水相體系中磷脂酶A1酶解南極磷蝦磷脂制備溶血磷脂的分析

胡 劼，俞博凱，呂 飛，丁玉庭,3，劉書來(lái),3,*

（1.浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.國(guó)家遠(yuǎn)洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心（杭州），浙江 杭州 310014；3.浙江工業(yè)大學(xué)海洋研究院，浙江 杭州 310032）

南極磷蝦巨大的生物量已受到人們廣泛關(guān)注，目前對(duì)于南極磷蝦的商業(yè)開發(fā)局限于動(dòng)物飼料等的加工，經(jīng)濟(jì)效益低下[1]。研究發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦磷脂的主要成分是磷脂酰膽堿（phosphatidyl cholines，PC），還有少量磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）和磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）等[2]。磷蝦油中約60%～70%的ω-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，主要是二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），并且與磷脂結(jié)合存在（位于Sn-2位居多）[3]，是目前自然界中發(fā)現(xiàn)的唯一一種以磷脂形態(tài)結(jié)合的多不飽和脂肪酸，而魚油中的DHA、EPA主要以甘油酯形式存在，因而比魚油具有更為重要的生理功能[4]。海洋源ω-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），已被證明在預(yù)防心血管疾病中發(fā)揮有益作用[5-6]。除此之外，ω-3 PUFA還被證實(shí)可降低收縮壓、緩解血小板聚集、消炎以及預(yù)防心律失常[5]。ω-3 PUFA通常以甘油三酯（triglyceride，TG）的形式通過魚油或者補(bǔ)充劑攝入，而磷蝦油中ω-3 PUFA以磷脂的形式存在，能被更有效地吸收并摻入細(xì)胞膜中[7]，還可減少血漿脂質(zhì)[8]、提高EPA和DHA的生物利用度及抗炎和抗氧化活性[9-10]。

溶血磷脂的乳化穩(wěn)定性、抗氧化性、潤(rùn)濕性及親水親油平衡值（hydrophile-lipophile balance number，HLB）都優(yōu)于磷脂，其乳化體系有抗酸、抗鹽以及抗高溫等優(yōu)點(diǎn)[11]。同時(shí)，溶血磷脂的分子滲透能力、殺菌能力、溶血能力與藥物親和能力也引起生理藥理學(xué)家的極大興趣。目前磷脂酶解的原料主要為大豆和蛋黃等[12-13]，國(guó)內(nèi)外關(guān)于南極磷蝦磷脂酶解改性制備溶血磷脂的報(bào)道較少，因此將其作為原料制備富含EPA和DHA的溶血磷脂，具有更重要的生理功能[14]。國(guó)內(nèi)外溶血磷脂制備工藝通常采用非水相體系[15-16]或含緩沖液的水相體系[17]。非水相體系的酶改性工藝中有機(jī)溶劑的使用造成產(chǎn)品中溶劑殘留，另外溶劑的易揮發(fā)性還導(dǎo)致溶劑消耗大，不符合綠色加工發(fā)展趨勢(shì)；而含緩沖液的水相體系會(huì)影響產(chǎn)品的質(zhì)量及后續(xù)處理難度。磷脂酶A1（phospholipase A1，PLA1）可用于水解磷脂酰膽堿制備溶血磷脂酰膽堿，且特異性地水解磷脂酰膽堿的Sn-1位，以制備Sn-2位富含EPA和DHA的溶血磷脂酰膽堿，但Sn-2-溶血磷脂酰膽堿（Sn-2-lysophosphatidylcholine，Sn-2-LPC）也會(huì)發(fā)生部分?；灰粕蒘n-1-溶血磷脂酰膽堿（Sn-1-lysophosphatidylcholine，Sn-1-LPC）[18-19]。在水相體系中PLA1催化南極磷蝦磷脂制備富含EPA和DHA的溶血磷脂，國(guó)內(nèi)鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以酸價(jià)衡量磷脂水解程度，通過高效液相色譜-紫外檢測(cè)（high performance liquid chromatographyultraviolet，HPLC-UV）儀和高效液相色譜-示差檢測(cè)（high performance liquid chromatography-refractive index detector，HPLC-RID）儀對(duì)酶解前后磷脂組分（PC、Sn-1-LPC、Sn-2-LPC）進(jìn)行分析，通過高效液相色譜-蒸發(fā)光散射（high performance liquid chromatographyevaporative light scattering detector，HPLC-ELSD）儀檢測(cè)甘油磷脂酰膽堿（glycerol phosphatidylcholine，GPC）含量以進(jìn)一步證實(shí)?；灰片F(xiàn)象，并利用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GCMS）法分析磷脂酶解前后脂肪酸組成（尤其是EPA和DHA含量的變化），以期為南極磷蝦磷脂的酶解改性技術(shù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦磷脂：以磷蝦油（由遼漁集團(tuán)提供，采用乙醇提?。樵?，經(jīng)過多次丙酮沉降，磷脂含量90%左右，酸價(jià)10.7 mg/g；磷脂酶A1（Lectise Ultra，酶活力2 000 U/g） 丹麥諾維信公司；無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮（均為分析純） 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正己烷、草酸（H2C2O4·2H2O）、異丙醇、95%乙醇、乙酸（均為色譜純） 美國(guó)阿拉丁公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 杭州博研儀器設(shè)備有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；FA1004型電子天平 常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9075電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TRACE 1300 GC-MS譜儀賽默飛世爾科技公司；1525液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 PLA1酶解南極磷蝦磷脂制備溶血磷脂

