黃芪注射液調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路改善心肌梗死后心肌重塑

劉 芬，崔新明，徐 佳，于芷懿，關(guān)鳳英

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 長春 130021)

心力衰竭是指心肌缺血、心臟負荷增加等初始心肌損傷引起的心肌結(jié)構(gòu)和功能改變，進而導(dǎo)致心室功能下降。心力衰竭的發(fā)病率和突發(fā)性死亡的危險性都較高[1]，因此心力衰竭的藥物治療一直是醫(yī)學(xué)界的研究熱點。目前心力衰竭的治療目標在改善癥狀的前提下，更期望降低并發(fā)癥、延長壽命并提高生活質(zhì)量，故藥物治療不僅需要改善血流動力學(xué)參數(shù)，還需要逆轉(zhuǎn)(恢復(fù))心臟的病理形態(tài)學(xué)，如心肌重構(gòu)。所謂心肌重構(gòu)，即心肌細胞肥大和非肌細胞增生，并伴有左心室形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化及機械功能的減退。臨床上可見心肌重量、心室容量的增加，以及心室形狀的改變。

已有研究表明，凋亡、自噬、炎癥及氧化應(yīng)激 (oxidative stress) 參與了心肌重塑過程[2-5]，其中氧化應(yīng)激中產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)發(fā)揮了重要作用。正常情況下，機體的ROS不斷地產(chǎn)生，又不斷地被抗氧化系統(tǒng)清除，處于動態(tài)平衡，使其維持在無害的極低水平[6]，并參與生理功能的調(diào)節(jié)，保護細胞；然而在一定的應(yīng)激損傷條件下，機體ROS產(chǎn)生過多，或ROS清除不足，動態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致ROS增多并引起組織細胞氧化損傷的病理過程，被稱為氧化應(yīng)激。故抑制損傷性ROS 的生成而不影響生理水平的ROS產(chǎn)生是治療和預(yù)防心肌重塑的新途徑，而非以往臨床實驗一樣采用非特異性抗氧化劑治療而致使療效欠佳[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)，nitroso/redox(亞硝基/氧化還原態(tài))平衡是維持心肌細胞正常功能的重要途徑，提高內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、一氧化氮(nitric oxide，NO)表達為抗心肌功能障礙的有效途徑[8]。因此，尋找對ROS及NO/eNOS具有雙重調(diào)節(jié)的藥物將是抗心肌重構(gòu)的新方向。黃芪注射液是由中藥材黃芪提取的有效成份而制成，有強心的功效，黃芪注射液用于心力衰竭治療的臨床觀察結(jié)果顯示，其治療療效顯著[9-10]。研究表明：黃芪可加強心肌收縮力，使左心室舒張期容積及收縮期容積減少，改善心臟功能，并可減輕心肌細胞的損傷，還有擴張冠狀動脈、改善心肌血供和心肌代謝的作用，但其抑制心肌重塑及其相關(guān)機制尚鮮有報道。本課題組前期研究也已經(jīng)證實：黃芪注射液具有抗心肌細胞氧化應(yīng)激作用[11]。另外有研究表明，黃芪甲苷能夠激活PI3K/AKT通路在阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷中發(fā)揮保護作用[12]，而PI3K/AKT可以通過磷酸化eNOS而生成NO[13]，這為其進一步研究提供了依據(jù)?；谏鲜鰧嶒灪团R床研究背景，本文探究黃芪注射液是否通過激活PI3K/AKT調(diào)節(jié)eNOS/NO發(fā)揮抗氧化作用，從而抑制心肌重塑過程。本研究將首次從氧化還原態(tài)平衡角度探討黃芪注射液治療心力衰竭的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級7周齡Wistar雄性大鼠，體重210～240 g，吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供[SCXK(吉)2013-0001]，實驗在機能實驗中心實驗室進行[SYXK(吉)2013-0005]。本實驗使用的麻醉劑和操作方法均有單位倫理委員會的許可，實驗動物飼養(yǎng)使用和處理嚴格遵循動物福利3R原則和吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院倫理委員會相關(guān)條例要求。批準編號[201851]。

