混合菌株和外源賴氨酸對魚醬發(fā)酵品質的影響

鄭志穎，周 晶，袁 麗，高瑞昌*

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

鮰魚原產(chǎn)于北美洲，我國于1984年引入，目前已推廣至全國多個省市，成為重要的特色淡水魚類之一[1]。鮰魚肉質較鮮美、營養(yǎng)價值很豐富，養(yǎng)殖產(chǎn)量逐漸增加[2]。近年來，受美國鮰魚法案的影響，給養(yǎng)殖和加工業(yè)者帶來了很大的經(jīng)濟損失。鮰魚在加工中又存在脂肪含量高、土腥味大等技術難題[2]，因此開發(fā)適合國內(nèi)消費市場需求的鮰魚產(chǎn)品，對打開國內(nèi)鮰魚市場、推動鮰魚產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。目前，發(fā)酵水產(chǎn)品是市場上深受消費者喜愛的魚加工制品，市場前景較為廣闊。對下腳料進行開發(fā)、深加工，不僅是對資源的綜合利用，而且能夠保護環(huán)境，減少廢水、廢物排放，實現(xiàn)綠色發(fā)展。

中度嗜鹽菌是在NaCl濃度為0.5～2.5 mol/L之間生長最佳的一類微生物[3]。目前已在多種腌制或鹽漬類發(fā)酵海產(chǎn)品中鑒定出大量的中度嗜鹽菌，這些嗜鹽微生物不但能夠改善和提高食品風味，還能夠加快食品的生產(chǎn)效率，并且抑制某些腐敗細菌的生長。如Tetragenococcus菌株被用于食品如醬油等的發(fā)酵中，加快了醬油的發(fā)酵[4]。根據(jù)中度嗜鹽菌耐鹽及產(chǎn)蛋白酶的性質，可廣泛應用于發(fā)酵水產(chǎn)品中。如Udomsil等[5]利用1 株產(chǎn)蛋白酶中度嗜鹽菌Tetragenococcus halophilus MS33和從泰國魚露種篩出的產(chǎn)揮發(fā)性物質的Virgibacillus sp. SK37兩株菌來提高魚露的發(fā)酵品質。

賴氨酸是人類和哺乳動物的必需氨基酸之一，第一限制性氨基酸，機體不能自身合成，必須從食物中補充。賴氨酸作為甜味氨基酸，可在一定程度上提高發(fā)酵魚醬的風味。芮鴻飛[6]研究了外源氨基酸對黃酒發(fā)酵的影響，得出不同氨基酸對黃酒揮發(fā)性香氣有不同程度的影響。鮮有報道研究外源氨基酸對水產(chǎn)品發(fā)酵的影響。因此本研究以鮰魚副產(chǎn)物為原料，探究食鹽質量分數(shù)為15%條件下混合發(fā)酵劑（Halobacillus campisalis、Halobacillus faecis、Bacillus aquimaris、Bacillus hwajinpoensis）和外源賴氨酸對發(fā)酵魚醬品質的影響，開發(fā)出具有特色風味和功能性的發(fā)酵魚醬，增加淡水魚的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮰魚碎魚肉購于鎮(zhèn)江市京口區(qū)歐尚超市。從河北沿海地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵蝦醬中篩選出的中度嗜鹽菌（H.campisalis、H. faecis、B. aquimaris、B. hwajinpoensis）實驗室保存。

甲醛、氫氧化鈉、酚酞、乙醇、鄰苯二甲酸、硼酸、碳酸鉀、阿拉伯膠、甘油、甲基紅指示劑、亞甲基藍指示劑、賴氨酸、磺基水楊酸 國藥集團（上海）化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AG 22331離心機 德國艾本德股份公司；SW-CJ-1FD型單人單面超凈臺 上海蘇凈實業(yè)有限公司；HZQ-2全溫振蕩器 江蘇金怡儀器科技有限公司；LRH-250培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；HP6890/5973氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國Supelco公司；日立L-8900全自動氨基酸分析儀 日本高新技術公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學技術有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司；ZB-20型斬拌機 諸斌市嘉凱食品機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 碎魚肉前處理

