi[30]和Zhang Xin[31]等體外發(fā)酵研究方法進(jìn)行改進(jìn)，用于OPO對人體腸道微生物的影響研究。37 ℃條件下，模擬人體腸道環(huán)境，配制發(fā)酵液，加入菌源靜態(tài)厭氧發(fā)酵24 h，檢測各發(fā)酵階段（0、4、8、12、24 h）短鏈脂肪酸、pH值、微生物指標(biāo)等。

將菌源液按接種量10%分別加入空白組和實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵液中。以含氮基礎(chǔ)發(fā)酵液為空白組。由于目前沒有成人食用OPO的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，借鑒參照GB 14880—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[32]，嬰幼兒配方奶粉OPO添加量為24～96 g/kg的要求，選擇上限96 g/kg、下限24 g/kg和中間值50 g/kg OPO含量為實(shí)驗(yàn)組梯度，分別在含氮基礎(chǔ)發(fā)酵液中加入不同量OPO乳脂粉達(dá)到3 個OPO含量梯度，再結(jié)合沖泡奶粉時一般奶粉與水稀釋比為4.5 g/30 mL，發(fā)酵液中折算成OPO質(zhì)量濃度分別為0.36、0.75、1.44 g/100 mL。將空白組和各實(shí)驗(yàn)組分別分裝在Hungate厭氧滾管，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)發(fā)酵，所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.3 pH值的測定

本研究采用pH計對發(fā)酵液進(jìn)行pH值的測定。厭氧箱內(nèi)把探頭插入裝有發(fā)酵液的厭氧滾管中，顯示所測溫度和pH值，讀數(shù)每秒更新2 次，AUTO HOLD閃爍直到點(diǎn)亮，讀數(shù)固定后記錄，即為所測樣液pH值，重復(fù)3 次。

1.3.4 短鏈脂肪酸的檢測

1.3.4.1 氣相色譜條件

HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度200 ℃；氫火焰離子檢測器，溫度220 ℃；載氣N2，流速1 mL/min，分流比40∶1；燃?xì)釮2，流速30 mL/min；助燃?xì)饪諝猓魉?00 mL/min；隔墊掃吹為3 mL/min；進(jìn)樣體積1 μL；柱箱升溫程序：初始溫度30 ℃，保持3.5 min，以5 ℃/min升溫至40 ℃，再以15 ℃/min升溫至150 ℃。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將6 種短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品分別配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（10～60 mmol/L），氣相色譜分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3 倍的信噪比計算6 種短鏈脂肪酸的檢出限。

1.3.4.3 樣品前處理

從－80 ℃冰箱取出發(fā)酵液解凍，后轉(zhuǎn)移至潔凈離心管中，10 000 r/min離心20 min，除去其他微粒及菌體，取清液，以25%偏磷酸-清液9∶1比例加入25%偏磷酸，反應(yīng)30 min，經(jīng)0.22 μm膜過濾后測定。短鏈脂肪酸的檢測在中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所完成。

1.3.5 微生物檢測計數(shù)

參考趙蘭濤[33]和Palframan等[34]所用的計數(shù)方法，用10 倍梯度稀釋法（稀釋液為0.85%生理鹽水），選取合適梯度稀釋液100 μL均勻涂布于7 種選擇性培養(yǎng)基上，從取樣至涂布結(jié)束在2 h內(nèi)完成。涂布后乳酸桿菌、腸桿菌和總需氧菌在37 ℃需氧培養(yǎng)24～48 h后分別計數(shù)，而總厭氧菌、擬桿菌、雙歧桿菌和梭狀芽孢桿菌在37 ℃厭氧培養(yǎng)48～96 h分別計數(shù)。

1.3.6 益生元指數(shù)計算

益生元指數(shù)是評價腸道菌群是否正常、平衡的一個重要指標(biāo)，其中Palframan等[34]采用的計算方法為眾多研究者所采納。該指數(shù)用來衡量體外模型中低聚果糖益生元作用，由此避免因取樣接種不均衡、初始菌數(shù)量和總菌數(shù)量不一致所導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。Palframan通過比較益生元指數(shù)的大小，定量描述各類低聚糖的益生元作用。本研究借鑒使用益生元指數(shù)，用以評價不同濃度OPO乳脂粉的益生作用。計算公式如下：

