藍(lán)圓鲹酸/堿等電點(diǎn)沉淀法分離蛋白凝膠特性與消化特性

孫樂(lè)常，林怡晨，劉偉鋒，翁 凌，張凌晶，劉光明，曹敏杰,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門(mén) 361021；3.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361021）

藍(lán)圓鲹（Decapterus maruadsi），鱸形目（Perciformes），鲹科（Carangidae），系暖水性中上層魚(yú)類(lèi)，在中國(guó)、日本、朝鮮等國(guó)家周邊海域均有分布[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年藍(lán)圓鲹全國(guó)捕撈量總計(jì)達(dá)60.09萬(wàn) t，其中福建省捕撈量為27.67萬(wàn) t，居全國(guó)首位，且歷年產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，具有很好的開(kāi)發(fā)利用前景[2]。目前，藍(lán)圓鲹除鮮食外，主要被加工成魚(yú)干、魚(yú)露或腌制品等低值產(chǎn)品，其精深加工產(chǎn)品比例較低[3]。另一方面，由于過(guò)度捕撈與氣候環(huán)境變化，全球的海洋魚(yú)類(lèi)資源日益匱乏，一些傳統(tǒng)魚(yú)糜原料魚(yú)類(lèi)產(chǎn)量，如鱈魚(yú)、鰻魚(yú)、馬鮫魚(yú)等，已呈現(xiàn)出逐年下降的趨勢(shì)，與當(dāng)前我國(guó)魚(yú)糜制品需求量不斷攀升形成鮮明反差，尋找一種新的魚(yú)糜制品原料已成為沿海地區(qū)魚(yú)糜企業(yè)亟待解決的問(wèn)題之一。價(jià)格低廉、產(chǎn)量穩(wěn)定的藍(lán)圓鲹有望成為理想的魚(yú)糜制品新原料[4]。傳統(tǒng)魚(yú)糜加工過(guò)程中，往往需要通過(guò)漂洗以去除魚(yú)肉中的油脂、血液以及水溶性蛋白酶，從而達(dá)到增白、提高魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的目的。然而，漂洗同時(shí)也導(dǎo)致了大量水溶性蛋白流失，造成優(yōu)質(zhì)蛋白的嚴(yán)重浪費(fèi)。

等電點(diǎn)沉淀技術(shù)是基于蛋白質(zhì)在不同pH值的溶解特性衍生出的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。最初該分離技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物蛋白的分離與制備，能高效提取大豆分離蛋白且保持其生物活性[5]。相比于傳統(tǒng)魚(yú)糜制品加工過(guò)程中的魚(yú)肉漂洗法，該方法在回收小型低值海洋魚(yú)類(lèi)蛋白方面具有以下優(yōu)勢(shì)：魚(yú)蛋白的回收率顯著提高；可以有效去除魚(yú)肌肉中的脂肪成分，防止因油脂氧化而導(dǎo)致的魚(yú)糜品質(zhì)下降[6]。因此，等電點(diǎn)沉淀法也漸漸應(yīng)用于水產(chǎn)蛋白資源的開(kāi)發(fā)與利用。目前的報(bào)道多集中于斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）[7]、石首魚(yú)（Micropogon undulatus）[8]、羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）[9]、鰱魚(yú)（Hypophthalmichthys molitrix）[10]、沙丁魚(yú)（Sardinella gibosa）[11]、鱈魚(yú)（Gadus morhua）[12]、鯡魚(yú)（Clupea harengus）[13]等少數(shù)魚(yú)類(lèi)。以上研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類(lèi)的等電點(diǎn)沉淀分離蛋白所表現(xiàn)出的蛋白構(gòu)象變化與凝膠特性不僅與pH值相關(guān)，也呈現(xiàn)出明顯的魚(yú)種差異性。等電點(diǎn)沉淀分離蛋白在經(jīng)歷酸或堿性pH值變化時(shí)，會(huì)發(fā)生一系列構(gòu)象的展開(kāi)與折疊，這些變化可能會(huì)使其分子的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象、物理化學(xué)特性等發(fā)生改變，并最終影響蛋白質(zhì)的功能特性，如凝膠性、乳化性等[14]。此外，蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變還可能影響其在人體內(nèi)的消化與吸收，進(jìn)而改變蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。然而迄今為止，魚(yú)分離蛋白在等電點(diǎn)沉淀過(guò)程中結(jié)構(gòu)變化規(guī)律和內(nèi)在分子機(jī)制，以及分離蛋白在人體內(nèi)的消化性變化仍未闡明[6]。