準(zhǔn)確稱取0.6 g南極磷蝦磷脂于100 mL錐形瓶中，加30 mL去離子水均質(zhì)分散，確保反應(yīng)體系為水相，再加一定比例PLA1溶液，預(yù)混勻后，在一定溫度、時(shí)間及攪拌速度下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完成后沸水滅酶3 min，留樣待測(cè)定。

1.3.2 雙相薄層色譜定性分析磷脂組成成分

參考AOCS Ja 7-86[20]的方法測(cè)定，稍作修改。點(diǎn)樣：取樣品50 mg溶解后定容于10 mL容量瓶中，使用10 μL微量進(jìn)樣器進(jìn)行點(diǎn)樣，樣點(diǎn)距兩邊約1 cm，樣斑直徑不超過3 mm。層析步驟：將點(diǎn)過樣的薄板揮干溶劑后放入盛有展開劑A（氯仿-甲醇-氨水，65∶30∶4，V/V）的層析槽中進(jìn)行展開。展至距板上沿1 cm左右時(shí)取出，在室溫下干燥30 min，揮干溶劑后再放入展開劑B（氯仿-甲醇-冰醋酸-水，170∶25∶25∶6，V/V）中展開，至頂邊1 cm左右時(shí)取出，再次晾干。顯色：將揮干溶劑的層析板放入碘缸中顯色。薄層層析板定性分析：將磷脂實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品按照上述步驟展開，顯色。參照PC、PE、LPC標(biāo)樣圖譜和資料中的圖譜，對(duì)各磷脂組分進(jìn)行定性。

1.3.3 磷脂酸價(jià)的測(cè)定

參考AOCS Ja 6-55[21]的方法測(cè)定，稍作修改。取干凈250 mL錐形瓶，用天平稱取0.5～3.0 g磷脂樣品，加入乙醚-異丙醇混合液50～100 mL和3～4 滴百里香酚酞指示劑（2%），充分振蕩溶解試樣。再用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鉀（0.1 mol/L）溶液進(jìn)行手工滴定，當(dāng)試樣溶液變?yōu)樗{(lán)色時(shí)，且15 s內(nèi)無(wú)明顯褪色時(shí)，為滴定終點(diǎn)。記錄下此時(shí)消耗的氫氧化鉀的體積V。同時(shí)做一組空白實(shí)驗(yàn)作對(duì)照，記錄體積V0，按公式（1）計(jì)算酸價(jià)：

式中：XAV為酸價(jià)/（mg/g）；V為試樣測(cè)定所消耗的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積/mL；V0為相應(yīng)的空白實(shí)驗(yàn)所消耗的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積/mL；c為標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度/（mol/L）；56.1為氫氧化鉀的摩爾質(zhì)量/（g/mol）；m為油脂樣品的稱樣量/g。

