花青素共價交聯(lián)大豆蛋白對其結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)吸收特性的影響

劉英杰，蔣 悅，黃 國，王 寧，劉春峰，王天雪，李 婧，劉貴辰，隋曉楠，江連洲*

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

蛋白質(zhì)是一種具有特定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子，含有20 種不同的氨基酸，是人體必需的重要營養(yǎng)成分之一。一直以來，人們?nèi)粘z入蛋白質(zhì)的來源主要是動物蛋白和植物蛋白。然而，近年來動物蛋白在人們膳食中的利用越來越受到研究學者們的質(zhì)疑，研究表明無論從環(huán)境保護、飲食可持續(xù)發(fā)展還是人類健康角度出發(fā)，人類飲食中植物蛋白代替動物蛋白都是一個明智的選擇[1-4]。大豆蛋白作為一種重要的全價蛋白，其成本低廉，營養(yǎng)豐富，是為數(shù)不多可替代動物蛋白的優(yōu)質(zhì)植物蛋白[5]。

除植物蛋白外，多酚類物質(zhì)也是人們?nèi)粘ｏ嬍持兄匾臓I養(yǎng)成分[6]?；ㄇ嗨厥且环N常見的水溶性類黃酮物質(zhì)，屬于多酚，其廣泛存在于蔬菜、水果、谷物及飲料等食物中，具有抗氧化、抗病菌、增強免疫力、抗炎癥的生理活性[7-10]。

多酚類物質(zhì)分子比較小，對蛋白具有天然的親和力，可與蛋白發(fā)生非共價（疏水相互作用、氫鍵、離子作用等）或共價互作。共價互作一般發(fā)生在堿性條件或多酚氧化酶存在條件下，多酚被氧化成醌后，可與蛋白多肽鏈上的氨基酸殘基生成穩(wěn)定的化學鍵（C—N/C—S鍵）進而形成蛋白-多酚共價復合物。食品中蛋白與多酚的相互作用會不可避免的影響食品的口感，功能及吸收等特性[11-12]。因此，對蛋白與多酚互作的充分探究有益于實現(xiàn)蛋白在食品中的最大利用價值。

已經(jīng)有部分文獻對蛋白與多酚的共價互作進行探究，例如牛血清白蛋白與槲皮素[13]、明膠與兒茶素[14-15]、牛血清白蛋白與兒茶素[16]、牛奶蛋白與類黃酮[17]、綠原酸與α-乳白蛋白[18]等。研究表明多酚對蛋白的共價交聯(lián)會影響蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及營養(yǎng)特性。但是不同種類的多酚對不同種類蛋白特性的影響有差異，且同一食品基質(zhì)中，多酚與蛋白的不同共價交聯(lián)方式也會不同程度地影響蛋白特性[19]。目前本課題組已經(jīng)對花青素與SPI在堿性條件下交聯(lián)的共價復合物進行了部分結(jié)構(gòu)和功能的探究[7,20-21]，但是關(guān)于花青素與SPI共價復合物在人體消化中的功能性及營養(yǎng)性的研究尚存不足，兩者共價復合物的濃度與其分子結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)吸收特性的規(guī)律也沒有得到明確解析，花青素與SPI的不同共價交聯(lián)條件（堿性或多酚氧化酶）對其復合物相關(guān)性質(zhì)影響的探究更是留有空白。

由此，本實驗選用不同質(zhì)量濃度的花青素與SPI分別在不同共價交聯(lián)條件（堿性或漆酶）下互作以形成花青素-SPI共價復合物，并將之進行體外模擬胃腸消化，后用Caco-2細胞模型對其腸道消化產(chǎn)物進行模擬人體小腸吸收，進而探究花青素共價交聯(lián)后的SPI分子結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)吸收特性。本研究為花青素與SPI復合產(chǎn)品在食品中的合理應(yīng)用研究提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花青素黑米提取物 中國山西天之潤生物科技有限公司；大豆 市售；大豆分離蛋白由實驗室自制；漆酶河北仟盛生物科技有限公司；豬膽鹽 北京索萊寶科技有限公司；甲酸、乙腈（均為色譜純）、胃蛋白酶（600 U/mg）、胰液素、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 美國Sigma公司；正己烷、乙酸乙酯、甲醇、鄰苯二甲醛（o-phthalaldhyde，OPA）、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸銨北京新光化工試劑廠；Caco-2細胞 美國ATCC生物生物標準品資源中心；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基 美國Gibco BRL公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-25MS超速高速冷凍離心機 上海盛析儀器設(shè)備有限公司；恒溫水浴振蕩搖床 常州恩培儀器制造有限公司；WAT023635高效液相色譜儀 美國Waters公司；Sunfire C18反向色譜柱（250 mm×4.6 mm）美國Waters公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海皖寧精密科學儀器有限公司；F-4500型熒光分光光度計 日本Hitachi公司；PHS-25型酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司；Tecan Infinite 200 Pro酶標儀 瑞士帝肯公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

