分子印跡固相萃取-高效液相色譜法檢測果蔬中的乙酰甲胺磷

蘇立強， 呂艷榮， 李冬梅， 靳巖爽

(齊齊哈爾大學化學與化學工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006)

有機磷農(nóng)藥[1]是用于防治植物病蟲害的一類有機磷酯類化合物。乙酰甲胺磷是一種常用于果蔬防蟲的有機磷農(nóng)藥，由于具有高效廣譜、價格低廉等特點而被廣泛使用，但過量與不合理的使用易造成果蔬中該農(nóng)藥污染，其作為乙酰膽堿酯酶的抑制劑，進入生物體內(nèi)會引起人和動物急性中毒甚至死亡[2]。為保障人民生命安全，中國及歐盟等國家均出臺了相關(guān)規(guī)定[3 - 4]，以限制其過量與不合理使用，因此，對其準確靈敏的檢測十分必要。食品基質(zhì)復(fù)雜，不易直接檢測。目前，常見的前處理方法有液-液微萃取、微波輔助提取和固相萃取(SPE)[5 - 6]等。其中，固相萃取集濃縮與凈化功能于一體，應(yīng)用更多。但傳統(tǒng)萃取介質(zhì)選擇性低，對目標物的萃取效率不高。

分子印跡聚合物(MIPs)[7 - 8]作為一種新型的人工親和介質(zhì)，能夠?qū)Ｒ蛔R別、吸附目標分子，可從復(fù)雜基質(zhì)中分離富集某一特定目標物，已在分子識別、固相萃取、傳感器、膜分離、色譜分離等方面得到廣泛應(yīng)用[9]。Luo等人[10]基于乳液聚合法，制備了乙酰甲胺磷MIPs，該聚合物具有多孔和空心核結(jié)構(gòu)；Gao等人[11]以乙酰甲胺磷為模板分子，磁性碳納米管為載體，采用表面聚合法，制備乙酰甲胺磷MIPs，并將其應(yīng)用于蔬菜中乙酰甲胺磷的分離富集。本文以乙酰甲胺磷為模板，采用溶膠-凝膠法制備乙酰甲胺磷MIPs，并將其作為固相萃取填料，用于實際樣品中乙酰甲胺磷的分離與富集，結(jié)合高效液相色譜(HPLC)法，對果蔬中乙酰甲胺磷殘留進行準確檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

TU-1901紫外/可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；AS380傅立葉變換紅外光譜儀(美國，尼高力公司)；Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國，戴安公司)；BS-200-S電子天平(北京塞奴利斯天平公司)。

乙酰甲胺磷、敵百蟲、久效磷(湖北康寶泰精細化工公司)；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES，阿拉丁試劑)；正硅酸乙酯(TEOS，天津市科密歐化學試劑有限公司)；無水乙醇(天津市凱通化學試劑有限公司)；以上試劑均為分析純。實驗用水為去離子水。

本實驗的實際樣品均取自本地某果蔬市場。

1.2 分子印跡聚合物的制備

稱取0.0916 g(0.5 mmol)模板分子乙酰甲胺磷，2.2137 g(10 mmol)功能單體APTES，置于10 mL 95%乙醇中，電磁攪拌10 min使其充分作用，在攪拌的條件下滴加4.1667 g(20 mmol)交聯(lián)劑TEOS和5 mL 濃HCl，于溫度20 ℃下攪拌使其充分反應(yīng)，聚合24 h形成乳白色的凝膠。將產(chǎn)物依次通過無水乙醇、去離子水洗滌兩次，除去未反應(yīng)完全的反應(yīng)物，將其烘干后，研磨過100目篩，再用甲醇-HAc(9∶1,V/V)洗脫24 h，除去殘留的HAc后，60 ℃真空干燥，得到白色粉末狀MIPs待用[12]。除不加模板分子乙酰甲胺磷外，按照同上步驟制備非分子印跡聚合物(NIPs)。MIPs合成過程如圖1所示。

