海藻糖鑒別（3）、有關(guān)物質(zhì)、含量的測(cè)定方法驗(yàn)證

李寧 劉昶 李鎮(zhèn)宏

摘 要：建立一個(gè)用高效液相色譜法測(cè)定海藻糖鑒別（3）、有關(guān)物質(zhì)和含量測(cè)定的方法。方法：以磺化交聯(lián)的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為填充劑的強(qiáng)陽(yáng)離子氫型色譜柱 ;以水為流動(dòng)相 ;檢測(cè)45℃，柱溫80℃，流速0.4ml/min。結(jié)果：海藻糖在1.0027472～15.04419mg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，得線性方程y=0.0000022x-0.037297（R2=0.9999），回歸系數(shù)大于0.999; ?結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于海藻糖鑒別（3）、有關(guān)物質(zhì)和含量的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：海藻糖;高效液相色譜法示差檢測(cè)器;方法學(xué)

海藻糖是一種對(duì)生物體具有神奇的保護(hù)作用的二糖，它能夠有效地保護(hù)蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征。所以海藻糖在食品、藥品和化妝品領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域今后幾年需求量會(huì)有較大的增長(zhǎng)。而海藻糖的鑒別、有關(guān)物質(zhì)和含量的檢測(cè)是用高效液相RID檢測(cè)器檢測(cè)，RID檢測(cè)器為特殊檢測(cè)器，應(yīng)用不是很廣泛。本文擬建立海藻糖鑒別（3）、有關(guān)物質(zhì)和含量測(cè)定的方法，旨在為海藻糖的質(zhì)量安全提供參考。進(jìn)一步確立海藻糖的使用安全。

1.實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

海藻糖、麥芽三糖、無水葡萄糖對(duì)照品 來源 中國(guó)食品藥品檢定研究院。純化水，自制。海藻糖樣品。

安捷倫1260高效液相色譜儀系統(tǒng)（配有示差折光檢測(cè)器、四元梯度泵、在線脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱）。電子天平：梅特勒托利多電子天平（XS105DU）。

1.2試驗(yàn)方法

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 ?以磺化交聯(lián)的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為填充劑的強(qiáng)陽(yáng)離子氫型色譜柱;以純水為流動(dòng)相 ;示差折光檢測(cè)溫度為45℃，柱溫80℃，流速0.4ml/min，采集運(yùn)行30min。

對(duì)照品溶液的制備 ?精密稱定麥芽三糖、無水葡萄糖、海藻糖對(duì)照品，分別為24.41mg、24.26mg、93.06mg，置于同一個(gè)10ml量瓶中，加水溶解并稀釋制成每lml中各含2.441mg、2.424mg、9.287mg的溶液為對(duì)照1，再精密稱定海藻糖對(duì)照品252.20mg置于25ml量瓶中加水溶解并稀釋至刻度制成每1ml含海藻糖10.027mg的溶液為對(duì)照2。精密吸取20ul，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，各色譜峰之間的分離度均大于1.5。

供試品溶液的制備 ?取本品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每lml約含海藻糖lOmg的溶液。搖勻，用0.45？m濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品。

測(cè)定法： ?分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20？l，注入色譜儀，測(cè)定，即得。

精密度試驗(yàn)：分別精密吸取濃度為9.287mg/ml的海藻糖對(duì)照品溶液按測(cè)定方法對(duì)對(duì)照溶液1重復(fù)進(jìn)樣6次測(cè)定峰面積值。各次測(cè)得的峰面積值分別為4178000、4174140、4177330、4177290、4176290、4175530，平均值為4176430，RSD為0.03%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0%，儀器精密度良好。

線性關(guān)系與線性范圍考察：精密稱定海藻糖對(duì)照品151.35mg置于10ml量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得到濃度為15.04mg/ml的溶液作為海藻糖對(duì)照品儲(chǔ)備液和濃度為10.027mg/ml的海藻糖對(duì)照品制成1.0027mg/ml、2.0054 mg/ml、5.0137mg/ml、7.5220 mg/ml、10.0274mg/ml、15.0441mg/ml6個(gè)濃度的溶液，分別取上述6個(gè)濃度的對(duì)照品溶液20ul注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積;以面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試驗(yàn)結(jié)果表明：海藻糖線性回歸方程為y=0.0000022x-0.037297（R2=0.9999），相關(guān)系數(shù)滿足要求，說明海藻糖在1.0027472～15.04419mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取1批海藻糖原料（批號(hào)：2018001），取供試品6份，精密稱定，依含量測(cè)定方法測(cè)定，同時(shí)，取海藻糖對(duì)照品溶液同法測(cè)定，分別計(jì)算出海藻糖含量，RSD為0.38%。

加樣回收率試驗(yàn)（準(zhǔn)確度試驗(yàn)）：采取全程加樣法。取9份已知含量的海藻糖約0.046g，精密稱定，置于10ml量瓶中。1-3份精密量取海藻糖對(duì)照溶液2各3.00ml加入到量瓶中， 4-6份精密量取5.00ml到量瓶中，7-9份精密量取7.00ml于容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。得到80%、100%、120%濃度的供試品，按含量測(cè)定方法測(cè)定，同時(shí)取海藻糖對(duì)照品溶液，依法測(cè)定，并計(jì)算出海藻糖的含量。以下式計(jì)算回收率。試驗(yàn)結(jié)果，平均回收率為99.8%（RSD=0.62%）。結(jié)果較滿意，表明本法適用于海藻糖的質(zhì)量控制。

2.結(jié)論： 通過對(duì)按照《中國(guó)藥典》2015年版四部，第555頁(yè)海藻糖項(xiàng)下的鑒別（3）、有關(guān)物質(zhì)和含量的測(cè)定方法，進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)、檢測(cè)限、專屬性、線性關(guān)系與線性范圍考察、重復(fù)性試驗(yàn)、準(zhǔn)確度試驗(yàn)（加樣回收試驗(yàn)），各項(xiàng)試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果均能滿足要求，儀器性能穩(wěn)定，準(zhǔn)確度結(jié)果滿意。

從以上數(shù)據(jù)可以看出用該方法檢測(cè)海藻糖的鑒別（3）、有關(guān)物質(zhì)和含量，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，表明運(yùn)用此方法檢測(cè)海藻糖可以安全有效的控制海藻糖的質(zhì)量。

該方法中海藻糖的檢測(cè)限為0.10027472ug.海藻糖的線性范圍為1.0027472～15.04419mg/ml。