本研究擬以藍(lán)圓鲹為原材料，采用等電點(diǎn)沉淀法制備肌肉分離蛋白，優(yōu)化蛋白質(zhì)分離的條件，并系統(tǒng)比較分析酸法與堿法回收等電點(diǎn)沉淀分離蛋白的凝膠與消化特性，旨在為等電點(diǎn)沉淀技術(shù)在藍(lán)圓鲹分離蛋白中的應(yīng)用及其工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰鮮藍(lán)圓鲹（均質(zhì)量約150 g/尾）購(gòu)于福建省廈門(mén)市集美菜市場(chǎng)。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；豬胃蛋白酶（250 U/mg）、豬胰蛋白酶（1 500 U/mg）美國(guó)Sigma公司；氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品H型 日本W(wǎng)ako公司；鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）、9-芴甲基氯甲酸酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC）美國(guó)Agilent公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PT-2100 E組織搗碎機(jī) 瑞士Kinematica公司；UB-7pH計(jì)、MA35M-000230V1水分測(cè)定儀 德國(guó)Sartorius公司；ATN-300全自動(dòng)凱氏定氮儀 上海洪紀(jì)設(shè)備有限公司；GF-1260高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；Mini-PROTEAN蛋白質(zhì)電泳裝置 美國(guó)Bio-Rad公司；G:BOX凝膠成像儀 英國(guó)Syngene公司；TA.new plus質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)Isenso公司；DHR-2流變儀 美國(guó)TA儀器公司；Stephan UMC 5真空斬拌機(jī) 美國(guó)Stephan Machinery公司；E-1010離子濺射儀、S-480掃描電子顯微鏡 日本日立制造所；Samdri-PVT-3D臨界點(diǎn)干燥儀美國(guó)Tousimis公司。

1.3 方法

1.3.1 分離蛋白的制備

無(wú)特殊說(shuō)明，所有操作均在4 ℃進(jìn)行。新鮮藍(lán)圓鲹去皮采肉后，加入4 倍體積冰水用組織搗碎機(jī)充分搗碎。得到的肉漿用1 mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至10.0～11.5或1.5～3.0，經(jīng)過(guò)10 min的磁力攪拌（300 r/min）后，8 000×g離心10 min，小心去除表層白色漂浮狀物，并收集上清液組分，用1 mol/L的HCl溶液或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5～6.0，攪拌10 min后經(jīng)過(guò)8 000×g離心10 min，收集沉淀部分，并加入一定量的NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至7.0，即為分離蛋白。其中，利用在堿性pH值條件下溶解制備得到的分離蛋白為堿法分離蛋白（alkaline aided protein isolate，KPI），酸性pH值溶解制備得到的分離蛋白為酸法分離蛋白（acid aided protein isolate，API）。藍(lán)圓鲹采后的肌肉組分即為實(shí)驗(yàn)中所用全蛋白（total protein，TP），肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）的制備則參考Rawdkuen等[15]的方法。得到的4 種蛋白均放置于保鮮密封口袋中，于冰上保存，并在24 h內(nèi)使用。

1.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定

利用水分自動(dòng)測(cè)定儀測(cè)定水分含量，加熱溫度為160 ℃。脂肪、灰分以及粗蛋白含量測(cè)定參考Sun Lechang等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定，均以干質(zhì)量計(jì)。