鮰魚碎魚肉利用斬拌機斬斷，置于－20 ℃凍藏備用。

1.3.2 混合菌種發(fā)酵劑的制備

發(fā)酵菌種采用4 株中度嗜鹽菌混合菌種，將其分別接種在不同的培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，重復操作3 次。將培養(yǎng)的菌種菌液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，然后用無菌生理鹽水洗滌2 次，再懸浮于無菌生理鹽水中。最后將菌液濃度調(diào)整到105～106CFU/mL，將菌液于4 ℃保存，并于24 h內(nèi)使用。

1.3.3 發(fā)酵魚醬的制備

經(jīng)處理好的鮰魚副產(chǎn)物，分成4 種處理。第1組只添加15%食鹽，記為a組；第2組添加0.1%賴氨酸和15%食鹽，記為b組；第3組添加混合發(fā)酵劑和15%食鹽，記為c組；第4組添加混合發(fā)酵劑、0.1%賴氨酸和15%食鹽，記為d組。利用攪拌機分別將4 組中的鮰魚碎魚肉與所加物質（食鹽和賴氨酸）充分混合后，置于玻璃發(fā)酵瓶中，于4 ℃冰箱放置24 h用于發(fā)酵。發(fā)酵魚醬前，在c和d組中加入菌液，其添加量為105CFU/g，比例為1∶1∶1∶1。對照組加入同體積的生理鹽水。將處理好的玻璃發(fā)酵瓶置于37 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵60 d，即得發(fā)酵魚醬。在發(fā)酵過程中，每隔5 d對魚醬進行攪拌。每個處理3 個重復。

1.3.4 發(fā)酵魚醬品質的測定

1.3.4.1 pH值的測定

稱取5 g魚醬，加25 mL蒸餾水，高速均質1 min后，10 000 r/min離心15 min，測上清液的pH值，重復測定3 次。

1.3.4.2 總酸和氨基酸態(tài)氮的測定

參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》酸度計法[7]。

1.3.4.3 揮發(fā)性鹽基氮的測定

參照GB 5009.44—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》微量擴散法[8]。

1.3.4.4 游離氨基酸的測定

取5 g魚醬，加入20 mL 4%磺基水楊酸，高速均質，在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，上清液重復離心，再稀釋5 倍。過0.22 μm水系濾膜，取上清液上機測定。

1.3.4.5 揮發(fā)性風味物質的測定

揮發(fā)性風味成分的萃取：采用頂空固相微萃取的方法提取魚醬中的風味物質。取魚醬5 g，萃取溫度為60 ℃，萃取時間為30 min，將萃取頭插入氣相色譜進樣口于250 ℃解吸5 min。

氣相色譜-質譜測定：初溫40 ℃，保持4 min，然后以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持5 min，再以15 ℃/min升溫至240 ℃，保持10 min。進樣口溫度250 ℃，以氦氣為載體，不分流進樣，流速0.8 mL/min，進樣量20 μL。

質譜條件：電子電離源，溫度為200 ℃，四極桿溫度150 ℃，檢測器電壓350 V，發(fā)射電流200 μA，電離電壓70 eV，掃描范圍為30～500 u。

1.3.4.6 感官評定

采用定量描述性分析法。由10 人組成感官評定小組，評定前需對小組成員進行風味培訓。評分范圍0～9 分，分別對魚醬的魚味、腥味、發(fā)酵味、氨味、鮮味、咸味、甜味和苦澀味進行評分，分數(shù)越高，代表味道越濃烈。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Origin 8.0繪圖，SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。每組數(shù)據(jù)均為3 次重復的平均值。利用one-way ANOVA檢驗分析不同處理之間的差異顯著性，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 魚醬pH值和總酸含量變化