益生元指數(shù)=Bif/Total－Bac/Total＋Lac/Total－Clos/Total

式中：Total表示取樣時發(fā)酵液中總腸道菌數(shù)量和接種時發(fā)酵液中其數(shù)量的比值；Bif表示取樣時發(fā)酵液中雙歧桿菌數(shù)量和接種時發(fā)酵液中其數(shù)量的比值；Lac表示取樣時發(fā)酵液中乳酸桿菌數(shù)量和接種時發(fā)酵液中其數(shù)量的比值；Bac表示取樣時發(fā)酵液中擬桿菌數(shù)量和接種時發(fā)酵液中其數(shù)量的比值；Clos表示取樣時發(fā)酵液中梭狀芽孢桿菌數(shù)量和接種時發(fā)酵液中其數(shù)量的比值。

1.3.7 B/E（Bifidobacterium/Enterobacter）值的計算

在上個世界70年代，Van Der Waaij等[35]就將B/E值作為腸道菌群定植抗力的指標(biāo)，反映腸道菌群結(jié)構(gòu)，其為腸道內(nèi)雙歧桿菌和腸桿菌數(shù)量的比值。B/E＞1表示腸道菌群中雙歧桿菌的水平高于腸桿菌科的水平，可改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，有利腸道有益菌定植；B/E＜1表示腸道菌群中雙歧桿菌的水平低于腸桿菌科的水平，沒有特殊的改善腸道菌群作用。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本研究實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以 ±s表示；并運(yùn)用SPSS 21.0軟件的單因素分析方法（ANOVA）進(jìn)行顯著性分析；通過OriginPro 8.1軟件完成數(shù)據(jù)折線圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中pH值的變化

pH值反映微生物生境酸堿度，腸道微生物通過代謝營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生有機(jī)酸、短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物，會改變腸道生境的酸堿度，添加OPO乳脂粉發(fā)酵液pH值測定結(jié)果如表1所示。

表1 發(fā)酵液樣品pH值Table 1 pH values of fermented liquid samples

由表1可知，實(shí)驗(yàn)組pH值都隨著發(fā)酵時間的延長而降低，且添加量越高，其pH值下降幅度越大；空白組pH值也呈下降趨勢，但通過24 h 的體外發(fā)酵總體下降僅0.2左右，下降幅度不大。所有實(shí)驗(yàn)組和空白組的起始pH值幾乎一致，說明沒有通過腸道微生物的發(fā)酵，只添加OPO乳脂粉不會引起生境pH值的改變。實(shí)驗(yàn)組pH值在發(fā)酵的前8 h階段大幅度下降，而8 h以后，所有實(shí)驗(yàn)組的酸堿度下降幅度不大，趨于平穩(wěn)。推測在分批培養(yǎng)的密閉厭氧發(fā)酵過程中，前8 h階段，腸道微生物快速生長，積累大量有機(jī)酸、短鏈脂肪酸類代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致發(fā)酵體系的pH值快速下降；而發(fā)酵后期營養(yǎng)物質(zhì)開始缺乏，部分有機(jī)酸、短鏈脂肪酸作為能量或碳源不斷被消耗，使發(fā)酵后期pH值下降幅度不大，此外發(fā)酵后期營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，微生物生長代謝緩慢也使發(fā)酵體系后期的pH值保持相對較低水平，變化波動不明顯。因此，OPO乳脂粉能迅速降低腸道菌群生境中的pH值，促進(jìn)腸道菌群生長，使其產(chǎn)生酸性物質(zhì)，從而使體外發(fā)酵環(huán)境保持酸性。

