菊粉對(duì)凍藏鰱魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白抗凍性的影響

儀淑敏，葉貝貝，張?jiān)婗?，余永名，趙文浩，李學(xué)鵬，范大明，郁曉君，丁浩宸，黃建聯(lián)，徐永霞，米紅波，勵(lì)建榮,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧省高等學(xué)校生鮮食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，遼寧 錦州 121013；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3.遼寧安井食品有限公司，遼寧 鞍山 114100）

冷凍魚(yú)糜，又稱(chēng)生魚(yú)糜，是指在采肉、漂洗、精濾之后的魚(yú)肉中加入抗凍劑，再經(jīng)攪拌均勻后凍結(jié)的魚(yú)肉。隨著淡水魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量的增加以及海洋漁業(yè)資源的不斷減少，淡水魚(yú)逐漸成為加工魚(yú)糜的主要原料之一。2016年，全國(guó)魚(yú)糜制品總產(chǎn)量達(dá)到155.36萬(wàn) t[1]，其中鰱魚(yú)作為我國(guó)年產(chǎn)量?jī)H次于草魚(yú)的第二大魚(yú)類(lèi)，具有肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、繁殖迅速、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，因此逐漸受到了水產(chǎn)品加工企業(yè)的青睞[2]。

冷凍貯藏是目前保存魚(yú)糜最常用的方法[3]，抗凍劑的添加是為了防止和延緩凍藏過(guò)程中魚(yú)糜肌原纖維蛋白的變性，從而延長(zhǎng)魚(yú)糜的貯藏期。商業(yè)上常用的抗凍劑是蔗糖和山梨醇的混合物，盡管二者抑制魚(yú)肉蛋白冷凍變性的效果顯著，但其高甜、高熱量的特性影響了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，低糖低熱量的新型抗凍劑的研究逐漸成為一種趨勢(shì)。

現(xiàn)階段新型抗凍劑種類(lèi)繁多，糖是其中的一大類(lèi)，糖類(lèi)的冷凍保護(hù)機(jī)制可能有以下3 種：一是在冷凍體系中形成的玻璃體，抑制了蛋白的聚集；二是與蛋白質(zhì)分子周?chē)乃肿觾?yōu)先結(jié)合；三是與蛋白質(zhì)分子氫鍵的結(jié)合[4]。專(zhuān)家學(xué)者對(duì)糖類(lèi)抗凍劑進(jìn)行的研究表明，海藻糖能抑制草魚(yú)魚(yú)糜蛋白在冷凍過(guò)程中的變性，延緩魚(yú)糜凍藏品質(zhì)的下降，同時(shí)對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白也具有一定的抗凍效果[5-6]。

菊粉是一種可溶性的膳食纖維，它是果糖通過(guò)β-2,1糖苷鍵聚合而成的線(xiàn)性直鏈多糖，其分子末端連接一個(gè)葡萄糖殘基，聚合度在2～60之間，易溶于水，略帶甜味，甜度只有蔗糖的30%～40%[7]。菊粉作為食品和營(yíng)養(yǎng)的增補(bǔ)劑，被用于各種食品中，具有改善質(zhì)構(gòu)、減少熱量等作用，它可以代替脂肪和糖類(lèi)，成為低卡路里的填充劑，也可以作為一種保水劑[8]。除此之外，菊粉可作為蛋白保護(hù)劑[9]，減少蛋白質(zhì)的變性，而且在凍藏過(guò)程中起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用，還可能起到減少冰晶生成的作用[10-11]，如菊粉可作為菌種保藏抗凍劑的主要成分之一，用于對(duì)細(xì)胞和蛋白的保護(hù)[12]。菊粉與蔗糖、果糖等大多數(shù)糖類(lèi)抗凍劑不同，它是不易消化的碳水化合物，因此，對(duì)血糖的影響極小，適合糖尿病患者使用；另外，菊粉在冷凍干燥過(guò)程中穩(wěn)定蛋白質(zhì)的能力比海藻糖更好[13]。本實(shí)驗(yàn)將菊粉加入冷凍鰱魚(yú)魚(yú)糜中，旨在探究菊粉對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜蛋白在凍藏過(guò)程中的保護(hù)作用，以期尋找一種低糖低熱量的抗凍保護(hù)劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚(yú) 錦州市水產(chǎn)市場(chǎng)；菊粉（食品級(jí)，平均聚合度26） 陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；食鹽錦州市大潤(rùn)發(fā)超市；蔗糖、山梨醇（食品級(jí)） 河南中泰食化有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、Tris、氯化鉀、鹽酸、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、尿素、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、8-苯胺基-1-萘磺酸銨（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS）（均為分析純） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；ATP酶測(cè)試盒 南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YC200采肉機(jī)和精濾機(jī) 諸城市凱成良才食品機(jī)械廠(chǎng)；T78-90櫻花牌脫水機(jī) 慈溪櫻花電器有限公司；ZB-20型數(shù)顯恒溫水浴鍋 諸城市瑞恒食品機(jī)械廠(chǎng)；AF-10全自動(dòng)雪花制冰機(jī) 斯科茨曼制冰機(jī)系統(tǒng)（上海）有限公司；MS105DU分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IKA-T25均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司；SORVALL STRATOS型冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；精密pH計(jì) 美國(guó)Mettler-Toledo公司；UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；970CRT熒光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