如圖1所示，4 種處理魚肉醬中的總酸含量分別為0.382 5%、0.63%、0.607 5%和0.585%，pH值分別為6.44、6.02、6.03和6.06。在發(fā)酵60 d時，總酸質量分數(shù)變化和pH值變化趨勢相一致，總酸質量分數(shù)越多，pH值相對越低。與未添加氨基酸和混合發(fā)酵劑的魚醬a相比，其他3 組魚醬的總酸質量分數(shù)顯著升高，pH值顯著降低（P＜0.05），說明添加氨基酸和混合發(fā)酵劑都能一定程度增加總酸質量分數(shù)?？偹岷蚿H值不同主要是由于發(fā)酵過程中氨基酸、有機酸和胺類化合物的產(chǎn)生不同[9]?？偹岬脑黾涌赡苡捎诎被岬募尤牒桶l(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸造成的。

2.2 魚醬的氨基酸態(tài)氮含量變化

圖2 發(fā)酵60 d不同處理魚醬的氨基態(tài)氮含量Fig. 2 Amino nitrogen contents in fish pastes

氨基酸態(tài)氮是發(fā)酵產(chǎn)品的重要指標之一，其能夠在一定程度上反映發(fā)酵產(chǎn)品的老化程度和風味特點[10-11]。如圖2所示，4 種處理魚肉醬中的氨基酸態(tài)氮質量分數(shù)分別為0.511%、0.549 5%、0.514 5%和0.549%。與魚醬a相比，添加混合發(fā)酵劑后，氨基酸態(tài)氮含量變化較?。≒＞0.05），可能由于混合發(fā)酵劑自身直接利用游離氨基酸態(tài)氮、小分子肽等作為營養(yǎng)物質，或者發(fā)生了一系列氨基酸等物質參與的復雜反應[12]。與未加賴氨酸的兩組魚醬（a、c）相比，添加賴氨酸酸的兩種魚醬（b、d）中的氨基酸態(tài)氮含量顯著上升（P＜0.05），其原因推測可能是外加賴氨酸的影響。4 種魚醬中的氨基酸態(tài)氮的含量均較高，均在一定程度上賦予魚醬良好風味的形成及較高的營養(yǎng)價值。

2.3 魚醬的揮發(fā)性鹽基氮含量變化

圖3 發(fā)酵60 d不同處理魚醬的揮發(fā)性鹽基氮含量Fig. 3 TVB-N contents in fish pastes

揮發(fā)性鹽基氮是指某些蛋白質及含氮物質被微生物分泌的蛋白酶降解或脫氨反應形成，其可以反映產(chǎn)品的腐敗程度[13-14]。從圖3可以看出，4 種處理的揮發(fā)性鹽基態(tài)氮的含量分別為37.8、30.1、23.45、24.2 mg/100 g。歐盟規(guī)定魚肉中的揮發(fā)性鹽基氮含量不得高于35 mg/100 g[15]?？梢姡刺砑影被岷突旌习l(fā)酵劑的魚醬a已經(jīng)開始腐敗，可能是某些細菌會利用游離氨基酸等含氮物質產(chǎn)

生了揮發(fā)性鹽基氮物質[16]。與魚醬a相比，魚醬b揮發(fā)性鹽基氮顯著下降（P＜0.05），推測原因可能是氨基酸的存在，發(fā)酵過程中產(chǎn)生了有機酸等物質，這與總酸的結果相一致。c和d兩種魚醬的揮發(fā)性鹽基氮顯著降低（P＜0.05），推測可能是混合發(fā)酵劑的加入，抑制了這類細菌腐敗微生物的生長從而降低了揮發(fā)性鹽基態(tài)氮的生成。也可能是總酸的含量增加，發(fā)生了酸堿中和。