2.2 發(fā)酵過程中短鏈脂肪酸的變化

以外標(biāo)法定量，分析樣品中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸的含量。6 種酸都可以被色譜柱有效分離，標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖如圖1所示，其保留時間分別為10.852、11.437、11.618、12.039、12.314 min和12.794 min，各短鏈脂肪酸區(qū)分清楚，該方法可以用于樣品檢測。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品氣相色譜圖Fig. 1 GC chromatograms of short-chain fatty acid standards

表2 各發(fā)酵體系不同發(fā)酵時間短鏈脂肪酸質(zhì)量濃度Table 2 Concentrations of SCFAs produced at different time points of fermentation in the presence of different concentrations of OPO μg/mL

由表2可以看出，24 h體外發(fā)酵過程中總短鏈脂肪酸的含量都隨時間的延長而持續(xù)增加?？瞻捉M的總短鏈脂肪酸增速平穩(wěn)，增加幅度不大，初始含量從僅（99.55±0.68）μg/mL增長到（398.67±1.04）μg/mL。3 個實(shí)驗(yàn)組在發(fā)酵過程中總短鏈脂肪酸含量均呈大幅度增加，且OPO含量越大，增幅越大，在發(fā)酵體系中的含量越多。整個發(fā)酵過程的24 h內(nèi)，96 g/kg組，總短鏈脂肪酸由初始（271.70±0.72）μg/mL增加到（4 869.49±4.30）μg/mL；50 g/kg組，總短鏈脂肪酸由初始（192.15±1.18）μg/mL增長到（4 024.62±4.97）μg/mL；24 g/kg組，總短鏈脂肪酸由初始（152.50±0.82）μg/mL增長到（2 744.25±4.29）μg/mL。由以上數(shù)據(jù)比較可以看出，OPO乳脂粉的添加，可以大幅度增加腸道微生物生境中總短鏈脂肪酸的含量，且短鏈脂肪酸含量與OPO含量呈正相關(guān)。

由表2可知，體外發(fā)酵過程中6 種短鏈脂肪酸，乙酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他短鏈脂肪酸，其次是丙酸含量，之后是丁酸含量，還含有少量的戊酸，而異丁酸和異戊酸質(zhì)量濃度最低均在10 μg/mL以下。由于乙酸是本研究中腸道微生物代謝產(chǎn)生的最主要的短鏈脂肪酸，其在體外發(fā)酵過程中的變化規(guī)律與總短鏈脂肪酸一致，OPO乳脂粉的添加可以大幅度增加腸道微生物生境中的乙酸含量，增加幅度與添加量呈正比。丙酸含量明顯低于乙酸，但高于其他4 種短鏈脂肪酸。空白組隨著發(fā)酵時間的延長，丙酸含量不斷增加，發(fā)酵結(jié)束時的丙酸含量達(dá)到最高（95.42±0.06）μg/mL。實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵結(jié)束時的丙酸質(zhì)量濃度都只略大于初始質(zhì)量濃度，但OPO的添加對丙酸含量的影響沒有統(tǒng)一的變化規(guī)律，96 g/kg組和50 g/kg組在均在4 h階段達(dá)到最大，隨后下降，且96 g/kg組的下降幅度大于50 g/kg組；24 g/kg組呈曲折上升趨勢，分別在0～4、8～12 h兩個階段呈上升趨勢，在4～8、12～24 h兩個階段呈下降趨勢。丁酸質(zhì)量濃度在空白組發(fā)酵過程中變化很小，下降幅度不到2 μg/mL；實(shí)驗(yàn)組均呈整體上升趨勢，即96 g/kg組和50 g/kg組先呈大幅度上升后略微下降，均在發(fā)酵12 h階段達(dá)到最大值；24 g/kg組則在發(fā)酵全過程呈穩(wěn)定上升趨勢，上升幅度略小于另外兩組，實(shí)驗(yàn)組中丁酸含量和上升幅度均與OPO含量呈正比。戊酸質(zhì)量濃度空白組整個發(fā)酵過程都在1 μg/mL以下，含量極為微小；實(shí)驗(yàn)組沒有明顯的一致規(guī)律，24 g/kg組呈曲折上升趨勢，上升幅度不大，由初始的（4.81±0.01）μg/mL上升到（9.09±0.04）μg/mL；96 g/kg組和50 g/kg組在發(fā)酵結(jié)束時的戊酸質(zhì)量濃度都略低于初始質(zhì)量濃度，均在0～8 h階段呈上升趨勢，12～24 h階段明顯下降。異丁酸含量占比很小，空白組呈上升趨勢，實(shí)驗(yàn)組均在0～4 h階段迅速降到1 μg/mL左右，之后變化不大。異戊酸含量占總短鏈脂肪酸含量的比例很小，空白組和實(shí)驗(yàn)組均較初始質(zhì)量濃度有所增加。

