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    水相體系中磷脂酶A1酶解南極磷蝦磷脂制備溶血磷脂的分析

    2019-07-05 02:13:04俞博凱丁玉庭劉書來
    食品科學 2019年12期

    胡 劼,俞博凱,呂 飛,丁玉庭,3,劉書來,3,*

    (1.浙江工業(yè)大學海洋學院,浙江 杭州 310014;2.國家遠洋水產品加工技術研發(fā)分中心(杭州),浙江 杭州 310014;3.浙江工業(yè)大學海洋研究院,浙江 杭州 310032)

    南極磷蝦巨大的生物量已受到人們廣泛關注,目前對于南極磷蝦的商業(yè)開發(fā)局限于動物飼料等的加工,經濟效益低下[1]。研究發(fā)現(xiàn),南極磷蝦磷脂的主要成分是磷脂酰膽堿(phosphatidyl cholines,PC),還有少量磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)和磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)等[2]。磷蝦油中約60%~70%的ω-3長鏈多不飽和脂肪酸,主要是二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA),并且與磷脂結合存在(位于Sn-2位居多)[3],是目前自然界中發(fā)現(xiàn)的唯一一種以磷脂形態(tài)結合的多不飽和脂肪酸,而魚油中的DHA、EPA主要以甘油酯形式存在,因而比魚油具有更為重要的生理功能[4]。海洋源ω-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA),已被證明在預防心血管疾病中發(fā)揮有益作用[5-6]。除此之外,ω-3 PUFA還被證實可降低收縮壓、緩解血小板聚集、消炎以及預防心律失常[5]。ω-3 PUFA通常以甘油三酯(triglyceride,TG)的形式通過魚油或者補充劑攝入,而磷蝦油中ω-3 PUFA以磷脂的形式存在,能被更有效地吸收并摻入細胞膜中[7],還可減少血漿脂質[8]、提高EPA和DHA的生物利用度及抗炎和抗氧化活性[9-10]。

    溶血磷脂的乳化穩(wěn)定性、抗氧化性、潤濕性及親水親油平衡值(hydrophile-lipophile balance number,HLB)都優(yōu)于磷脂,其乳化體系有抗酸、抗鹽以及抗高溫等優(yōu)點[11]。同時,溶血磷脂的分子滲透能力、殺菌能力、溶血能力與藥物親和能力也引起生理藥理學家的極大興趣。目前磷脂酶解的原料主要為大豆和蛋黃等[12-13],國內外關于南極磷蝦磷脂酶解改性制備溶血磷脂的報道較少,因此將其作為原料制備富含EPA和DHA的溶血磷脂,具有更重要的生理功能[14]。國內外溶血磷脂制備工藝通常采用非水相體系[15-16]或含緩沖液的水相體系[17]。非水相體系的酶改性工藝中有機溶劑的使用造成產品中溶劑殘留,另外溶劑的易揮發(fā)性還導致溶劑消耗大,不符合綠色加工發(fā)展趨勢;而含緩沖液的水相體系會影響產品的質量及后續(xù)處理難度。磷脂酶A1(phospholipase A1,PLA1)可用于水解磷脂酰膽堿制備溶血磷脂酰膽堿,且特異性地水解磷脂酰膽堿的Sn-1位,以制備Sn-2位富含EPA和DHA的溶血磷脂酰膽堿,但Sn-2-溶血磷脂酰膽堿(Sn-2-lysophosphatidylcholine,Sn-2-LPC)也會發(fā)生部分?;灰粕蒘n-1-溶血磷脂酰膽堿(Sn-1-lysophosphatidylcholine,Sn-1-LPC)[18-19]。在水相體系中PLA1催化南極磷蝦磷脂制備富含EPA和DHA的溶血磷脂,國內鮮見文獻報道。本研究以酸價衡量磷脂水解程度,通過高效液相色譜-紫外檢測(high performance liquid chromatographyultraviolet,HPLC-UV)儀和高效液相色譜-示差檢測(high performance liquid chromatography-refractive index detector,HPLC-RID)儀對酶解前后磷脂組分(PC、Sn-1-LPC、Sn-2-LPC)進行分析,通過高效液相色譜-蒸發(fā)光散射(high performance liquid chromatographyevaporative light scattering detector,HPLC-ELSD)儀檢測甘油磷脂酰膽堿(glycerol phosphatidylcholine,GPC)含量以進一步證實酰基位移現(xiàn)象,并利用氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometer,GCMS)法分析磷脂酶解前后脂肪酸組成(尤其是EPA和DHA含量的變化),以期為南極磷蝦磷脂的酶解改性技術提供基礎數據。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    南極磷蝦磷脂:以磷蝦油(由遼漁集團提供,采用乙醇提?。樵?,經過多次丙酮沉降,磷脂含量90%左右,酸價10.7 mg/g;磷脂酶A1(Lectise Ultra,酶活力2 000 U/g) 丹麥諾維信公司;無水乙醇、乙醚、丙酮(均為分析純) 上海凌峰化學試劑有限公司;氫氧化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;正己烷、草酸(H2C2O4·2H2O)、異丙醇、95%乙醇、乙酸(均為色譜純) 美國阿拉丁公司。