2.4 魚醬的游離氨基酸變化

表1 發(fā)酵60 d不同處理魚醬的游離氨基酸種類及含量Table 1 Free amino acid composition in fish pastes

氨基酸對發(fā)酵水產(chǎn)品的風味有重要貢獻，是發(fā)酵水產(chǎn)品香味的重要前體物質。發(fā)酵產(chǎn)品的風味與呈味活性物質的相互作用和平衡有關[17-18]。由表1可知，與魚醬a相比，其他3 種魚醬中，游離氨基酸總量、鮮味氨基酸含量、甜味氨基酸含量和苦味氨基酸含量均增加。與魚醬a比，添加混合發(fā)酵劑后的魚醬c中，天冬氨酸含量增加了9.7 倍，谷氨酸的含量也顯著增加。該結果也與氨基酸態(tài)氮的結果一致。由此可見經(jīng)混合發(fā)酵劑發(fā)酵后，混合發(fā)酵劑產(chǎn)生的外源蛋白酶促進了魚肉蛋白質的水解，游離氨基酸含量顯著增加，改善了發(fā)酵魚醬風味。b和d兩種魚醬中，由于添加了0.1%賴氨酸，即魚醬中外源賴氨酸的含量為100 mg/100 g，這也解釋了b和d兩組魚醬中賴氨酸較多的原因。除去最初賴氨酸的量，4 種魚醬賴氨酸的含量并無顯著區(qū)別。與魚醬a相比，各種氨基酸均在一定程度上得到增加，尤其是谷氨酸的增加，表明氨基酸的加入能夠促進魚醬發(fā)酵，使其產(chǎn)生更多的游離氨基酸，其具體機理需要進一步研究。與魚醬b相比，魚醬c中的游離氨基酸的總量略有減少。賴氨酸本身的加入會增加魚醬中賴氨酸的測定含量，也可能是混合菌株利用某些氨基酸作為營養(yǎng)物質，以便更好地發(fā)酵，產(chǎn)生其他的風味物質。

綜上所述，魚醬添加賴氨酸和混合發(fā)酵劑經(jīng)發(fā)酵后，游離氨基酸含量及種類豐富，鮮味和甜味氨基酸的組成及其含量能反映魚醬的滋味鮮美程度，能夠增強食品的持續(xù)性、滿口性、特征風味和甜味等[19]。日常攝入這種發(fā)酵魚醬，還可彌補賴氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等氨基酸的不足。

2.5 魚醬的揮發(fā)性風味物質變化

圖4 發(fā)酵60 d魚醬揮發(fā)性風味成分的總離子流圖Fig. 4 Total ion chromatogram of volatile flavor components in fish pastes

表2 發(fā)酵60 d不同處理的魚醬的揮發(fā)性風味組成成分Table 2 Volatile flavor components identified in fish pastes

采用頂空固相微萃取法萃取魚醬中的揮發(fā)性成分，并經(jīng)氣相色譜-質譜檢測分析，發(fā)酵60 d鮰魚醬揮發(fā)性成分變化的總離子色譜流圖及分析結果見圖4，共檢測出37 種揮發(fā)性物質成分。各揮發(fā)性成分及其相對含量分析結果見表2。