1.2 主要試劑與儀器

黃芪注射液由成都地奧制藥廠提供。α肌球蛋白重鏈(α-MHC)、大鼠N端前腦鈉素(NT-PROBNP)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、ELISA試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；ELISA試劑盒北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；PI3K(sc-423)、AKT(sc-7938)、p-AKT(sc-7985-R)及GAPDH(sc-293335)大鼠多克隆抗體購自Santa Cruz， eNOS(32027)，P-eNOS(9571)多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗兔抗體北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。蛋白印跡電泳系統(tǒng)，Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)，上海天能。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備

麻醉大鼠，固定大鼠，連接PowerLab記錄分析系統(tǒng)行監(jiān)測并記錄標Ⅱ正常心電。胸部剃毛，用75%酒精棉球消毒皮膚，荷包穿線，于 3～4 肋間心臟搏動最明顯處，用止血鉗鈍性分離肌層，打開胸腔，剪開心包，輕壓右側(cè)胸廓擠出心臟。迅速穿線結(jié)扎冠狀動脈左前降支后將心臟送回胸腔，荷包縫合。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。手術(shù)結(jié)束后記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以ST段抬高0.2 mV定為造模成功[14]。

1.3.2 實驗分組

大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、AS-L組(1 mL/kg)、AS-H組(3 mL/kg)組，腹腔注射給藥。假手術(shù)組：冠狀動脈下穿線不結(jié)扎，其他各組均結(jié)扎冠狀動脈前降支；假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水2 mL/kg，給藥組結(jié)扎后2 h給予AS治療，隨后每日給藥一次，連續(xù)6周，并記錄動物死亡情況。

1.3.3 ELISA測定

給藥結(jié)束后，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥1 mL/kg體重，腹主動脈取血，在4℃下，3000 r/min離心10 min,分離血清備用。按試劑盒說明操作，用酶標儀測定血清MDA、NO、NOS，α-MHC及NT-proBNP含量。

1.3.4 HE染色及Masson染色檢測心肌組織病理學(xué)變化及纖維化情況

將心肌于結(jié)扎處下分成4片心肌，并取左心室下1/3心肌組織，于中性福爾馬林中固定，進行石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，封片，進行HE及Masson染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.5 Western blot方法檢測心肌細胞內(nèi)蛋白表達

組織裂解緩沖液的配制，溶液1∶0.05 mol/L Tris.Cl(pH 7.4)，1 mmol/L EDTA， 1% 的Triton X-100，0.3 μmol/L aprotinin，1 mmol/L PMSF，裂解心肌組織并提取蛋白。取120～150 mg在液氮內(nèi)凍存的心肌組織，于液氮內(nèi)研磨成粉末后置入一塑料管中，加入1 mL裂解緩沖液懸浮，冰上勻漿3次，每次10 s，超聲處理3次，每次5 s，14 000 r/min離心20 min，取上清即為蛋白。

Bradford 法測定蛋白濃度，取40 μg 蛋白進行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉PBS配制液封閉后，將膜置于含兔抗多克隆抗體(1∶1000 稀釋)溶液中，室溫搖床反應(yīng)1 h后再加入HRP 標記的山羊抗兔IgG (1∶3000 稀釋)，室溫輕搖1 h 后， ECLKit 發(fā)光。用NIH Image 軟件對條帶實施掃描，檢測各部分蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃芪注射液對心肌梗死后大鼠生存百分率的影響

在大鼠心肌梗死6周后，記錄其生存百分率，各組結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示AS能夠提高大鼠心肌梗死后的生存時間及生存率，但是組間無顯著性差異。

注：各組無顯著性差異。圖1 黃芪注射液對心肌梗死后大鼠生存率的影響(n=11)Note. There is no significant difference between each two groups.Figure 1 Effect of Astragalus on survival rate of rats at 6 weeks after ligation of the left anterior descending coronary artery