新鮮鰱魚(yú)→前處理（去頭、去鱗、去內(nèi)臟）→采肉→用清水漂洗2 次→0.15%鹽水漂洗1 次→脫水（控制水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78%）→精濾→空斬得鰱魚(yú)魚(yú)糜

將鰱魚(yú)魚(yú)糜按抗凍劑的添加分為6 組，分別為：空白組（0%菊粉）、添加0.5%菊粉、添加1.0%菊粉、添加1.5%菊粉、添加2.0%菊粉和添加商業(yè)抗凍劑（4.0%蔗糖＋4.0%山梨醇）。將各組樣品凍藏于－18 ℃條件下，定期取樣測(cè)定指標(biāo)。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

根據(jù)Kunihiko等[14]的方法稍作修改。稱(chēng)取20 g魚(yú)糜，加入5 倍體積的含0.1 mol/L KCl的20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）提取液，6 000 r/min勻漿，每勻漿30 s停30 s，重復(fù)5 次，整個(gè)勻漿過(guò)程混合液置于冰浴中。勻漿液于4 ℃、10 000×g離心20 min，去除上清液，沉淀再用5 倍上述提取液重復(fù)3 次。最后得到的沉淀用0.6 mol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 7）提取液溶解，勻漿后于4 ℃靜置提取1 h，離心得到上清液，即為肌原纖維蛋白溶液。

1.3.3 鹽溶性蛋白含量的測(cè)定

根據(jù)Xiong Guangquan等[15]的方法稍作修改。提取不同凍藏時(shí)間的肌原纖維蛋白，將其用蒸餾水稀釋至2 mg/mL，在4 ℃、5 000×g離心15 min，取上清液，測(cè)定其質(zhì)量濃度。鹽溶性蛋白含量為提取的不同凍藏時(shí)間肌原纖維蛋白離心后上清液的蛋白質(zhì)量濃度和初始肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度的比值，按照下式計(jì)算：

1.3.4 Ca2＋-ATPase活性的測(cè)定

將提取出來(lái)的肌原纖維蛋白溶液用0.6 mol/L、pH 7.0的KCl溶液稀釋至5 mg/mL后，采用ATP酶測(cè)試盒測(cè)定。150 μL肌原纖維蛋白（5 mg/mL）與試劑盒試劑混合后37 ℃反應(yīng)10 min，再通過(guò)試劑盒試劑終止反應(yīng)，將混合液3 500×g離心5 min后取上清液，取150 μL上清液與試劑盒試劑混合后45 ℃反應(yīng)20 min，取出冷卻至室溫，660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。肌原纖維蛋白Ca2＋-ATPase活性表示為單位時(shí)間內(nèi)單位蛋白質(zhì)釋放的無(wú)機(jī)磷物質(zhì)的量，單位μmol/（mg·min）。