1.3.4 磷脂水解度的計(jì)算

磷脂水解度按公式（2）、（3）計(jì)算：

式中：X為磷脂Sn-1位脂肪酸水解度/%；A為水解產(chǎn)物酸價(jià)/（mg/g）；B為原料酸價(jià)/（mg/g）；C為磷脂Sn-1位完全水解產(chǎn)生的理論酸價(jià)/（mg/g）； 為磷脂平均相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.5 磷脂各組成成分的HPLC-UV分析[22]

色譜柱：Sunfire Prep Silica（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)206 nm；流動(dòng)相為正己烷-異丙醇-0.05%乙酸（6∶8∶1.38，V/V），過0.22 μm有機(jī)膜，超聲脫氣處理30 min；進(jìn)樣量10 μL。樣品的定性分析采用標(biāo)樣保留時(shí)間比對(duì)，定量分析采用標(biāo)樣外標(biāo)法。

1.3.6 磷脂酶解后GPC含量的HPLC-ELSD分析[18]

色譜柱：Sunfire Prep Silica（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；漂移管溫度80 ℃；流速1 mL/min；梯度洗脫：流動(dòng)相A為甲醇-水（8∶1，V/V），流動(dòng)相B為甲醇。流動(dòng)相A的梯度洗脫，開始10 min，以40%梯度增加到60%并保持5 min，最后3 min由60%降低到40%；進(jìn)樣量10 μL，樣品的定性分析采用標(biāo)樣保留時(shí)間比對(duì)，定量分析采用標(biāo)樣外標(biāo)法。

1.3.7 Sn-1-LPC和Sn-2-LPC含量的HPLC-RID分析

參考GB/T 22506—2008《酶改性磷脂中1-和2-溶血磷脂酰膽堿的測(cè)定》[23]中方法。色譜柱：Waters spherisorb NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。等度洗脫，流動(dòng)相為95%乙醇-草酸溶液（92:8，V/V），過0.22 μm有機(jī)膜，超聲脫氣處理30 min，流速1 mL/min。示差檢測(cè)器檢測(cè)峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，mg/mL）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

樣品處理：稱取50～100 mg酶改性磷脂樣品，用95%乙醇溶解稀釋至25 mL，用高速離心機(jī)離心（8 000 r/min，10 min），取上清液用0.45 μm纖維膜過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.8 磷脂脂肪酸組成測(cè)定[24-27]

采用薄層制備板分離磷脂和游離脂肪酸。帶狀點(diǎn)樣后，以正己烷-乙醚-冰乙酸（80∶19∶1，V/V）為展開劑進(jìn)行展層，顯色，刮板收集磷脂層和游離脂肪酸層，用無(wú)水乙醇萃取硅膠中的磷脂和游離脂肪酸，氮吹揮干溶劑，得到樣品。

樣品甲酯化：在樣品中加入1 mL 0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液，搖勻后于80 ℃水浴振蕩5 min，冷卻至室溫后，再加入1 mL 14% BF3-甲醇溶液和0.3 mL 0.1%對(duì)苯二酚溶液，在80 ℃水浴中振蕩2 min，冷卻至室溫后加0.2 mL鹽溶液，振蕩10 s后加入1 mL正己烷，振蕩搖勻后靜置。待分層后取含脂肪酸甲酯的上層溶液，加入一定量無(wú)水硫酸鈉脫除水分，使用0.22 μm孔徑有機(jī)相濾膜過濾后進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件：HP-INNOWax毛細(xì)管柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣；采用恒流模式；流速為2 mL/min，不分流；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度240 ℃；檢測(cè)器溫度250 ℃；柱溫以初始溫度90 ℃保持5 min，先以15 ℃/min升至200 ℃，再以1 ℃/min升至240 ℃并保持10 min，整個(gè)分析過程為62.3 min。MS條件：GC-MS接口溫度250 ℃；電子電離源；電離能量70 eV；離子源溫度250 ℃；掃描周期，0.2 次/s；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～450 u。

1.3.9 酶解前后磷脂乳化穩(wěn)定性測(cè)定[28-29]