1.3.3 氨基酸成分分析

藍(lán)圓鲹分離蛋白的氨基酸成分分析參考孫莎[17]的方法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.01 g的蛋白質(zhì)樣品，置于10 mm×100 mm真空消化管中，加入1 mL的6 mol/L HCl溶液，120 ℃油浴24 h。消化結(jié)束后用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性。色譜條件：Eclipse-AAA色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測(cè)器：波長(zhǎng)338 nm（OPA-氨基酸）和262 nm（FMOC-氨基酸）；A相為40 mmol/L Na2HPO4（pH 7.8）；B相為乙腈-甲醇-水（45∶45∶10，V/V）；進(jìn)樣量0.5 μL；流速2 mL/min；柱溫箱40 ℃。

1.3.4 SDS-PAGE分析

參照Laemmli[18]方法對(duì)分離蛋白進(jìn)行分析。將分離蛋白加入2 倍體積的蛋白質(zhì)溶解液，95 ℃加熱20 min。蛋白質(zhì)溶解液：20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）含1% SDS，8 mol/L尿素，體積分?jǐn)?shù)2% β-巰基乙醇。

1.3.5 消化特性分析

1.3.5.1 體外模擬胃腸液消化

為探究4 種蛋白熱處理后的消化特性，分別將4 組蛋白以1∶4（g/mL）與純水均質(zhì)混勻，經(jīng)90 ℃加熱30 min后用于該部分實(shí)驗(yàn)。

模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）參照文獻(xiàn)[19]的方法，配制質(zhì)量濃度為2 g/L的NaCl溶液，并用HCl調(diào)節(jié)pH值至1.2。體外SGF消化參考萬(wàn)楚君等[20]的方法，并做適當(dāng)修改。整個(gè)SGF消化的總反應(yīng)體系為3 mL，胃蛋白酶與蛋白的比例為1∶100（m/m）。取1.5 mL SGF加入試管中，于37 ℃預(yù)熱15 min，再與加熱處理后的蛋白樣品混勻，隨后加入胃蛋白酶，于37 ℃水浴鍋中振蕩反應(yīng)0、5、10、30、60、120 min。在達(dá)到反應(yīng)時(shí)間后，取出200 μL反應(yīng)液于1.5 mL離心管中，加入60 μL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。對(duì)照組的反應(yīng)除不加蛋白酶外，步驟與樣品組一致。

模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）參照文獻(xiàn)[19]配制50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）。SIF消化實(shí)驗(yàn)參考萬(wàn)楚君等[20]的方法并作適當(dāng)修改，其總反應(yīng)體系為3 mL，豬胰蛋白酶與蛋白的比例為1∶600（m/m）。在試管中加入1.5 mL SIF于37 ℃預(yù)熱15 min，再將加熱處理后的蛋白加入試管中混勻，于37 ℃水浴鍋中振蕩反應(yīng)0、5、10、30、60、120 min。達(dá)到反應(yīng)時(shí)間后，取出200 μL反應(yīng)液于1.5 mL離心管中，95 ℃加熱10 min終止反應(yīng)。對(duì)照組的反應(yīng)除不加蛋白酶外，步驟與樣品組一致。

蛋白的體外模擬胃腸液消化（連續(xù)消化）實(shí)驗(yàn)，SGF與SIF同上述一致。主要步驟如下：200 μL樣品在經(jīng)過(guò)120 min SGF消化后，迅速加入60 μL 0.2 mol/L Na2CO3調(diào)pH值為7.0后，再加入200 μL預(yù)熱的SIF與豬胰蛋白酶，于37 ℃水浴振蕩反應(yīng)120 min，隨后置于95 ℃加熱10 min滅活，即得到模擬胃腸液消化樣品。

1.3.5.2 酶解樣品中可溶性肽含量測(cè)定

采用三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）可溶性肽含量測(cè)定法評(píng)價(jià)蛋白的體外模擬消化效果。在得到的消化樣品中加入30% TCA使其最終為5%，繼續(xù)補(bǔ)加5% TCA定容至1 mL，經(jīng)充分的振蕩混勻后，8 000×g離心10 min，取上清液部分。上清液中可溶性肽含量根據(jù)Lowry法[21]進(jìn)行測(cè)定，以酪氨酸（Tyr）為標(biāo)準(zhǔn)，以每克蛋白釋放的Tyr物質(zhì)的量表示（μmol/g）[22]。