參考Wu Longkun等[22]的制備方法。將脫脂豆粉溶解于去離子水（1∶20（g/mL））后，用2 mol/L的NaOH溶液將混合溶液的pH值調(diào)節(jié)至8并攪拌2 h。將其懸浮液離心30 min（4 ℃、10 000×g）后取上清液，用2 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5后靜置1 h。將混合物離心20 min（4 ℃、6 000×g）得到蛋白沉淀，用去離子水水洗沉淀3 次后溶解，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH值中性，將此中性蛋白溶液冷凍干燥后即可得到SPI。

1.3.2 花青素的提純與定量

參考Sui Xiaonan等[23]的方法，將花青素黑米提取物按照1∶100（g/mL）比例溶解于去離子水中，減壓抽濾。收集濾液并對其進行固相萃取，參考以下程序：將濾液、2 倍柱體積的酸化水、2 倍柱體積的乙酸乙酯溶液、4 倍柱體積酸化的甲醇溶液依次通過固相萃取柱。收集此花青素甲醇溶液，對其進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇后即可得到花青素純化物。花青素純化物在520 nm波長處用高效液相色譜進行定量。梯度洗脫條件根據(jù)Sui Xiaonan等[23]的方法，流量為1 mL/min，溫度為25 ℃。同時本實驗統(tǒng)一使用矢車菊素-3-葡萄糖苷（花青素黑米提取物中主要成分）質(zhì)量濃度為花青素質(zhì)量濃度。

1.3.3 花青素與SPI共價復合物的制備

參考Prigent等[18]的方法并稍作修改。將SPI粉末以1∶100（g/mL）比例溶解于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7）中，添加不同質(zhì)量濃度（0.17、0.25、0.5 g/L）的花青素后，加入漆酶（0.2 U/mL）避光攪拌24 h，并依次標記為LC1、LC2、LC3。

參照Rohn等[24]的方法，將SPI粉末以1∶100（g/mL）比例溶解于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中，添加不同質(zhì)量濃度（0.17、0.25、0.5 g/L）的花青素后，調(diào)節(jié)溶液pH值至9.0后避光攪拌24 h，并依次標記為AC1、AC2、AC3。將反應(yīng)后的6 組樣品透析48 h（截留分子質(zhì)量8～10 kDa），并隔8 h換水一次。凍干透析袋內(nèi)樣品后即可得花青素-SPI共價復合物。

1.3.4 三維熒光光譜分析

將SPI和花青素-SPI共價復合物溶解于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL。取樣品分別置于石英比色皿中測定。其中，以200 nm為起始激發(fā)波長，200～500 nm為連續(xù)掃描記錄發(fā)射波長；增長間隔10 nm，掃描曲線16 條。

1.3.5 體外模擬胃腸消化及消化產(chǎn)物水解度的測定

參考Minekus等[25]的方法稍作修改后對SPI及6 組共價復合物進行體外模擬胃腸消化。將樣品分別溶于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其蛋白含量為50 mg/mL。取樣品溶液與模擬胃環(huán)境的電解質(zhì)溶液（6.9 mmol/L KCl、0.9 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3、47.2 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2·6H2O和0.5 mmol/L(NH4)2CO3）等體積混合后，加入0.3 mol/L CaCl2·2H2O。隨后添加一定質(zhì)量的胃蛋白酶（600 U/mg），使最終消化液中蛋白酶達2 000 U/mL，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)混合液pH值至3，上述樣品溶液及試劑在混合前均需在37 ℃條件下預(yù)熱30 min。將配制好的混合液置于水浴振蕩搖床中（37 ℃、170 r/min）進行胃部消化反應(yīng)，2 h后用0.5 mol/L NaHCO3溶液將消化液pH值調(diào)至中性后結(jié)束胃部消化，期間實時監(jiān)控pH值為3。胃部消化反應(yīng)結(jié)束后取一定量的消化產(chǎn)物離心取上清液，進行蛋白質(zhì)水解度測定。