2.5.1 酸類

酸類對魚醬中的酸味起著重要作用，發(fā)酵60 d 4 種魚醬中酸類相對含量分別為42.23%、63.65%、75.7%、50.7%。結果表明添加氨基酸和混合發(fā)酵劑明顯提高了酸類的相對含量，原因可能是微生物發(fā)酵過程中對氨基酸的降解和不飽和脂肪酸的氧化。其中，發(fā)酵鮰魚酸味主要來源于異戊酸、乙酸、異丁酸的增加，支鏈酸包括異戊酸和異丁酸，異戊酸的相對含量最多，推測認為其產(chǎn)生與氨基酸和微生物作用有關。直鏈脂肪酸包括乙酸、己酸和丙酸。乙酸的相對含量分別為6.92%、13.43%、9.12%、10.44%，乙酸具有酸味，乙酸主要由微生物發(fā)酵糖類或其他物質氧化產(chǎn)生。推測乙酸的增加與微生物發(fā)酵有關。己酸具有果香，己酸的增加加強了魚醬的果香。短鏈的脂肪酸對風味有很大的影響，具有較低的閾值，往往表現(xiàn)為強烈的奶酪味道[20]。酸類是發(fā)酵制品風味的主要特征風味，已有研究表明酸類來源于脂肪酸的氧化或微生物分解碳水化合物、對氨基酸的的發(fā)酵作用，尤其是那些耐鹽的微生物[21]。這也解釋了添加混合發(fā)酵劑后，酸類物質大幅上升的原因。孟凌玉[20]在蝦頭酶解發(fā)酵液中檢測到異戊酸的含量逐漸增加，推測其產(chǎn)生與微生物作用有關。張洵[22]在鰱魚發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)乙酸含量豐富，對發(fā)酵鰱魚風味有相對較大的貢獻。綜上所述，添加氨基酸和混合發(fā)酵劑均在一定程度上增加了酸類物質的產(chǎn)生，促進了鮰魚醬的發(fā)酵。

2.5.2 醇類

魚醬中醇類的種類相對較為豐富，醇類通常具有蘑菇香、芳香、植物香、酸敗和土氣味[20]，對魚醬的發(fā)酵有著重要作用，但醇類化合物的閾值較高，對整體風味貢獻較小。添加賴氨酸和混合發(fā)酵劑后，異戊醇相對含量分別從12.88%下降至1.25%、2.60%、1.5%。異戊醇的產(chǎn)生是一個典型的艾利希途徑，具有腐臭和辛辣的氣味[23-24]。異戊醇的大幅度降低避免了鮰魚醬腐臭味的產(chǎn)生。其原因可能是添加賴氨酸和混合發(fā)酵劑后，抑制了魚自身的一些腐敗微生物的生長，減少了異戊醇的產(chǎn)生，減少了酸敗味的產(chǎn)生。不飽和醇1-戊烯-3-醇相對含量從0.63%分別增加至1.13%、2.60%、1.50%；苯乙醇是醬油中的芳香影響化合物，在魚醬中主要提供麥芽香氣[25]?？梢?，除異戊醇變化明顯，其他醇類變化不大，又因為直鏈飽和醇的香味閾值較高，所以對魚醬發(fā)酵風味的影響較小。不飽和醇閾值較低，具有蘑菇香氣和類似的金屬味[26]，但含量較小，故對魚醬發(fā)酵風味影響較小。

2.5.3 酮類

酮類一般由美拉德反應生成，也可能是由于脂質降解、氧化或其進一步反應生成[27]。適量的酮類貢獻甜的花香和果香風味，但過量的酮類則會產(chǎn)生不良氣味。酮類的閾值相對較高，對魚肉的氣味貢獻相對較小[23]。酮類可增強腥味物質。添加賴氨酸和混合發(fā)酵劑后，甲基酮包括2-丁酮、2-庚酮變化微小，2-庚酮的閾值較低，提供了藍莓味，2-丁酮的閾值較高，風味貢獻還需進一步的研究。酮類大多數(shù)是甲基酮。除甲基酮，檢測的酮類還有丙酮、2,3-丁二酮和3-羥基-2-丁酮。丙酮的相對含量低于其閾值，對風味的影響較小。只在魚醬b中檢測到了2,3-丁二酮和3-羥基-2-丁酮，2,3-丁二酮有苯醌氣味，稀溶液有奶油香氣，其閾值較低，對魚醬發(fā)酵作用較大。3-羥基-2-丁酮有黃油的氣味，但閾值較高，故對魚醬發(fā)酵影響極小?？梢姡砑影被釋︳~醬中的某些酮類的產(chǎn)生有一定影響，而菌的加入對酮類物質的產(chǎn)生影響較小，原因可能是發(fā)酵過程中，由于微生物的作用，其轉變成了其他的風味物質，使得醛類物質降低。