1.3.6 凝膠特性分析

1.3.6.1 分離蛋白魚(yú)糜凝膠的制備

參考Klomklao等[22]的方法進(jìn)行制備。用冰水調(diào)節(jié)藍(lán)圓鲹分離蛋白的含水量至85%，其后放入真空斬拌機(jī)中低溫空擂10 min，再加入分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的NaCl繼續(xù)斬拌10 min。將擂潰后的樣品分為兩部分：一部分裝于圓柱形模具（直徑3.5 cm，高4.5 cm）中，兩端密封扎緊，用于凝膠質(zhì)構(gòu)測(cè)定實(shí)驗(yàn)；另一部分用于動(dòng)態(tài)流變學(xué)分析。分離蛋白魚(yú)糜凝膠化采用2 種加熱方式，一種是正常凝膠化加熱（kamaboko組），即40 ℃加熱30 min后90 ℃加熱30 min；另一種是模擬凝膠劣化加熱（modori組），即55 ℃加熱30 min后90 ℃加熱30 min。加熱后獲得的凝膠樣品立刻置于冰水混合物中迅速冷卻并于4 ℃過(guò)夜后待測(cè)凝膠強(qiáng)度。

1.3.6.2 動(dòng)態(tài)流變學(xué)分析

參考Abdollahi等[23]的方法對(duì)藍(lán)圓鲹分離蛋白的流變學(xué)特性進(jìn)行研究。采用40 mm平行鋁板，取上述流變待測(cè)樣品（1.5～2 g），均勻平鋪在測(cè)試平臺(tái)上，除去周?chē)^(guò)量的樣品，在四周裸露部分涂上少量的石蠟密封，避免水分蒸發(fā)。具體參數(shù)如下：樣品間隙1.5 mm，應(yīng)變?yōu)?%，掃描頻率為1 Hz，掃描溫度為10～90 ℃，掃描速率2 ℃/min。

1.3.6.3 凝膠強(qiáng)度測(cè)定

參考Weng Wuyin等[24]的方法利用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定魚(yú)糜凝膠樣品的凝膠強(qiáng)度。測(cè)定前將樣品切成高為3 cm左右的圓柱體。質(zhì)構(gòu)分析具體參數(shù)：探頭為5 mm直徑球形探頭，測(cè)試速率0.5 mm/s，觸發(fā)力5 g，形變程度50%。數(shù)據(jù)分析曲線上的第1個(gè)峰值即為破斷力，其對(duì)應(yīng)的穿刺距離即為破斷距離。按下式計(jì)算凝膠強(qiáng)度：

凝膠強(qiáng)度/（N·mm）= B×D

式中：B為魚(yú)糜制品的破斷力/N；D為魚(yú)糜制品的破斷距離/mm。

1.3.6.4 微觀結(jié)構(gòu)分析

參考Weng Wuyiin等[24]的方法，利用掃描電子顯微鏡觀察魚(yú)糜樣品的微觀結(jié)構(gòu)。先將樣品切成2～3 mm的小塊，用固定液（2.5%戊二醛，0.1 mol/L PBS，pH 7.2）在4 ℃條件下浸泡24 h后，用pH 7.2、0.1 mol/L PBS緩沖液漂洗3 次，再進(jìn)行體積分?jǐn)?shù)30%～100%乙醇溶液梯度脫水，CO2臨界干燥后將樣品通過(guò)導(dǎo)電膠固定值樣品臺(tái)上。經(jīng)E-1010離子濺射儀鍍金后，在10 kV的加速電壓下觀察魚(yú)糜樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3 次以上。采用Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理求平均值、偏差；采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析（Duncan多重檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸/堿等電點(diǎn)沉淀法制備分離蛋白的條件優(yōu)化

圖1 pH值對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白溶解性與回收率的影響Fig. 1 Effect of pH on the solubility and recovery yield of blue round scad protein