    1.2 儀器與設備

    DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 杭州博研儀器設備有限公司;RE-2000A旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;FA1004型電子天平 常州市幸運電子設備有限公司;KQ-300DE型數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;DHG-9075電熱鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司;TRACE 1300 GC-MS譜儀賽默飛世爾科技公司;1525液相色譜儀 美國Waters公司。

    1.3 方法

    1.3.1 PLA1酶解南極磷蝦磷脂制備溶血磷脂

    準確稱取0.6 g南極磷蝦磷脂于100 mL錐形瓶中,加30 mL去離子水均質分散,確保反應體系為水相,再加一定比例PLA1溶液,預混勻后,在一定溫度、時間及攪拌速度下進行反應,反應完成后沸水滅酶3 min,留樣待測定。

    1.3.2 雙相薄層色譜定性分析磷脂組成成分

    參考AOCS Ja 7-86[20]的方法測定,稍作修改。點樣:取樣品50 mg溶解后定容于10 mL容量瓶中,使用10 μL微量進樣器進行點樣,樣點距兩邊約1 cm,樣斑直徑不超過3 mm。層析步驟:將點過樣的薄板揮干溶劑后放入盛有展開劑A(氯仿-甲醇-氨水,65∶30∶4,V/V)的層析槽中進行展開。展至距板上沿1 cm左右時取出,在室溫下干燥30 min,揮干溶劑后再放入展開劑B(氯仿-甲醇-冰醋酸-水,170∶25∶25∶6,V/V)中展開,至頂邊1 cm左右時取出,再次晾干。顯色:將揮干溶劑的層析板放入碘缸中顯色。薄層層析板定性分析:將磷脂實驗產品按照上述步驟展開,顯色。參照PC、PE、LPC標樣圖譜和資料中的圖譜,對各磷脂組分進行定性。

    1.3.3 磷脂酸價的測定

    參考AOCS Ja 6-55[21]的方法測定,稍作修改。取干凈250 mL錐形瓶,用天平稱取0.5~3.0 g磷脂樣品,加入乙醚-異丙醇混合液50~100 mL和3~4 滴百里香酚酞指示劑(2%),充分振蕩溶解試樣。再用標準氫氧化鉀(0.1 mol/L)溶液進行手工滴定,當試樣溶液變?yōu)樗{色時,且15 s內無明顯褪色時,為滴定終點。記錄下此時消耗的氫氧化鉀的體積V。同時做一組空白實驗作對照,記錄體積V0,按公式(1)計算酸價:

    式中:XAV為酸價/(mg/g);V為試樣測定所消耗的標準滴定溶液的體積/mL;V0為相應的空白實驗所消耗的標準滴定溶液的體積/mL;c為標準滴定溶液的濃度/(mol/L);56.1為氫氧化鉀的摩爾質量/(g/mol);m為油脂樣品的稱樣量/g。