綜上所述，OPO乳脂粉體外發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸以乙酸、丙酸和丁酸為主，且OPO乳脂粉的添加能顯著提高發(fā)酵體系中總短鏈脂肪酸、乙酸和丁酸的含量。

2.3 體外發(fā)酵過程中微生物變化

2.3.1 體外發(fā)酵過程中微生物數(shù)量變化

根據(jù)益生元指數(shù)和B/E值的計算公式，采用傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)基，對涉及的腸道微生物進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)，即體外發(fā)酵過程中的總厭氧菌、總需氧菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、腸桿菌和梭狀芽孢桿菌，它們的數(shù)量變化規(guī)律如圖2所示。

由圖2可知，空白組中，在體外發(fā)酵過程中雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌和梭狀芽孢桿菌數(shù)量相當(dāng)，都在107數(shù)量級上，而擬桿菌相對少了其他菌1 個數(shù)量級。添加OPO乳脂粉的實(shí)驗(yàn)組，雙歧桿菌和乳酸菌成為發(fā)酵過程中最主要的優(yōu)勢菌，它們的數(shù)量在總菌數(shù)中占比相對較大。

圖2 體外發(fā)酵過程中腸道微生物數(shù)量變化Fig. 2 Variation in intestinal microflora quantities during in vitro fermentation

傳統(tǒng)計數(shù)方法得出，實(shí)驗(yàn)組的總厭氧菌數(shù)和總需氧菌數(shù)都高于空白組，說明OPO乳脂粉的添加總體上促進(jìn)了腸道微生物的生長繁殖?？瞻捉M和實(shí)驗(yàn)組的總厭氧菌在體外發(fā)酵過程中均呈上升趨勢，其中OPO含量50 g/kg組上升幅度最大，菌數(shù)最多?？瞻捉M和實(shí)驗(yàn)組的總需氧菌均呈先上升后下降趨勢，都在8 h階段達(dá)到最大值，但空白組發(fā)酵結(jié)束時的菌數(shù)小于初始菌數(shù)，實(shí)驗(yàn)組的均高于初始菌數(shù)，最終以24 g/kg組的（8.19±0.07）（lg（CFU/mL））最大?？瞻捉M和實(shí)驗(yàn)組的雙歧桿菌均呈先上升后下降趨勢，都在8 h階段達(dá)到最大值，且實(shí)驗(yàn)組均高于空白組，8 h階段，96 g/kg組雙歧桿菌數(shù)最多，達(dá)（8.88±0.01）（lg（CFU/mL））；24 h結(jié)束時，50 g/kg組雙歧桿菌數(shù)最多，達(dá)（7.94±0.00）（lg（CFU/mL））。乳酸桿菌，空白組呈持續(xù)下降趨勢，而所有實(shí)驗(yàn)組均呈持續(xù)上升趨勢，且50 g/kg組上升幅度最大，菌數(shù)最多，達(dá)到（8.09±0.03）（lg（CFU/mL））。腸桿菌，在空白組中呈明顯持續(xù)上升趨勢，而在所有實(shí)驗(yàn)組中呈現(xiàn)持續(xù)大幅度下降趨勢，且實(shí)驗(yàn)組腸桿菌數(shù)遠(yuǎn)小于空白組。擬桿菌，所有實(shí)驗(yàn)組數(shù)量均少于空白組，實(shí)驗(yàn)組和空白組均呈先上升后下降趨勢，均在發(fā)酵4 h階段達(dá)到最大值，發(fā)酵結(jié)束時的菌數(shù)均少于初始菌數(shù)。梭狀芽孢桿菌，空白組呈緩慢持續(xù)上升趨勢，實(shí)驗(yàn)組均是先下降后上升，其中96 g/kg組上升幅度較大，其次為空白組，24 g/kg組和50 g/kg組低于空白組，說明這兩個OPO添加量可以減緩梭狀芽孢桿菌的增長速度，但96 g/kg組只在發(fā)酵前4 h表現(xiàn)出抑制作用。