本研究中，藍(lán)圓鲹肌肉蛋白在pH 1.5～12.0范圍內(nèi)的溶解度呈現(xiàn)出典型的U型溶解曲線，蛋白質(zhì)在酸/堿兩端的溶解度最高，如圖1a所示。其中，在酸性pH值范圍內(nèi)，肌肉蛋白溶解度在pH 2.0以后趨于穩(wěn)定，pH 2.0時(shí)溶解度達(dá)到最高值，蛋白質(zhì)量濃度達(dá)0.52 mg/mL，溶解度為81.2%；在堿性pH值范圍內(nèi)，肌肉蛋白溶解度在pH 10.0以后逐漸趨向穩(wěn)定，蛋白質(zhì)量濃度達(dá)0.63 mg/mL，溶解度可達(dá)95%以上，顯著高于酸性pH值。此外，肌肉蛋白在pH 4.5～5.5范圍內(nèi)的溶解度較低，當(dāng)pH值為5.5時(shí)達(dá)到最低值（10.2%）。Undeland等[13]研究了鯡魚(yú)白色肉在不同pH值范圍的溶解度時(shí)發(fā)現(xiàn)，肌肉蛋白在pH值小于4.0或大于11.0時(shí)均能有90%以上的溶解度，蛋白在pH 5.5～6.0時(shí)的溶解度最小，類(lèi)似結(jié)果還見(jiàn)于斑點(diǎn)叉尾鮰[7]、石首魚(yú)[8]、鯉魚(yú)[25]、羅非魚(yú)[9]等，以上結(jié)果與本研究中藍(lán)圓鲹肌肉蛋白在不同pH值條件下的溶解性變化規(guī)律一致。

由于蛋白在pH 11.0處的溶解度與pH 12.0相差不大，基于實(shí)際應(yīng)用中原料與成本考慮，選擇pH 11.0為本次實(shí)驗(yàn)堿法制備分離蛋白的最優(yōu)溶解pH值。在此基礎(chǔ)上，本研究選取最優(yōu)的pH 2.0與pH 11.0的蛋白質(zhì)溶解條件，并觀察等電點(diǎn)沉淀pH值下的分離蛋白回收率情況，結(jié)果如圖1b所示。通過(guò)酸法與堿法溶解的蛋白溶液，在沉淀pH值為5.5時(shí)等電點(diǎn)沉淀得到的分離蛋白回收率均最高，分別為65.0%與84.6%，且堿法溶解的分離蛋白回收率顯著高于酸法溶解的，這可能與肌肉蛋白本身在酸性pH值下的溶解較低有關(guān)。Kristinsson等[7]發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)叉尾鮰與石首魚(yú)[8]肌肉蛋白在酸法等電點(diǎn)沉淀的回收率高于堿法等電點(diǎn)沉淀。而羅非魚(yú)[9]以及歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）[26]肌肉蛋白在堿法等電點(diǎn)沉淀下的回收率則高于酸法。本研究的結(jié)果與Tian Yuanyong等[25]對(duì)鯉魚(yú)肌肉蛋白的回收率研究結(jié)果一致。酸/堿等電點(diǎn)沉淀的回收率與魚(yú)的種類(lèi)、肌肉蛋白的類(lèi)型和含量有著明顯地相關(guān)性。

2.2 理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表1 藍(lán)圓鲹分離蛋白理化指標(biāo)Table 1 Proximate composition of blue round scad protein isolates%