1.3.5 總巰基和活性巰基含量的測(cè)定

根據(jù)Zhou Aimei等[16]的方法稍作修改。提取出的肌原纖維蛋白溶液用0.6 mol/L、pH 7.0的KCl稀釋至5 mg/mL。總巰基的測(cè)定：取此溶液0.5 mL，加入4.5 mL 0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH 6.8，含8 mol/L尿素、2% SDS和10 mmo1/L EDTA），混勻后取4 mL加入0.4 mL 0.1%的DTNB溶液（0.2 mol/L Tris-HCl，pH 6.8），在40 ℃反應(yīng)25 min后用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于412 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，用0.6 mol/L、pH 7.0的KCl溶液同時(shí)做一空白實(shí)驗(yàn)。活性巰基的測(cè)定在不添加尿素的情況下進(jìn)行?？値€基含量和活性巰基以蛋白質(zhì)計(jì)，單位mo1/105g，其中分子消光系數(shù)取13 600 L/（mol·cm）。

1.3.6 表面疏水性的測(cè)定

根據(jù)Benjakul等[17]的方法稍作修改。將提取出的肌原纖維蛋白以10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0，含0.6 mol/L NaCl）稀釋成0、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL系列質(zhì)量濃度，體積均為4 mL，在20 ℃水浴10 min，加入20 μL 8 mmol/L ANS的0.1 mol/L磷酸鹽溶液（pH 7.0），反應(yīng)完后在激發(fā)波長(zhǎng)374 nm、發(fā)射波長(zhǎng)485 nm條件下，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度，表面疏水性以熒光強(qiáng)度與肌動(dòng)球蛋白質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的曲線(xiàn)斜率表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析處理，利用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊粉對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜鹽溶性蛋白含量的影響

肌原纖維蛋白是一種鹽溶性蛋白，其含量是蛋白質(zhì)變性的一個(gè)重要指標(biāo)，反映了肌球蛋白桿部的變化趨勢(shì)。在凍藏過(guò)程中，肌原纖維蛋白變性會(huì)導(dǎo)致氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵和離子相互作用的形成，從而其鹽溶性會(huì)下降[18-19]。

圖1 添加菊粉的鰱魚(yú)魚(yú)糜鹽溶性蛋白含量的變化Fig. 1 Change in salt extractable protein content of sliver carp surimi with added inulin

由圖1可知，空白組、添加商業(yè)抗凍劑和不同比例菊粉的實(shí)驗(yàn)組在凍藏5 周過(guò)程中鹽溶性蛋白含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，凍藏5 周后，添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%菊粉實(shí)驗(yàn)組和添加商業(yè)抗凍劑實(shí)驗(yàn)組的鹽溶性蛋白含量分別下降了54.91%、45.16%、33.88%、27.18%、36.08%和22.98%，其中空白組的下降幅度最大，添加商業(yè)抗凍劑后下降幅度最小，添加1.5%菊粉實(shí)驗(yàn)組較不添加和添加其他比例菊粉的鹽溶性蛋白含量下降程度小。添加2%菊粉實(shí)驗(yàn)組的抗凍效果開(kāi)始下降，原因可能是添加過(guò)量的菊粉等糖類(lèi)抗凍劑，使抗凍劑和蛋白質(zhì)的比例過(guò)高，導(dǎo)致抗凍劑的結(jié)晶和失穩(wěn)，消除了其對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用[20]。米順利等[21]研究表明，海藻糖也能夠明顯抑制羅非魚(yú)魚(yú)糜鹽溶性蛋白在凍藏過(guò)程中的降低。Zhou Aimei等[22]實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在25 周的凍藏過(guò)程中，8%的海藻糖控制鹽溶性蛋白下降的效果比商業(yè)抗凍劑要好。由此可知，雖然各組樣品在凍藏期間均出現(xiàn)了蛋白質(zhì)的冷凍變性，但是1.5%菊粉能較好的抑制鹽溶性蛋白含量的下降，具有一定的抗凍性。