取一定體積的胃部消化產(chǎn)物溶液與模擬腸部環(huán)境的電解質(zhì)溶液（6.8 mmol/L KCl、0.8 mmol/L KH2PO4、85 mmol/L NaHCO3、38.4 mmol/L NaCl和0.33 mmol/L MgCl2·6H2O）以1∶1的比例混合，加入0.3 mol/L CaCl2·2H2O和160 mmol/L的豬膽鹽。隨后添加一定質(zhì)量的胰液素，使最終消化液中胰蛋白酶達100 U/mL，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH值至7，將其置于水浴振蕩搖床中（37 ℃，170 r/min）進行小腸消化反應(yīng)。模擬小腸消化過程中，分別于30、60、90、120、150 min和180 min處進行抽樣檢測蛋白水解度，各消化終點處采用0 ℃冰浴30 min以結(jié)束小腸消化，期間實時監(jiān)控pH值為7。180 min反應(yīng)結(jié)束后的消化液高速離心取上清液，冷凍干燥得最終消化產(chǎn)物粉末。

1.3.6 蛋白水解度的測定

參考Nielsen等[26]的方法，取一定量的樣品溶于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其含量為10 mg/mL。然后取50 mg絲氨酸標準品溶于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其濃度為0.951 6 meqv/L（式（1）），以此得到絲氨酸標準液。將400 μL的絲氨酸標準液、樣品溶液和PBS（空白）與3 mL OPA試劑混合，2 min后用可見光分光度計在340 nm波長處測定其吸光度。根據(jù)以下公式進行水解度計算：

式中：Serine-NH2為每克蛋白絲氨酸氨基物質(zhì)的量/（mmol/g）；X為樣品質(zhì)量/g；P為樣品中的蛋白含量/%；0.1為樣品體積/L；α=0.97 meqv/g；β=0.342；htot=7.80；DH為水解度/%。

1.3.7 蛋白多肽濃度的測定

參考Zhu Chaozhi等[27]的方法。稱取80 mg OPA溶解于2 mL甲醇中，將其完全溶解后與50 mL四硼酸鈉（100 mmol/L）溶液，1 mL的β-巰基乙醇及5 mL，20%的十二烷基硫酸鈉溶液混合得到OPA試劑。隨后將最終消化產(chǎn)物粉末溶解于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其消化產(chǎn)物含量為0.5 mg/mL。取200 μL的消化產(chǎn)物溶液或梯度質(zhì)量濃度的酪蛋白胰蛋白胨溶液（0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/μL）與4 mL的OPA試劑混合，2 min后取其混合液在340 nm波長處測定吸光度，其中以PBS溶液為空白。根據(jù)酪蛋白胰蛋白胨溶液標準曲線計算消化產(chǎn)物多肽濃度。

1.3.8 DPPH法抗氧化能力的測定

參考Sui Xiaonan等[28]的方法并稍作修改。將SPI、花青素-SPI共價復合物，最終消化產(chǎn)物粉末及不同濃度的Trolox分別溶于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其質(zhì)量濃度為5 mg/mL，取配制好的樣品溶液100 μL與100 μL的DPPH溶液混合，黑暗條件下放置30 min后在517 nm波長處用酶標儀測定吸光度。其中以PBS溶液為空白，以Trolox當量（nmol/mg）計算樣品抗氧化的能力（以吸光度（y）和Trolox濃度（x）制作標準曲線，得到回歸方程：y=－49.209x＋0.074 5，R2=0.99）。

1.3.9 ABTS法抗氧化能力的測定

參考Sui Xiaonan等[28]的方法并稍作修改。稱取0.38 g ABTS和0.067 g過硫酸鉀溶解于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中，混合后黑暗條件下放置12～16 h得到ABTS儲備溶液。將ABTS儲備溶液用0.01 mol/L PBS（pH 7.0）稀釋至在734 nm波長處吸光度讀數(shù)為0.70±0.02后，與上述DPPH測定時的樣品溶液等體積混合，黑暗條件下放置7 min。隨后在734 nm波長處用酶標儀測定吸光度。其中以PBS溶液為空白，以Trolox當量（nmol/mg）計算樣品抗氧化的能力（y=－178.34x＋0.325 2，R2=0.99）。