2.2 黃芪注射液對心肌梗死后大鼠α-MHC、NT-proBNP的影響

α肌球蛋白重鏈(α-MHC)水平與心肌細胞肥大程度成正比，而NT-PROBNP值則主要反映心衰的可能性。與假手術(shù)Sham組比較，模型Model組的α-MHC顯著升高(P<0.01)，AS低劑量組心肌肥大程度較模型組有所減輕，但無顯著性差異，而AS高劑量組則顯著降低(P<0.05)，結(jié)果提示適宜劑量AS可抑制心肌肥大。Model組的NT-proBNP較Sham組高(P<0.05)，AS低劑量組有所減輕，但無顯著性差異，而AS高劑量組則顯著降低NT-proBNP(P<0.05)， 故適宜劑量的情況下可以減緩心力衰竭的過程。見圖2、3。

2.3 黃芪注射液改善心肌梗死后大鼠的心肌損傷及心肌纖維化

由圖可見， Sham組可見心肌纖維排列整齊，無膠原纖維增生纖維化，未見炎性細胞浸潤及出血；

圖4 黃芪注射液對心肌梗死后大鼠組織病理損傷及心肌纖維化的影響(HE及Masson染色)Figure 4 Effects of Astragalus injection on the pathological changes of heart tissues and myocardial fibrosis in rats after myocardial infarction. HE and Masson staining.

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01, 與模型組比較，*P<0.05。圖2 黃芪注射液對心肌梗死后大鼠α肌球蛋白重鏈的影響(n=8)Note. Compared with the sham group，##P<0.01. Compared with the model group，*P<0.05.Figure 2 The effect of Astragalus injection on serum α-MHC in the rats after myocardial infarction

Model組可見心肌纖維肥大，排列不規(guī)則，可見大量炎細胞浸潤、充血及纖維化；ASL組略好于Model組，較Model組炎細胞浸潤少、充血少及纖維化略輕；ASH組好于低劑量組，較低劑量組炎細胞浸潤少、充血少及纖維化輕。結(jié)果顯示AS對于大鼠心肌結(jié)構(gòu)損傷及纖維化具有改善作用。見圖4。

2.4 黃芪注射液抑制心肌梗死后大鼠的過氧化產(chǎn)物產(chǎn)生并上調(diào)NOS

給藥8周后，檢測各組大鼠血清MDA、NO及eNOS含量。與Sham組相比，Model組大鼠血清中MDA含量顯著上升(P<0.001)；與Model組相比，AS高劑量組大鼠血清中MDA含量顯著降低(P<

注：圖中4組bar代表N端前腦鈉素，與假手術(shù)組比較,#P<0.05, 與模型組比較,*P<0.05。圖3 黃芪注射液對心肌梗死后大鼠N端前腦鈉素的影響 (n=8)Note. Compared with the sham group， ##P<0.05. Compared with the model group，*P<0.05.Figure 3 Effect of Astragalus Injection on the serum NT-proBNP in rats after myocardial infarction

0.001)。NO及eNOS結(jié)果顯示，與Sham組相比，兩者在Model組血清中的含量略增，但無統(tǒng)計學(xué)意義，而AS高劑量組的NO及eNOS含量顯著高于Model組(P<0.05)。見圖5。

注：與假手術(shù)組比較，###P<0.001, 與模型組比較，*P<0.05，*** P<0.001。圖5 黃芪注射液對對心肌梗死后大鼠血清中MDA、NO、eNOS的影響(n=8)Note. Compared with the sham group,###P<0.001. Compared with the model group，*P<0.05，***P<0.001.Figure 5 Effects of Astragalus injection on the rat serum levels of MDA, NO, and eNOS after myocardial infarction

2.5 黃芪注射液對PI3K、AKT及凋亡相關(guān)蛋白的影響：

采用Western blotting方法檢測AS對PI3K及P-AKT的作用，結(jié)果顯示ASH可顯著上調(diào)PI3K蛋白表達(P<0.001)，AS可顯著上調(diào)P-AKT蛋白表達(P<0.05)。另外，ASH可以有效上調(diào)P-eNOS(P<0.05)的表達。見圖6-7。