2.2 菊粉對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白Ca2＋-ATPase活性的影響

魚(yú)肉肌球蛋白頭部具有Ca2＋-ATP活性，可以反映肌球蛋白的完整性，也被廣泛地作為反映魚(yú)肉或魚(yú)糜蛋白變性的常用指標(biāo)之一[23]。魚(yú)肉在凍藏過(guò)程中，蛋白中氫鍵、疏水鍵、二硫鍵和離子鍵的改變會(huì)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)變化，尤其是肌球蛋白頭部，從而使蛋白固有的酶活性降低[24]。

由圖2可知，空白組、添加商業(yè)抗凍劑和不同比例菊粉的實(shí)驗(yàn)組在凍藏5 周過(guò)程中肌原纖維蛋白Ca2＋-ATPase活性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，凍藏5 周后，添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%菊粉實(shí)驗(yàn)組和添加商業(yè)抗凍劑實(shí)驗(yàn)組的Ca2＋-ATPase活性分別下降了87.13%、77.81%、65.83%、63.02%、75.00%和58.43%，其中空白組的下降速度最快，添加商業(yè)抗凍劑實(shí)驗(yàn)組下降速度最慢，添加1.5%菊粉實(shí)驗(yàn)組的Ca2＋-ATPase活性比不添加和添加其他比例菊粉實(shí)驗(yàn)組的下降速度慢。其他學(xué)者也得到了相似的結(jié)論，劉安軍等[25]研究發(fā)現(xiàn)，4%聚葡萄糖作為抗凍劑可以明顯抑制鳙魚(yú)魚(yú)糜的肌原纖維蛋白Ca2＋-ATPase活性的下降。Xiong Guangquan等[15]研究表明1%的魔芋葡甘聚糖可以減輕Ca2＋-ATPase活性的降低，對(duì)草魚(yú)肌原纖維蛋白有較好的冷凍保護(hù)作用。凍藏過(guò)程中，冰晶的形成會(huì)改變肌球蛋白的頭部結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致Ca2＋-ATPase活性降低，菊粉等糖類(lèi)抗凍劑會(huì)使冰晶的形成受阻，從而降低Ca2＋-ATP活性的下降程度[26]。由上述結(jié)果可知，不同比例的菊粉作為糖類(lèi)抗凍劑均能起到抑制Ca2＋-ATPase活性降低的作用，其中1.5%的菊粉效果更明顯，效果更接近商業(yè)抗凍劑。

圖2 添加菊粉的鰱魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白Ca -ATPase活性的變化Fig. 2 Change in Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein from sliver carp surimi with added inulin

2.3 菊粉對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量的影響

巰基作為肌原纖維蛋白中最具反應(yīng)活性的功能基團(tuán)[27]，其數(shù)量對(duì)于蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定至關(guān)重要?？値€基包括活性巰基和隱藏的巰基，分別存在于肌球蛋白頭部和輕鏈酶解肌球蛋白部分[28]，也有一部分隱藏于肌球蛋白內(nèi)部。在凍藏或凍融過(guò)程中，蛋白結(jié)構(gòu)變化會(huì)導(dǎo)致巰基的位置發(fā)生改變，埋藏在蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部的巰基可能暴露于蛋白表面，半胱氨酸上的巰基發(fā)生氧化或二硫鍵的交換反應(yīng)導(dǎo)致二硫鍵的形成[29]，活性巰基更易氧化成二硫鍵，因此蛋白質(zhì)冷凍變性往往會(huì)使其總巰基和活性巰基的含量減少。

圖3 添加菊粉的鰱魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白總巰基含量的變化Fig. 3 Change in total sulfhydryl content of myofibrillar protein from sliver carp surimi with added inulin

由圖3可知，空白組、添加商業(yè)抗凍劑和不同比例菊粉的實(shí)驗(yàn)組在凍藏5 周過(guò)程中總巰基含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，凍藏5 周后，添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%菊粉實(shí)驗(yàn)組和添加商業(yè)抗凍劑實(shí)驗(yàn)組的總巰基分別下降了61.06%、47.91%、37.53%、33.96%、38.74%和31.09%。

圖4 添加菊粉的鰱魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白活性巰基含量的變化Fig. 4 Change in surface-reactive sulfhydryl content of myofibrillar protein from sliver carp surimi with added inulin