1.3.10 跨上皮細胞運輸及多肽滲透率的測定

參考Zhang Qiaozhi等[29]的方法，Caco-2細胞采用DMEM完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、100 U/mL青霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺和100 μg/mL鏈霉素）于25 cm2帶蓋透氣斜口培養(yǎng)瓶中，在無菌培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）孵育。對數(shù)期生長的細胞通過胰蛋白酶消化法（0.5%胰蛋白酶和0.05% EDTA）傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基每隔1 d更換1 次。實驗中使用的細胞介于傳代20～30之間。

對于樣品跨上皮細胞運輸實驗，Caco-2細胞密度達到4.5×105cells/cm2接種于6 孔細胞養(yǎng)板中，培養(yǎng)基每隔1 d更換1 次。4 d后單層Caco-2細胞融合，分化21 d后選取電阻值高于300 Ω·cm2的Caco-2單層細胞用于跨上皮細胞運輸實驗。在實驗之前，期間和之后需檢查單層的完整性，電阻值在300 Ω·cm2附近保持穩(wěn)定，并且在與樣品孵育后未觀察到減少的細胞即為合格細胞。用Hank's平衡鹽溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS）沖洗選擇的Caco-2單層細胞兩次，并進一步在37 ℃用HBSS平衡30 min。隨后取出Caco-2單層細胞，取1.5 mL HBSS置于細胞下室，將最終消化產(chǎn)物粉末溶于HBSS中使其質(zhì)量濃度為1 mg/mL并取0.5 mL置于細胞上室，同等體積的HBSS代替最終消化產(chǎn)物溶液作為空白。Caco-2單層細胞在37 ℃和5% CO2條件下孵育2 h后。測量細胞上室和下室的多肽濃度，多肽滲透率的計算參考公式（4）：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

每組數(shù)據(jù)重復3 次，利用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)作圖。利用SPSS 22.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析及相關(guān)性分析（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 三維熒光光譜分析

圖1 SPI和花青素-SPI共價復合物的三維熒光光譜圖Fig. 1 Three dimensional fluorescence spectra of SPI and anthocyanins-SPI conjugates

三維熒光光譜是一種研究蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的有效手段[30]。圖1展示了SPI和花青素-SPI共價復合物的三維熒光光譜圖。圖中峰a（λex= λem）表示拉曼散射，峰b（λem= 2λex）表示瑞利散射[23]。峰1（λex= 280 nm，λem= 340 nm）主要表示色氨酸和酪氨酸產(chǎn)生的特征峰[23]，如圖1所示，花青素共價交聯(lián)SPI后使蛋白峰1處的熒光值下降，且同一交聯(lián)條件下，添加的花青素質(zhì)量濃度與蛋白峰1處的熒光值呈反比。而在同一花青素質(zhì)量濃度下，漆酶條件交聯(lián)的花青素-SPI共價復合物比堿性交聯(lián)的復合物在峰1處的熒光值更低。這表明花青素與SPI在漆酶條件或堿性條件下可發(fā)生相互作用，且花青素質(zhì)量濃度越大，兩者的相互作用越強；但是花青素質(zhì)量濃度相同時，漆酶條件對花青素與SPI的促交聯(lián)能力強于堿性條件。SPI在峰1處熒光值下降的原因主要是在漆酶或堿性條件下，花青素可被氧化成醌，醌類物質(zhì)可與蛋白多肽鏈上的色氨酸或酪氨酸殘基發(fā)生親核反應(yīng)，從而使蛋白色氨酸或酪氨酸處的熒光值下降[31]。相似的研究結(jié)果在乳鐵蛋白與綠原酸的共價交聯(lián)中也被發(fā)現(xiàn)[32]。此外，圖中峰2（λex= 230 nm，λem= 350 nm）主要代表了多肽鏈骨架結(jié)構(gòu)的特征峰[23]。花青素對SPI共價交聯(lián)后，蛋白峰2處的熒光值降低，這表明花青素使SPI多肽鏈發(fā)生解折疊從而改變了蛋白的三級結(jié)構(gòu)[33]。同時，由于SPI的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使蛋白的色氨酸殘基暴露于親水環(huán)境中，從而致使蛋白色氨酸處的熒光值下降，這可能是峰1處熒光值降低的另一個原因。