配制一定量1%酶解后磷脂水溶液，然后按一定油水比加入大豆油，經(jīng)高速剪切機(jī)（10 000 r/min）分散2 min，得乳狀液。將乳化液轉(zhuǎn)移到100 mL具塞量筒中，間隔一定時(shí)間觀察分層情況，并與磷脂原料作比較。以乳化層比例大小衡量乳化能力和乳化穩(wěn)定性，乳化層比例越大，乳化能力和乳化穩(wěn)定性越好，按公式（4）計(jì)算：

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用Origin 8.6進(jìn)行處理。所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3 次以上，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦磷脂的組成分析

用雙相薄層色譜法對(duì)原料磷脂中的主要組分進(jìn)行定性分析，結(jié)果如圖1所示。采用乙醇提取的磷蝦磷脂中主要含有PC、PE、LPC等物質(zhì)，且從顯色面積來(lái)看，PC為主要成分。

圖1 原料磷脂雙相薄層展開圖Fig. 1 Two-dimensional TLC profile of phospholipids

用HPLC-UV對(duì)南極磷蝦磷脂主要組分進(jìn)行定量分析，由表1可知，實(shí)驗(yàn)室自提的南極磷蝦磷脂中PC為主要成分，其含量為（90.90±1.55）%，PE和溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）含量分別為（3.20±1.03）%和（2.60±0.96）%。孫德偉等[30]用亞臨界丁烷提取南極磷蝦脂質(zhì)，其磷脂含量較高，但磷脂酰膽堿僅占71.20%，其PE和PI含量相對(duì)較高。這是由于脂質(zhì)提取所用溶劑不同，PE在乙醇中溶解度小，而磷蝦中PI含量本就偏低，因此本研究以PC為實(shí)驗(yàn)主要原料進(jìn)行分析。

表1 南極磷蝦磷脂各組分的含量Table 1 Composition of Antarctic krill phospholipids%

2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)磷脂酶解的影響

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)磷脂酶解的影響Fig. 2 Effect of reaction time on phospholipid hydrolysis

考察反應(yīng)溫度30 ℃和加酶量20 U/g條件下不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)磷脂酶解過程的影響，如圖2所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶和底物接觸次數(shù)增多，磷脂逐步被水解產(chǎn)生溶血磷脂和游離脂肪酸，其酸價(jià)隨之不斷升高，30 min后反應(yīng)趨于平衡狀態(tài)，酸價(jià)增加不明顯。PC經(jīng)PLA1酶解后主要生成Sn-2-LPC，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)，PC含量不斷減少而Sn-2-LPC含量不斷增加，30 min后兩者含量趨于平衡，同時(shí)Sn-1-LPC含量隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后逐漸降低的趨勢(shì)，這是由于酶解過程中部分Sn-2-LPC發(fā)生?；灰粕蒘n-1-LPC，而Sn-1-LPC又進(jìn)一步被PLA1酶解生成GPC[18-19]。

2.3 加酶量對(duì)磷脂酶解的影響

一般情況下，酶添加量較低時(shí)酶活力隨其添加量的增加而增多，底物與酶活性中心接觸的機(jī)率也隨之增加，酶反應(yīng)速率加快，但隨酶添加量增至一定值時(shí)，酶反應(yīng)速率變化不大，甚至還會(huì)出現(xiàn)抑制反應(yīng)的現(xiàn)象[31]。由圖3可知，由于初始時(shí)加酶量較少，酶不能充分催化底物，當(dāng)加酶量增加時(shí)，酶與底物的接觸面積增大，酸價(jià)增加較快，而當(dāng)加酶量達(dá)到20 U/g時(shí)達(dá)到飽和狀態(tài)，反應(yīng)處于平衡，繼續(xù)增大加酶量，水解程度無(wú)明顯提高。

圖3 加酶量對(duì)磷脂酶解的影響Fig. 3 Effect of enzyme dosage on phospholipid hydrolysis

2.4 反應(yīng)溫度對(duì)酰基位移的影響

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)?；灰频挠绊慒ig. 4 Effect of reaction temperature on acyl migration