    1.3.4 磷脂水解度的計算

    磷脂水解度按公式(2)、(3)計算:

    式中:X為磷脂Sn-1位脂肪酸水解度/%;A為水解產物酸價/(mg/g);B為原料酸價/(mg/g);C為磷脂Sn-1位完全水解產生的理論酸價/(mg/g); 為磷脂平均相對分子質量。

    1.3.5 磷脂各組成成分的HPLC-UV分析[22]

    色譜柱:Sunfire Prep Silica(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫30 ℃;流速1 mL/min;檢測波長206 nm;流動相為正己烷-異丙醇-0.05%乙酸(6∶8∶1.38,V/V),過0.22 μm有機膜,超聲脫氣處理30 min;進樣量10 μL。樣品的定性分析采用標樣保留時間比對,定量分析采用標樣外標法。

    1.3.6 磷脂酶解后GPC含量的HPLC-ELSD分析[18]

    色譜柱:Sunfire Prep Silica(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫30 ℃;漂移管溫度80 ℃;流速1 mL/min;梯度洗脫:流動相A為甲醇-水(8∶1,V/V),流動相B為甲醇。流動相A的梯度洗脫,開始10 min,以40%梯度增加到60%并保持5 min,最后3 min由60%降低到40%;進樣量10 μL,樣品的定性分析采用標樣保留時間比對,定量分析采用標樣外標法。

    1.3.7 Sn-1-LPC和Sn-2-LPC含量的HPLC-RID分析

    參考GB/T 22506—2008《酶改性磷脂中1-和2-溶血磷脂酰膽堿的測定》[23]中方法。色譜柱:Waters spherisorb NH2(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫25 ℃;進樣量10 μL。等度洗脫,流動相為95%乙醇-草酸溶液(92:8,V/V),過0.22 μm有機膜,超聲脫氣處理30 min,流速1 mL/min。示差檢測器檢測峰面積,以峰面積為縱坐標(Y),標樣質量濃度為橫坐標(X,mg/mL)進行標準曲線的繪制。

    樣品處理:稱取50~100 mg酶改性磷脂樣品,用95%乙醇溶解稀釋至25 mL,用高速離心機離心(8 000 r/min,10 min),取上清液用0.45 μm纖維膜過濾,現(xiàn)配現(xiàn)用。

    1.3.8 磷脂脂肪酸組成測定[24-27]

    采用薄層制備板分離磷脂和游離脂肪酸。帶狀點樣后,以正己烷-乙醚-冰乙酸(80∶19∶1,V/V)為展開劑進行展層,顯色,刮板收集磷脂層和游離脂肪酸層,用無水乙醇萃取硅膠中的磷脂和游離脂肪酸,氮吹揮干溶劑,得到樣品。

    樣品甲酯化:在樣品中加入1 mL 0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液,搖勻后于80 ℃水浴振蕩5 min,冷卻至室溫后,再加入1 mL 14% BF3-甲醇溶液和0.3 mL 0.1%對苯二酚溶液,在80 ℃水浴中振蕩2 min,冷卻至室溫后加0.2 mL鹽溶液,振蕩10 s后加入1 mL正己烷,振蕩搖勻后靜置。待分層后取含脂肪酸甲酯的上層溶液,加入一定量無水硫酸鈉脫除水分,使用0.22 μm孔徑有機相濾膜過濾后進行GC-MS分析。

    GC條件:HP-INNOWax毛細管柱(60 m×0.32 mm,0.25 μm);載氣為高純氦氣;采用恒流模式;流速為2 mL/min,不分流;進樣量1 μL;進樣口溫度240 ℃;檢測器溫度250 ℃;柱溫以初始溫度90 ℃保持5 min,先以15 ℃/min升至200 ℃,再以1 ℃/min升至240 ℃并保持10 min,整個分析過程為62.3 min。MS條件:GC-MS接口溫度250 ℃;電子電離源;電離能量70 eV;離子源溫度250 ℃;掃描周期,0.2 次/s;質量掃描范圍m/z 35~450 u。