由表1可知，藍(lán)圓鲹全肉的粗蛋白、脂肪與灰分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為79.6%、13.0%、5.8%，與陳曉婷等[3]對(duì)藍(lán)圓鲹肌肉組成分析的結(jié)果接近。迴游性海洋魚(yú)類(lèi)肌肉的脂肪中含有大量的不飽和脂肪酸，在加工與貯藏過(guò)程往往會(huì)發(fā)生脂肪過(guò)氧化現(xiàn)象，導(dǎo)致魚(yú)肉品質(zhì)的下降。因此，在制備分離蛋白時(shí)，分離蛋白中脂肪的脫除率也是評(píng)價(jià)分離方法實(shí)際應(yīng)用效果的重要指標(biāo)之一[27]。與TP相比，MP與等電點(diǎn)沉淀（API/KPI）均可有效降低魚(yú)肉中的脂肪與灰分含量，其中KPI去除脂肪效果最佳，脫除率達(dá)到59.2%。堿法等電點(diǎn)沉淀在脫脂上優(yōu)于酸法在其他魚(yú)類(lèi)肌肉蛋白回收中亦有報(bào)道，如：彩虹鮭魚(yú)（Oncorhynchus mykiss）[27]、石首魚(yú)[8]、斑點(diǎn)叉尾鮰[7]等，推測(cè)其可能是由于油脂與堿發(fā)生皂化，生成的脂肪酸鹽在離心后會(huì)浮于上清液表層從而能被輕易去除。此外，相比于API（80.5%），KPI（87.1%）的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)也顯著高于TP（79.6%）和MP（77.9%），表明堿法等電點(diǎn)沉淀技術(shù)更適用于藍(lán)圓鲹肌肉蛋白分離。

2.3 SDS-PAGE分析

魚(yú)類(lèi)肌肉蛋白按其溶解特性可分為水溶性的肌漿蛋白、鹽溶性的MP以及不溶性的基質(zhì)蛋白，肌漿蛋白與MP分別占總蛋白的20%～50%與50%～70%，基質(zhì)蛋白含量最低，在10%以下[28]。利用SDS-PAGE對(duì)得到的4 種蛋白（TP、MP、API與KPI）的蛋白組成進(jìn)行分析，如圖2所示，4 種分離蛋白的主要蛋白組成接近，包括肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）、肌動(dòng)蛋白（actin，AC）、肌鈣蛋白T（troponin-T，TN-T）以及原肌球蛋白（tropomyosin，TM），且MHC含量都是最高。但與其他3 組分離蛋白（TP、AP、KPI）不同，MP組在40～150 kDa區(qū)間的蛋白條帶明顯比較少，這可能由于等電點(diǎn)沉淀法回收了水溶性和鹽溶性的蛋白，而MP制備過(guò)程水溶性蛋白被除去。Rawdkuen等[15]對(duì)比羅非魚(yú)肌肉不同分離蛋白時(shí)得到類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，API組在150～200 kDa區(qū)間出現(xiàn)了較多的降解片段，推測(cè)其原因可能是MHC在酸性pH值下發(fā)生了部分降解，這種現(xiàn)象與Tian Yuanyong等[25]研究鯉魚(yú)肌肉分離蛋白的結(jié)果一致。

圖2 藍(lán)圓鲹魚(yú)肉分離蛋白的SDS-PAGEFig. 2 SDS-PAGE patterns of blue round scad protein isolates

2.4 氨基酸成分分析

表2 藍(lán)圓鲹分離蛋白氨基酸含量分析Table 2 Amino acid conposition of blue round scad protein isolates%

為進(jìn)一步比較分離蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值變化情況，對(duì)其進(jìn)行氨基酸組成分析，如表2所示。4 組分離蛋白的氨基酸組成基本一致，蛋白中的谷氨酸鹽（谷氨酸＋谷氨酰胺，Glu＋Gln）含量最高，其次為天冬氨酸鹽（天冬氨酸＋天冬酰胺，Asp＋Asn）、亮氨酸（Leu）與賴氨酸（Lys）。除色氨酸因?yàn)辂}酸水解被完全破壞未檢出外，藍(lán)圓鲹肌肉4 組蛋白的必需氨基酸與總氨基酸比例均高于40%，滿足FAO/WHO推薦的理想蛋白模式，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白，這個(gè)結(jié)果與楊伊然等[29]對(duì)藍(lán)圓鲹魚(yú)肉蛋白氨基酸分析結(jié)果一致。

此外，API與KPI的甘氨酸（Gly）與脯氨酸（Pro）含量明顯低于TP與MP（P＜0.05），其原因可能由于大部分基質(zhì)蛋白在酸或堿性條件下溶解性較低，可通過(guò)離心去除。而甘氨酸與脯氨酸是基質(zhì)蛋白的主要組成氨基酸，因此在API與KPI中的含量較低。本研究的結(jié)果與Tian Yuanyong等[25]的研究結(jié)果相一致。