綜上所述，OPO乳脂粉的添加可以明顯增加體外厭氧發(fā)酵體系中總厭氧菌、總需氧菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量，大幅度減少腸桿菌的數(shù)量，還能在一定程度上減少擬桿菌和梭狀芽孢桿菌的數(shù)量，調(diào)節(jié)了腸道菌群的結(jié)構(gòu)。

2.3.2 益生元指數(shù)變化

圖3 體外發(fā)酵過程的益生元指數(shù)變化Fig. 3 Variation in PI during in vitro fermentation

以總厭氧菌和總需氧菌之和計算總菌數(shù)。將圖2數(shù)據(jù)帶入益生元指數(shù)計算公式，將計算結(jié)果作成直觀的折線圖，如圖3所示。如圖3所示，空白組和實(shí)驗(yàn)組的益生元指數(shù)都呈先上升后下降趨勢，均在8 h階段達(dá)到最大值。但空白組益生元指數(shù)在體外發(fā)酵過程的各個時間段均為負(fù)值，所有實(shí)驗(yàn)組的益生元指數(shù)在各個時間段均為正值，說明3 個不同含量OPO乳脂粉的添加，都在體外發(fā)酵系統(tǒng)中表現(xiàn)出益生作用，且益生元指數(shù)最高的一組為50 g/kg組，以此評判該組益生效果最好。這結(jié)果與微生物計數(shù)中雙歧桿菌數(shù)和乳酸桿菌數(shù)的結(jié)果類似，它們與OPO乳脂粉的添加量不成嚴(yán)格的正比關(guān)系。

2.3.3 B/E值變化

表3 體外發(fā)酵過程的B/E值的變化Table 3 Variation in B/E ratio during in vitro fermentation

由表3可知，空白組的B/E值只有在發(fā)酵8 h階段略大于1，雙歧桿菌水平略高于腸桿菌水平，其他發(fā)酵時間均小于1，說明沒有添加OPO乳脂粉的基礎(chǔ)發(fā)酵液體系中雙歧桿菌沒能形成優(yōu)勢菌。由表3發(fā)現(xiàn)，所有實(shí)驗(yàn)組的B/E值在同一發(fā)酵時間均大于空白組，說明3 個添加量OPO乳脂粉均能夠改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。同時，空白組在發(fā)酵8 h時B/E值最大，而實(shí)驗(yàn)組均在發(fā)酵12 h時達(dá)到最大，推測OPO乳脂粉的添加能夠促進(jìn)雙歧桿菌對數(shù)生長期和穩(wěn)定期的延長。在所有實(shí)驗(yàn)組中，只有0 h的B/E值小于1，其他發(fā)酵時間段均大于1，說明糞便樣品作為菌源，雙歧桿菌沒有在菌源中占據(jù)優(yōu)勢地位，這與多數(shù)研究成人糞便的結(jié)果一致[22]。但隨著OPO乳脂粉的添加，發(fā)酵時間的延續(xù)，雙歧桿菌逐漸在實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵體系中積累增多，且在4～12 h階段，B/E值與OPO含量呈正比，90 g/kg組的B/E值最大，顯示出明顯的改善腸道菌群的作用。隨后，在發(fā)酵結(jié)束的24 h階段，發(fā)現(xiàn)50 g/kg組的B/E值最大。