2.2 水解度分析

圖2 SPI和花青素-SPI共價復合物的體外消化水解度Fig. 2 In vitro digestibility of SPI and anthocyanins-SPI conjugates

SPI和花青素-SPI共價復合物在體外模擬胃腸消化過程中的消化性可用蛋白的水解度表示。如圖2所示，所有樣品的水解度隨消化時間的延長而增大，并在模擬小腸消化后期趨于穩(wěn)定，這主要是因為隨消化時間的延長，樣品底物濃度增大，酶活減小，消化物經(jīng)初始階段積累逐漸趨于恒定等原因造成的[34]。由圖2可知，花青素對SPI共價交聯(lián)使得蛋白在胃腸消化階段的水解度上升，隨著花青素質(zhì)量濃度的增大，SPI的水解度不斷升高。尤其是在漆酶條件下，蛋白水解度遠高于堿性條件下交聯(lián)同質(zhì)量濃度花青素的SPI和天然SPI的水解度。這可能是由于花青素與SPI的共價交聯(lián)改變了蛋白的結(jié)構(gòu)，使得蛋白暴露出更多可以被胃蛋白酶或胰蛋白酶水解的位點，從而使得在模擬胃腸消化期間，花青素交聯(lián)的蛋白水解度增高[35]。

2.3 DPPH法抗氧化能力分析

DPPH法測定樣品的抗氧化性是一種常用的方法[12]。圖3顯示了SPI和花青素-SPI共價復合物在體外模擬胃腸消化前后的抗氧化性。通過DPPH法測定可知，花青素對SPI的共價交聯(lián)提高了SPI的抗氧化能力，同一交聯(lián)條件下，花青素-SPI共價復合物的抗氧化能力與花青素的濃度呈正比。就漆酶條件而言，LC1、LC2、LC3的抗氧化能力分別比AC1、AC2、AC3高了9.9%、32.69%、3.29%。眾所周知，花青素具有抗氧化能力[28]，因此花青素-SPI抗氧化能力的增加可歸因于花青素賦予蛋白的抗氧化能力。而同等花青素質(zhì)量濃度時，漆酶條件下的花青素-SPI共價復合物抗氧化能力要高于堿性條件下的復合物，這可能由于漆酶對花青素與SPI的促交聯(lián)能力要高于堿性條件，因此漆酶條件下添加同質(zhì)量濃度的花青素到SPI時，真正結(jié)合在蛋白上的花青素醌數(shù)量要多余堿性條件下結(jié)合在SPI上的醌。同樣，Ali等[12]在堿性條件和多酚氧化酶存在條件下對β-乳球蛋白和咖啡酸進行共價交聯(lián)，然后對β-乳球蛋白和β-乳球蛋白-咖啡酸共價復合物用DPPH進行抗氧化能力的測定。結(jié)果表明：β-乳球蛋白中咖啡酸的引入提高了β-乳球蛋白的抗氧化能力，且多酚氧化酶條件下的共價復合物抗氧化能力要高于堿法條件下的復合物。

圖3 SPI和花青素-SPI共價復合物消化前后的抗氧化性（DPPH法）Fig. 3 Antioxidant capacity of SPI and anthocyanins-SPI conjugates before and after digestion as measured by DPPH radical scavenging assay

從圖3還可看出，無論是天然SPI還是經(jīng)花青素共價交聯(lián)后的SPI，經(jīng)過胃腸消化后，抗氧化能力都得到提高。這可能要歸因于蛋白在消化過程中產(chǎn)生了具有抗氧化性的肽。同樣的結(jié)果在Rohn等[13]對牛血清白蛋白結(jié)合槲皮素的研究中被發(fā)現(xiàn)，其研究表明，消化后的牛血清白蛋白-槲皮素共價復合物的抗氧化性高于消化前復合物的抗氧化性。

2.4 ABTS法抗氧化能力分析

圖4 SPI和花青素-SPI共價復合物消化前后的抗氧化性（ABTS法）Fig. 4 Antioxidant capacity of SPI and anthocyanins-SPI conjugates before and after digestion as measured by ABTS radical cation scavenging assay