    1.3.9 酶解前后磷脂乳化穩(wěn)定性測定[28-29]

    配制一定量1%酶解后磷脂水溶液,然后按一定油水比加入大豆油,經高速剪切機(10 000 r/min)分散2 min,得乳狀液。將乳化液轉移到100 mL具塞量筒中,間隔一定時間觀察分層情況,并與磷脂原料作比較。以乳化層比例大小衡量乳化能力和乳化穩(wěn)定性,乳化層比例越大,乳化能力和乳化穩(wěn)定性越好,按公式(4)計算:

    1.4 數據分析與處理

    數據結果采用Origin 8.6進行處理。所有實驗平行測定3 次以上,結果以±s表示。

    2 結果與分析

    2.1 南極磷蝦磷脂的組成分析

    用雙相薄層色譜法對原料磷脂中的主要組分進行定性分析,結果如圖1所示。采用乙醇提取的磷蝦磷脂中主要含有PC、PE、LPC等物質,且從顯色面積來看,PC為主要成分。

    圖1 原料磷脂雙相薄層展開圖Fig. 1 Two-dimensional TLC profile of phospholipids

    用HPLC-UV對南極磷蝦磷脂主要組分進行定量分析,由表1可知,實驗室自提的南極磷蝦磷脂中PC為主要成分,其含量為(90.90±1.55)%,PE和溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine,LPC)含量分別為(3.20±1.03)%和(2.60±0.96)%。孫德偉等[30]用亞臨界丁烷提取南極磷蝦脂質,其磷脂含量較高,但磷脂酰膽堿僅占71.20%,其PE和PI含量相對較高。這是由于脂質提取所用溶劑不同,PE在乙醇中溶解度小,而磷蝦中PI含量本就偏低,因此本研究以PC為實驗主要原料進行分析。

    表1 南極磷蝦磷脂各組分的含量Table 1 Composition of Antarctic krill phospholipids%

    2.2 反應時間對磷脂酶解的影響

    圖2 反應時間對磷脂酶解的影響Fig. 2 Effect of reaction time on phospholipid hydrolysis

    考察反應溫度30 ℃和加酶量20 U/g條件下不同反應時間對磷脂酶解過程的影響,如圖2所示,隨著反應時間的延長,酶和底物接觸次數增多,磷脂逐步被水解產生溶血磷脂和游離脂肪酸,其酸價隨之不斷升高,30 min后反應趨于平衡狀態(tài),酸價增加不明顯。PC經PLA1酶解后主要生成Sn-2-LPC,且隨時間的延長,PC含量不斷減少而Sn-2-LPC含量不斷增加,30 min后兩者含量趨于平衡,同時Sn-1-LPC含量隨反應時間延長呈先升高后逐漸降低的趨勢,這是由于酶解過程中部分Sn-2-LPC發(fā)生酰基位移生成Sn-1-LPC,而Sn-1-LPC又進一步被PLA1酶解生成GPC[18-19]。

    2.3 加酶量對磷脂酶解的影響

    一般情況下,酶添加量較低時酶活力隨其添加量的增加而增多,底物與酶活性中心接觸的機率也隨之增加,酶反應速率加快,但隨酶添加量增至一定值時,酶反應速率變化不大,甚至還會出現(xiàn)抑制反應的現(xiàn)象[31]。由圖3可知,由于初始時加酶量較少,酶不能充分催化底物,當加酶量增加時,酶與底物的接觸面積增大,酸價增加較快,而當加酶量達到20 U/g時達到飽和狀態(tài),反應處于平衡,繼續(xù)增大加酶量,水解程度無明顯提高。