2.5 凝膠特性分析

圖3 藍(lán)圓鲹分離蛋白凝膠強(qiáng)度Fig. 3 Gel strength of blue round scad protein isolates

如圖3所示，在kamaboko組，凝膠強(qiáng)度由高至低分別為MP（63.6 N·mm）＞TP（23.5 N·mm）＞API（12.4 N·mm）＞KPI（2.1 N·mm）。相比之下，經(jīng)過(guò)55 ℃模擬凝膠劣化加熱后，4 組蛋白的凝膠強(qiáng)度由高至低分別為MP（24.5 N·mm）＞API（10.3 N·mm）＞TP（3.8 N·mm）＞KPI（1.9 N·mm），低于kamaboko組中相應(yīng)魚(yú)糜制品的凝膠強(qiáng)度，這可能與內(nèi)源性蛋白酶導(dǎo)致的凝膠劣化有關(guān)[30-31]。此外，kamaboko組和modori組中API和KPI均表現(xiàn)比MP低的凝膠強(qiáng)度，特別是KPI的凝膠強(qiáng)度最弱，可能是由于KPI相比于MP含有更多的水溶性蛋白酶[32]。API組在2 種加熱方式所測(cè)定的凝膠強(qiáng)度并無(wú)明顯差別，表明內(nèi)源性蛋白酶在酸法等電點(diǎn)沉淀過(guò)程發(fā)生了不可逆變性失活。

如圖4所示，除API組外，TP、MP和KPI在50～55 ℃出現(xiàn)儲(chǔ)能模量（G’）下降的趨勢(shì)，表明發(fā)生了凝膠劣化現(xiàn)象，這與55 ℃加熱條件下3 組蛋白魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的下降相吻合。從55 ℃開(kāi)始，TP、MP和KPI的儲(chǔ)能模量出現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，暗示著發(fā)生了典型的魚(yú)糜凝膠化現(xiàn)象[33]。API組沒(méi)有表現(xiàn)明顯的凝膠化和凝膠劣化現(xiàn)象，推測(cè)可能在酸法等電點(diǎn)沉淀過(guò)程中肌肉蛋白發(fā)生了劇烈的蛋白變性現(xiàn)象，導(dǎo)致包括肌球蛋白發(fā)生了不可逆變性，從而失去熱凝膠能力。有研究指出魚(yú)糜凝膠的形成是由于內(nèi)部的蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)通過(guò)二硫鍵、氫鍵、疏水互作等作用力發(fā)生交聯(lián)，從而形成了三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而在加熱前已經(jīng)變性的蛋白質(zhì)則無(wú)交聯(lián)能力，進(jìn)而無(wú)法形成凝膠[34]。肌球蛋白作為魚(yú)糜凝膠形成的關(guān)鍵蛋白，它的變性程度對(duì)魚(yú)糜的凝膠形成起著決定性作用。Kristinsson等[12]研究發(fā)現(xiàn)在低pH值下肌球蛋白會(huì)發(fā)生完全的解離，而在pH 11.0下則能夠保持相對(duì)較高的結(jié)構(gòu)完整性；Park等[11]研究沙丁魚(yú)肌球蛋白在不同pH值條件下的變化中發(fā)現(xiàn)，沙丁魚(yú)肌球蛋白在pH 2.0溶解后，再將pH值調(diào)回中性會(huì)發(fā)生完全的蛋白變性，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白的凝膠形成能力顯著下降。這些報(bào)道與本研究中所做的推測(cè)相符。此外，酸性條件不僅使肌球蛋白發(fā)生變性，還會(huì)使其他內(nèi)源性蛋白酶變性失活[16]，這可能是API在2 種加熱方式下凝膠強(qiáng)度并未明顯差異的原因。

圖4 藍(lán)圓鲹魚(yú)肉分離蛋白流變學(xué)分析Fig. 4 Rheological analysis of blue round scad protein isolates

圖5 藍(lán)圓鲹魚(yú)肉分離蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)Fig. 5 Microstructure of blue round scad protein isolates