ABTS法是測定樣品抗氧化性的另一種常用方法[36]。如圖4所示，花青素的添加使SPI的抗氧化性能力增強。相較于SPI的抗氧化性，AC3、LC1、LC2、LC3的抗氧化性都有顯著性提升（P＜0.05）。尤其是LC3，抗氧化能力比SPI高出58.72%。這主要是因為花青素本身具有很強的抗氧化性，所以在花青素醌交聯(lián)到SPI上形成的共價復合物具有抗氧化性。而在漆酶條件下，一定質(zhì)量濃度的花青素對SPI的親和力可能高于堿性條件，正如除LC1和AC1外，LC2、LC3的抗氧化性依次高于AC2、AC3。同時，由于SPI被胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后會產(chǎn)生具有抗氧化性的多肽，所以同一樣品經(jīng)過模擬胃腸消化后抗氧化性會升高（圖4）。同樣，You Juan等[36]在研究卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和兒茶素的共價相互作用時，也發(fā)現(xiàn)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的抗氧化性（ABTS法）有所改善。

2.5 多肽滲透率的分析

表1 花青素與大豆分離蛋白共價結(jié)合對多肽滲透率的影響Table 1 Effects of covalent conjugation of anthocyanins and SPI on the permeability of SPI-derived peptides

利用Caco-2單層細胞進行多肽運輸?shù)膶嶒炓呀?jīng)被廣泛用于模擬人體小腸對蛋白的吸收[37]。表1展示了SPI和花青素-SPI共價復合物體外胃腸消化結(jié)束后產(chǎn)生的多肽的細胞滲透率。相較于天然SPI，共價復合物的多肽滲透率降低。且隨著花青素-SPI共價復合物中花青素含量的升高，其復合物產(chǎn)生的多肽細胞滲透率逐漸減小。值得注意的是，添加同質(zhì)量濃度花青素時，漆酶交聯(lián)條件下的多肽滲透率降低地更為明顯（P＜0.05）。據(jù)研究報道，多肽的被動吸收主要依賴于多肽和水形成的氫鍵。多肽要透過細胞膜，需要足夠的能量斷開多肽和水之間的氫鍵[38]。由于花青素是水溶性化合物，因此花青素的共價交聯(lián)增加了SPI的-OH基團的量，進而增加了花青素-SPI共價復合物與水之間形成氫鍵的數(shù)量，這可能是花青素交聯(lián)SPI后致使SPI的多肽滲透率降低的原因。而漆酶條件下，添加同質(zhì)量濃度花青素時，SPI交聯(lián)的花青素數(shù)量比堿性條件下更多，由此帶給SPI羥基基團的量更多，多肽與水形成的氫鍵也越多，斷開蛋白多肽與水形成的氫鍵所需的能量隨之增多，從而同等時間內(nèi)多肽的滲透率越低。然而，由于多肽如何穿過細胞膜的具體機制仍不明晰，所以還需繼續(xù)探究。

3 結(jié) 論

本實驗利用花青素在漆酶條件和堿性條件下對SPI進行共價交聯(lián)，并將其復合物進行體外模擬胃腸消化，探究花青素共價交聯(lián)SPI后對其分子結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)吸收特性的影響。主要結(jié)論如下：1）隨著花青素質(zhì)量濃度的增加，花青素-SPI共價復合物的熒光強度逐漸降低，發(fā)色基團逐漸被猝滅，多肽鏈解折疊從而改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象。相較于堿性條件，花青素質(zhì)量濃度相同時，漆酶條件下的花青素-SPI共價復合物熒光猝滅效果更明顯。2）花青素對SPI的共價交聯(lián)提高了蛋白在體外胃腸消化中的水解度，且花青素-SPI共價復合物中花青素含量與復合物水解度呈正比。此外，漆酶條件交聯(lián)的復合物比堿性條件交聯(lián)的復合物在體外消化過程中水解度要更高。3）花青素與SPI發(fā)生共價相互作用后，蛋白的抗氧化性得到改善。同時，DPPH法和ABTS法都表明，SPI和花青素-SPI共價復合物消化后的抗氧化性比消化前高，而且無論消化前后，樣品的抗氧化性都隨花青素質(zhì)量濃度的增加而增強。4）花青素-SPI共價復合物經(jīng)過體外模擬胃腸消化后產(chǎn)生多肽，其多肽滲透率要低于天然SPI消化后產(chǎn)生的多肽在Caco-2單層細胞的滲透率，而漆酶條件下的多肽滲透率要低于堿性條件下的多肽滲透率。

以上研究結(jié)論為花青素在漆酶和堿性條件下交聯(lián)SPI后，對蛋白結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)吸收特性的影響提供部分理論參考價值，為SPI在食品中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。