圖4 表明，活性巰基呈現(xiàn)總巰基相同的變化趨勢(shì)，凍藏5 周后，實(shí)驗(yàn)組的活性巰基分別下降了61.65%、39.50%、37.84%、33.79%、39.26%和30.22%。王寧等[30]研究表明海藻糖可以抑制大黃花魚(yú)肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基的下降，Nopianti等[31]也發(fā)現(xiàn)聚葡萄糖對(duì)金線(xiàn)魚(yú)的總巰基和活性巰基有抑制下降的作用。在凍藏過(guò)程中，形成的冰晶會(huì)使肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，埋藏在分子內(nèi)部的巰基暴露，被氧化形成二硫鍵，導(dǎo)致巰基的減少，菊粉等糖類(lèi)抗凍劑對(duì)冰晶的形成有抑制作用，降低了巰基的下降速度，與圖2的Ca2＋-ATPase活性的變化趨勢(shì)相同[32]。從總巰基和活性巰基含量的變化情況可知，菊粉能有效抑制總巰基和活性巰基含量的下降，其中1.5%菊粉的抗凍效果優(yōu)良，能很大程度上抑制蛋白質(zhì)的變性，起到保護(hù)肌原纖維蛋白的作用。

2.4 菊粉對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性可以有效地反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的微小變化。新鮮魚(yú)糜蛋白的疏水性氨基酸殘基一般位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，具有較低的表面疏水性，而在凍藏過(guò)程中，蛋白質(zhì)可因變性而發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)化，使原先位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露并發(fā)生氧化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性增加[33-34]。

由圖5可知，空白組、添加商業(yè)抗凍劑和不同比例菊粉的實(shí)驗(yàn)組在凍藏5 周過(guò)程中表面疏水性均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，凍藏5 周后，添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%菊粉實(shí)驗(yàn)組和添加商業(yè)抗凍劑實(shí)驗(yàn)組的表面疏水性分別上升了844.78%、810.28%、665.11%、605.67%、740.07%和542.74%。上述結(jié)果表明，添加抗凍劑后，凍藏鰱魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白表面疏水性的增加得到明顯的抑制，周愛(ài)梅等[35]研究表明，8%海藻糖和8%聚葡萄糖也能抑制鯪魚(yú)魚(yú)糜蛋白表面疏水性，具有一定的抗凍性。本實(shí)驗(yàn)中，菊粉對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白保護(hù)效果較好，可能是因?yàn)榫辗鄣忍穷?lèi)抗凍劑通過(guò)與蛋白質(zhì)反應(yīng)基結(jié)合，使處于飽和狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子難以聚集變性；另一方面，糖類(lèi)抗凍劑含有的游離羥基，與水分子結(jié)合，導(dǎo)致“共晶點(diǎn)”溫度的降低，減緩冰晶的形成[36-37]。由此可知，菊粉等糖類(lèi)抗凍劑的加入可在很大程度上穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)，在添加不同比例的菊粉實(shí)驗(yàn)中，1.5%的菊粉最能起到商業(yè)抗凍劑類(lèi)似的效果。

圖5 添加菊粉的鰱魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白表面疏水性的變化Fig. 5 Change in surface hydrophobicity of myofibrillar protein from sliver carp surimi with added inulin

3 結(jié) 論

1.5 %菊粉對(duì)凍藏的鰱魚(yú)魚(yú)糜能起到較好的抗凍效果，凍藏5 周后，其鹽溶蛋白含量、Ca2＋-ATPase活性、總巰基含量和活性巰基含量分別下降了27.18%、63.02%、33.96%、33.79%；表面疏水性上升了263.89。商業(yè)抗凍劑的鹽溶蛋白含量、Ca2＋-ATPase活性、總巰基含量和活性巰基含量分別下降了22.98%、58.43%、31.09%和30.22%，表面疏水性上升了236.47。1.5%菊粉效果更接近商業(yè)抗凍劑，可作為一種低熱低甜度的新型抗凍劑進(jìn)行下一步的開(kāi)發(fā)。