如圖5所示，kamaboko組中TP與MP凝膠表層更加致密，這與其內(nèi)源性谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的交聯(lián)作用有關(guān)。劉海梅[35]發(fā)現(xiàn)添加了微生物谷氨酰胺氨酶（MTGase）的鰱魚(yú)魚(yú)糜微觀結(jié)構(gòu)比未添加的對(duì)照組更致密平整。Abdollahi等[10]在研究黑海小鯡魚(yú)（Clupeonella cultriventris）與鰱魚(yú)肌肉分離蛋白凝膠特性時(shí)，亦得到與本研究類(lèi)似的微觀結(jié)構(gòu)。此外，掃描電子顯微鏡中使用的發(fā)射電子束強(qiáng)度大小也可能影響凝膠微觀形態(tài)表征情況，如使用20.0 kV的電子束可以觀測(cè)到沙丁魚(yú)魚(yú)糜的多孔狀凝膠結(jié)構(gòu)[36]，而使用了10.0 kV或15.0 kV觀測(cè)時(shí)，則很難看到鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠的網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)[35]。

另一方面，KPI、TP與MP在modori組得到的凝膠結(jié)構(gòu)與kamaboko組相比，更加疏松多孔，這可能與KPI、TP與MP中能存在的內(nèi)源性蛋白酶有關(guān)。該結(jié)果與本研究中各組蛋白的質(zhì)構(gòu)及流變學(xué)分析的結(jié)果一致。

2.6 藍(lán)圓鲹分離蛋白的消化特性分析

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變可能引起酶解特性的變化，在食物中則反映在蛋白質(zhì)的消化特性上。本研究將制備的2 種分離蛋白（API和KPI）與TP以及MP進(jìn)行了90 ℃的熱處理，通過(guò)體外模擬胃腸液消化實(shí)驗(yàn)對(duì)其消化特性進(jìn)行比較分析。如圖6所示，胃蛋白酶對(duì)于4 種加熱蛋白的酶解活性從高到低依次為MP＞KPI＞API＞TP，其在胃蛋白酶水解120 min時(shí)釋放的可溶性肽含量分別為267.4、207.9、189.7、19.4 μmol/g，MP的消化性最好，KPI與API的消化性略低于MP，TP則表現(xiàn)出強(qiáng)烈的耐消化性。相比之下，4 種加熱蛋白都能較好地被胰蛋白酶酶解，其酶解活性從高到低依次為MP＞TP＞API＞KPI，這可能與胰蛋白酶較多的底物催化位點(diǎn)有關(guān)。通過(guò)連續(xù)模擬體外胃腸液消化，結(jié)果顯示MP、KPI與API的蛋白消化性明顯優(yōu)于TP。綜合蛋白的回收率，本研究所制備的分離蛋白KPI與API有回收率高、消化性好的特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

圖6 藍(lán)圓鲹分離蛋白消化穩(wěn)定性Fig. 6 Digestibility of blue round scad protein isolates

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)酸/堿等電點(diǎn)沉淀技術(shù)從藍(lán)圓鲹肌肉中制備得到了2 種分離蛋白。結(jié)果表明，分離蛋白在氨基酸組成上與TP和MP并無(wú)顯著差異，這意味著分離蛋白在提高回收率的同時(shí)，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值并未改變。此外，API、KPI的凝膠強(qiáng)度均發(fā)生明顯下降，但其各自誘因不同。酸分離蛋白是由于發(fā)生了較強(qiáng)烈的變性現(xiàn)象，故而失去熱凝膠的形成能力。相比之下，堿分離蛋白的變性程度較低，但與此同時(shí)也保留了更高的內(nèi)源性蛋白酶的活力，這可能與堿分離蛋白回收了大部分的水溶性蛋白有關(guān)。體外模擬胃腸液消化實(shí)驗(yàn)表明，API、KPI與TP相比，具有更好的消化性，更易被人體消化吸收，這也說(shuō)明藍(lán)圓鲹分離蛋白可作為一種較理想的蛋白配料應(yīng)用于食品工業(yè)之中。