圖5 PLA1水解PC示意圖Fig. 5 Schematic of the hydrolysis process of PC by PLA1

圖4 給出了不同反應(yīng)溫度下酶解反應(yīng)過程中下Sn-1-PC和Sn-2-PC含量的變化。結(jié)合圖2中反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解影響的結(jié)果可知，在不同反應(yīng)溫度下，酶解過程中均發(fā)生?；灰片F(xiàn)象，PLA1水解PC示意圖如圖5所示。張康逸等[32]通過定量13C NMR證明了PLA1具有水解磷脂Sn-1位?；舅岬膶Ｒ恍?，證實(shí)了Sn-2-溶血磷脂酰膽堿（Sn-2-lysophosphatidylcholine，Sn-2-LPC）的Sn-2位?；鶗?huì)通過?；D(zhuǎn)移到Sn-1位生成Sn-1-溶血磷脂酰膽堿（Sn-1-lysophosphatidylcholine, Sn-1-LPC）現(xiàn)象的存在，且研究了溫度對(duì)?；灰频挠绊懀瑥膶?shí)驗(yàn)結(jié)果可知隨溫度升高?；灰瞥潭戎鸩缴撸ǚ磻?yīng)時(shí)間6 h）。從圖4可知不同溫度下反應(yīng)30 min后Sn-1-LPC含量幾乎沒有差異，且GPC含量也沒有升高，說(shuō)明在較短的酶解時(shí)間（30 min）內(nèi)，溫度對(duì)?；灰频挠绊懖皇呛艽?。

2.5 南極磷蝦磷脂酶解前后脂肪酸組成分析

表2 南極磷蝦磷脂酶解前后脂肪酸組成分析Table 2 Fatty acid composition of phospholipids before and after enzymatic hydrolysis%

從表2可以看出，酶解后磷脂的脂肪酸組成中EPA和DHA含量幾乎沒有變化，而游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）中EPA和DHA含量有所上升，且酶解后磷脂的不飽和脂肪酸含量有所降低，飽和脂肪酸含量有所上升。說(shuō)明在酶解過程中，有部分EPA和DHA被水解下來(lái)，但由于磷脂中EPA和DHA含量幾乎沒有變化，很有可能是結(jié)合在Sn-1位的EPA和DHA被酶解下來(lái)，也有可能是少量PE上的EPA和DHA被酶解下來(lái)，且其他不飽和脂肪酸也被酶解下來(lái)，所以導(dǎo)致酶解后磷脂中飽和脂肪酸含量升高。結(jié)合圖2時(shí)間對(duì)酶解影響的結(jié)果，可以得出酶解后得到的Sn-2位溶血磷脂中EPA和DHA含量較高[25-27]。

2.6 酶解前后磷脂乳化穩(wěn)定性

圖6 酶解前后磷脂的乳化穩(wěn)定性Fig. 6 Emulsion stability of phospholipids before and after enzymatic hydrolysis

從圖6可以看到，酶解后磷脂的乳化穩(wěn)定性得到提高，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，穩(wěn)定性優(yōu)勢(shì)越明顯。這主要是由于磷脂被PLA1水解后生成了親水性更強(qiáng)的溶血磷脂。這是由于酶改性南極磷蝦磷脂保留了普通磷脂的雙親兩性結(jié)構(gòu)，并且由于非極性基團(tuán)的減少而增強(qiáng)了親水性能[33]，由此溶血磷脂一定程度上改變了由于HLB值偏小而致普通磷脂應(yīng)用范圍受限制的狀況，更加適合用作O/W型乳化劑[34]。

3 結(jié) 論

在水相體系中利用LPA1酶解南極磷蝦磷脂得到富含EPA和DHA的溶血磷脂。結(jié)果表明：加酶量對(duì)酸價(jià)的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，Sn-2-LPC含量先增加后趨于平衡（30 min），Sn-1-LPC含量先升高后降低，這是由于部分Sn-2-LPC發(fā)生?；灰粕蒘n-1-LPC，而Sn-1-LPC又進(jìn)一步被LPA1酶解生成GPC，且在較短酶解時(shí)間內(nèi)，溫度對(duì)?；灰频挠绊懖淮?。最后通過GC-MS分析得出酶解產(chǎn)物Sn-2-LPC中EPA和DHA含量較高，且其乳化穩(wěn)定性也得到提高。