    圖3 加酶量對磷脂酶解的影響Fig. 3 Effect of enzyme dosage on phospholipid hydrolysis

    2.4 反應溫度對?;灰频挠绊?/h3>

    圖4 反應溫度對?;灰频挠绊慒ig. 4 Effect of reaction temperature on acyl migration

    圖5 PLA1水解PC示意圖Fig. 5 Schematic of the hydrolysis process of PC by PLA1

    圖4 給出了不同反應溫度下酶解反應過程中下Sn-1-PC和Sn-2-PC含量的變化。結合圖2中反應時間對酶解影響的結果可知,在不同反應溫度下,酶解過程中均發(fā)生酰基位移現(xiàn)象,PLA1水解PC示意圖如圖5所示。張康逸等[32]通過定量13C NMR證明了PLA1具有水解磷脂Sn-1位?;舅岬膶R恍?,證實了Sn-2-溶血磷脂酰膽堿(Sn-2-lysophosphatidylcholine,Sn-2-LPC)的Sn-2位?;鶗ㄟ^酰基轉移到Sn-1位生成Sn-1-溶血磷脂酰膽堿(Sn-1-lysophosphatidylcholine, Sn-1-LPC)現(xiàn)象的存在,且研究了溫度對?;灰频挠绊懀瑥膶嶒灲Y果可知隨溫度升高?;灰瞥潭戎鸩缴撸ǚ磻獣r間6 h)。從圖4可知不同溫度下反應30 min后Sn-1-LPC含量幾乎沒有差異,且GPC含量也沒有升高,說明在較短的酶解時間(30 min)內,溫度對?;灰频挠绊懖皇呛艽?。

    2.5 南極磷蝦磷脂酶解前后脂肪酸組成分析

    表2 南極磷蝦磷脂酶解前后脂肪酸組成分析Table 2 Fatty acid composition of phospholipids before and after enzymatic hydrolysis%

    從表2可以看出,酶解后磷脂的脂肪酸組成中EPA和DHA含量幾乎沒有變化,而游離脂肪酸(free fatty acid,F(xiàn)FA)中EPA和DHA含量有所上升,且酶解后磷脂的不飽和脂肪酸含量有所降低,飽和脂肪酸含量有所上升。說明在酶解過程中,有部分EPA和DHA被水解下來,但由于磷脂中EPA和DHA含量幾乎沒有變化,很有可能是結合在Sn-1位的EPA和DHA被酶解下來,也有可能是少量PE上的EPA和DHA被酶解下來,且其他不飽和脂肪酸也被酶解下來,所以導致酶解后磷脂中飽和脂肪酸含量升高。結合圖2時間對酶解影響的結果,可以得出酶解后得到的Sn-2位溶血磷脂中EPA和DHA含量較高[25-27]。

    2.6 酶解前后磷脂乳化穩(wěn)定性

    圖6 酶解前后磷脂的乳化穩(wěn)定性Fig. 6 Emulsion stability of phospholipids before and after enzymatic hydrolysis

    從圖6可以看到,酶解后磷脂的乳化穩(wěn)定性得到提高,且隨著時間的延長,穩(wěn)定性優(yōu)勢越明顯。這主要是由于磷脂被PLA1水解后生成了親水性更強的溶血磷脂。這是由于酶改性南極磷蝦磷脂保留了普通磷脂的雙親兩性結構,并且由于非極性基團的減少而增強了親水性能[33],由此溶血磷脂一定程度上改變了由于HLB值偏小而致普通磷脂應用范圍受限制的狀況,更加適合用作O/W型乳化劑[34]。

    3 結 論

    在水相體系中利用LPA1酶解南極磷蝦磷脂得到富含EPA和DHA的溶血磷脂。結果表明:加酶量對酸價的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。隨著酶解時間的延長,Sn-2-LPC含量先增加后趨于平衡(30 min),Sn-1-LPC含量先升高后降低,這是由于部分Sn-2-LPC發(fā)生酰基位移生成Sn-1-LPC,而Sn-1-LPC又進一步被LPA1酶解生成GPC,且在較短酶解時間內,溫度對酰基位移的影響不大。最后通過GC-MS分析得出酶解產物Sn-2-LPC中EPA和DHA含量較高,且其乳化穩(wěn)定性也得到提高。

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