3 討論與結(jié)論

通過體外厭氧發(fā)酵，本研究中腸道微生物所產(chǎn)的短鏈脂肪酸最主要是乙酸、丙酸和丁酸，蛋白分解所產(chǎn)的異丁酸、戊酸和異戊酸含量很少，這與眾多國內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果一致[36-37]。其中乙酸含量最多，它是多數(shù)細(xì)菌的主要代謝產(chǎn)物，本研究中所檢測的擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌和梭狀芽孢桿菌等碳水化合物代謝菌都產(chǎn)生乙酸，且本研究實(shí)驗(yàn)組中雙歧桿菌是優(yōu)勢微生物，因此發(fā)酵液中乙酸含量相對最大，其主要在肌肉、心臟、肝臟和腦內(nèi)代謝，其是膽固醇合成的最主要底物，大部分被吸收，進(jìn)入血液或進(jìn)入肝臟代謝，能作為周邊組織的能源[38]。丙酸主要為擬桿菌等菌群的代謝產(chǎn)物，進(jìn)入血液，吸收后在肝臟中分解代謝，參與丙酮酸逆轉(zhuǎn)化葡萄糖的過程，同時可能抑制脂肪的合成過程。丁酸主要為厚壁菌門的代謝產(chǎn)物，被譽(yù)為最重要短鏈脂肪酸之一，血液中能夠吸收，但主要被上皮細(xì)胞利用，是上皮細(xì)胞的主要能量來源，目前丁酸被充分證實(shí)的還有抗炎癥、抗癌變效果，基于丁酸在維持腸道健康過程中所起的作用，甚至有研究者認(rèn)為新型益生元的設(shè)計要尋找可以提高丁酸產(chǎn)量的營養(yǎng)物質(zhì)。而本研究所添加的營養(yǎng)物質(zhì)OPO乳脂粉，不僅能顯著提高短鏈脂肪酸總量，還能提高大幅度提高乙酸和丁酸含量，OPO或OPO乳脂粉的營養(yǎng)功效可能與其代謝產(chǎn)物丁酸、乙酸的增加密切相關(guān)，同時這些代謝產(chǎn)物也可能對腸道微生物起到調(diào)節(jié)作用。

關(guān)于OPO、OPO乳脂粉與腸道微生物互作的研究相對較少，發(fā)現(xiàn)腸道微生物體外發(fā)酵OPO乳脂粉的結(jié)果與梁效[39]采用體外模式研究肉桂精油對大鼠腸道微生物影響的結(jié)果有一定相似性。兩種不同的含有三甘酯的物質(zhì)體外發(fā)酵，都對腸桿菌、擬桿菌的抑制作用明顯，對梭狀芽孢桿菌有一定的抑制作用，能使乳桿菌成為主要的優(yōu)勢菌群；但肉桂精油對雙歧桿菌有一定的抑制作用，OPO乳脂粉則能促進(jìn)雙歧桿菌的生長，這可能與OPO乳脂粉中含有大量的乳糖有關(guān)。要進(jìn)一步探明OPO的營養(yǎng)機(jī)制，后續(xù)還需要用OPO結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品與其他普通三甘酯進(jìn)行對照研究。

短鏈脂肪酸含量與腸道微生物的數(shù)量結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，腸道微生物是維系人體內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，OPO乳脂粉的添加，大幅度促進(jìn)雙歧桿菌及乳桿菌等有益菌增長，迅速降低發(fā)酵液中的pH值，有效抑制腸桿菌、擬桿菌的增長，明顯增加了益生元指數(shù)和B/E值，在腸道微生物的調(diào)控中，所添加的OPO乳脂粉發(fā)揮了積極作用。但通過益生元指數(shù)和雙歧桿菌、乳酸桿菌的增長情況，發(fā)現(xiàn)國標(biāo)范圍內(nèi)，中劑量的50 g/kg組益生效率更高。但由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法本身的局限，糞便中還存在大量未被培養(yǎng)的腸道微生物，且傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)操作繁瑣，工作量大，培養(yǎng)效率和精準(zhǔn)性都有待提高，同時，OPO乳脂粉對腸道微生物多樣性的影響作用無法體現(xiàn)，后續(xù)還可進(jìn)一步通過MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序來探究OPO、OPO乳脂粉對腸道微生物的影響。