3 討論

經(jīng)過6周黃芪注射液的治療，心肌梗死后大鼠的生存率。由α-MHC及Masson染色結(jié)果可以看出，心肌肥大及纖維化程度減輕，而NT-proBNP 值的降低主要反映心衰的可能性降低，證明黃芪注射液具有抑制心力衰竭、逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)的作用。進一步結(jié)果表明黃芪注射液可以改善過氧化損傷并上調(diào)PI3K、P-AKT及P-eNOS。

PI3K/AKT通路被公認是促進心肌細胞生存的重要途徑[15]。PI3K 是二聚體蛋白質(zhì)，由85×103的調(diào)節(jié)亞單位和110×103的催化亞單位組成，PI3K 的 p85通過直接與G 蛋白偶聯(lián)而被活化，也可與生長因子受體或生長因子相關(guān)蛋白結(jié)合而活化[16]?；罨?PI3K 募集到細胞膜后，其 p110 部位將底物磷脂酰肌醇4, 5-二磷酸催化為磷脂酰肌醇3, 4, 5-三磷酸，PIP3 可作為第二信使傳遞信號，介導(dǎo) PI3K的多種生物學(xué)功能。PIP3能夠?qū)⒑?PH結(jié)構(gòu)域的信號蛋白募集到細胞膜表面并使之激活[17]。AKT又稱蛋白激酶B，其氨基末端含有普列克底物蛋白同源序列，被認為是與 PI3K 結(jié)合的關(guān)鍵部位，結(jié)合后使AKT磷酸化并活化?；罨腁KT將會轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)進一步活化下游的靶點，進而調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖與分化[18]。

注：與模型組比較，*P<0.05，*** P<0.001。圖6 黃芪注射液對心肌梗死后大鼠心肌細胞PI3K及磷酸化AKT的影響(n=4)Note. Bars of the four groups in the figure show the PI3K and P-AKT level.Compared with the model group， *P<0.05，***P<0.001.Figure 6 Effects of Astragalus injection on the serum PI3K and p-AKT levels in cardiomyocytes of rats after myocardial infarction

注：圖中4組bar代表磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶蛋白水平，其中與模型組比較，*P<0.05。圖7 黃芪注射液對心肌梗死后大鼠P-eNOS蛋白的影響(n=4)Note. Bars of the four groups in the figure show the P-eNOS level. Compared with the model group， *P<0.05.Figure 7 Effect of Astragalus injection on p-eNOS protein levels in cardiomyocytes of the rats after myocardial infarction

已有研究表明PI3K/AKT可以通過磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric synthase，eNOS)降低過氧化損傷從而抑制心肌重塑[13]。多個研究表明AKT Ser473磷酸化后，再通過eNOS Ser1177磷酸化而活化eNOS[19-22]，eNOS可催化左旋精氨酸生成一氧化氮(nitric oxide, NO)。與野生型小鼠相比，eNOS 缺陷小鼠在心梗后將發(fā)展為更嚴重的左心室功能不全和心肌重構(gòu)[23 ]，反之亦然，過表達eNOS使心梗后左心室功能不全程度減輕[24]。然而NO的這種保護作用卻在與來自失偶聯(lián)eNOS形成的氧化應(yīng)激共存的情況下消失，并反而促進心臟的病理重構(gòu)。已有實驗證明，eNOS基因敲除小鼠在低水平ROS 存在情況下，雖然具有很強的壓力負荷，但卻只有輕微的向心性肥厚和纖維化，而沒有發(fā)展為左心室擴張[25]。因為在適宜的ROS存在下，NO是一種負性調(diào)控因素，無論內(nèi)源性還是外源性NO均可抑制AngII誘導(dǎo)的心肌重塑及心肌細胞c-fos的基因表達[26]。以上研究成果證實，激活PI3K/AKT通路可以通過調(diào)節(jié)eNOS降低氧化應(yīng)激水平從而抑制心肌重塑。

綜上所述，結(jié)合本實驗結(jié)果，說明黃芪注射液的抗心力衰竭、逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)的作用其激活PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)eNOS有關(guān)，但尚需進一步驗證其內(nèi)在關(guān)系。