2.5.4 醛類

揮發(fā)性醛類物質可以產(chǎn)生理想的風味，同樣也會給產(chǎn)品帶來酸敗風味。直鏈和支鏈醛一般會提供青草和辛辣味，而不飽和醛則產(chǎn)生蔬菜和魚腥味。醛類的相對含量并沒有發(fā)生明顯變化，直鏈的脂肪醛包括壬醛和己醛，只在魚醬a中檢測到，相對含量分別為0.66%、0.71%，直鏈醛能夠產(chǎn)生香草、青草和辛辣的味道，但其相對含量較低，故對發(fā)酵魚醬風味影響極小。支鏈醛包括異戊醛，相對含量分別為0.55%、0.46%、0.43%，在魚醬d中沒有檢測出異戊醛。可見，添加氨基酸和混合發(fā)酵劑對醛類幾乎無影響，可能是由于氨基酸和混合發(fā)酵劑的存在，更多地轉化成了其他的風味物質。

2.5.5 酯類

酯類化合物是一種良好的風味物質，低含量的酯類物質能夠產(chǎn)生明顯的香氣。添加氨基酸和混合發(fā)酵劑后，酯類的相對含量從0.63%分別增加至3.82%、1.36%、2.59%。主要為異丁酸乙酯、亞砷酸三酯等。異丁酸乙酯具有水果香氣，能夠賦予魚醬一定的風味。結果表明添加氨基酸和混合發(fā)酵劑有助于酯類物質的產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)酯類在許多發(fā)酵的水產(chǎn)制品中檢出[28]。揮發(fā)性酯類主要是由各種醇和羧酸的酯化作用形成的。酯類能夠賦予發(fā)酵水產(chǎn)品果香甜香。

2.5.6 其他風味化合物

含氮化合物是最具風味的主要成分之一。魚醬a和b中檢測到了2,5-二甲基吡嗪，含量分別為1.88%、1.56%；吡嗪化合物的風味閾值較低，是許多熱加工食品中的重要性揮發(fā)性成分，賦予了食品濃郁的堅果香和烤肉香[29]。烴類化合物閾值較高，故對魚肉發(fā)酵風味影響不大[30]。魚醬d中檢測出了2-正戊基呋喃，相對含量為0.66%，具有豆香、果香、泥土、青香及類似蔬菜的香韻[31]。除此之外，其他化合物如酚類，2,6-二叔丁基對甲酚雖然含量較低，但對魚醬的風味形成也有一定的貢獻。

2.6 感官評定及定量描述性分析

圖5 發(fā)酵60 d不同處理魚醬的風味定量描述性分析圖Fig. 5 Quantitative descriptive analysis (QDA) of flavor characteristics of fish pastes

通過對4 種處理魚醬進行感官評分，由圖5可知，4 種魚醬中，與未添加混合發(fā)酵劑和外源賴氨酸的魚醬a相比，其他3 組魚醬鮮味均較高，腥味較低，發(fā)酵味較高。風味較好，添加混合發(fā)酵劑和賴氨酸能夠改善魚醬的發(fā)酵風味，賦予魚醬良好風味。

3 結 論

魚醬作為一種發(fā)酵調(diào)味品，其具有廣泛的消費市場，通過發(fā)酵改善了魚醬的營養(yǎng)價值和風味。通過測定pH值、總酸、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性鹽基氮，得到添加混合發(fā)酵劑和外源賴氨酸能夠提高總酸和氨基酸態(tài)氮，降低揮發(fā)性鹽基氮含量，在一定程度上抑制某些腐敗菌的生長，提高了魚醬的營養(yǎng)價值。通過結合感官評定、氣相色譜-質譜對魚醬進行風味評價，可以有效檢測混合發(fā)酵劑和賴氨酸對發(fā)酵60 d魚醬的風味成分的變化，酸類和醇類變化比較明顯，這些風味物質的不同從一定程度上造成了感官評價不同。通過添加混合發(fā)酵劑和外源賴氨酸，可以得到風味較好的發(fā)酵調(diào)味品。