圖1 MIPs的合成原理路線圖Fig.1 Roadmap for the synthesis of MIPs

1.3 固相萃取柱的制備及條件優(yōu)化

稱取100 mg MIPs粉末，裝填于3 mL帶有篩板(孔徑20 μm)的聚丙烯空柱(64×9 mm)中，制成分子印跡固相萃取(MISPE)柱。依次用3 mL去離子水和3 mL乙腈進行活化，用1 mL 3 mg/L乙酰甲胺磷-乙腈溶液上樣，確定最佳流速為1 mL/min后，優(yōu)化淋洗、洗脫條件。分別收集淋洗液及洗脫液，氮氣吹干后，溶解于1 mL的色譜流動相中，HPLC法分析檢測。

1.4 樣品預(yù)處理

參照國家標準的處理方法[13]，將黃瓜樣品切成小塊，經(jīng)組織搗碎機搗碎，制成蔬菜試樣。稱取5.0 g(精確至0.01)蔬菜試樣，加入25 g無水Na2SO4(不同樣品水分含量不同，可酌情添加)，研磨呈干粉狀，將其倒入具塞錐形瓶中，再加入0.2 g活性炭，20 mL丙酮，超聲振蕩1 h，離心，收集上清液，殘渣重復(fù)提取2次，合并上清液，濃縮定容至5 mL，經(jīng)MISPE柱上樣、淋洗、洗脫后供HPLC法分析；C18小柱操作同上。

生菜、甘藍、胡蘿卜的處理同上。

1.5 HPLC條件

色譜柱：美國戴安公司C18柱(250×4.6 mm，5 μm)，柱溫25 ℃；流動相：乙腈-水溶液(10∶90，V/V)，磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0，流速為1.0 mL/min；進樣量20 μL；紫外檢測波長216 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIPs的制備

本文以乙酰甲胺磷為模板分子，APTES為功能單體，加入交聯(lián)劑TEOS并引發(fā)聚合后，復(fù)合物被固定在聚合物的骨架上，洗脫模板后，聚合物的母體中留下與模板相匹配的印跡孔穴，該孔穴可以特異性識別吸附目標分子。

2.2 吸附性能測試

2.2.1 靜態(tài)吸附及動態(tài)吸附實驗在溫度25 ℃條件下，MIPs和NIPs的吸附等溫曲線見圖2A。由圖可知，隨著乙酰甲胺磷濃度增大，二者的吸附容量(Q)均逐漸增大，且MIPs的吸附容量明顯高于NIPs的吸附容量，約為2.48倍。這是因為MIPs中含有與模板分子相匹配的印跡孔穴，可特異性吸附模板分子，而NIPs結(jié)構(gòu)中不具備特異性結(jié)合位點，主要依靠物理作用吸附，無法對目標分子有效識別，從而吸附容量較低。

為考察MIPs達到平衡所需時間和吸附速率，對MIPs的動力學性能進行研究(圖2B)。結(jié)果表明，在吸附初期，MIPs主要依靠表面淺孔吸附模板分子，因此吸附速率較大，當表面淺孔達到吸附飽和，模板分子向MIPs內(nèi)部擴散，吸附速率下降，并在70 min左右達到平衡，快速的吸附平衡，適合作為固相萃取填料。

2.2.2 選擇性吸附性能測定選取同為有機磷農(nóng)藥的久效磷和敵百蟲為競爭底物，考察MIPs的專一識別性能，結(jié)果見圖3。由圖可知，MIPs對乙酰甲胺磷的吸附量均高于其他兩種結(jié)構(gòu)類似物，這是因為MIPs中存在與模板分子相匹配的記憶孔穴，模板分子可進入MIPs的內(nèi)部，與其內(nèi)部規(guī)則排列的結(jié)合位點相互作用，因此表現(xiàn)出較高的吸附量；而NIPs對三種底物的吸附量無明顯區(qū)別，這是由于NIPs中不存在印跡孔穴，對底物的吸附為非特異性吸附。

圖2 MIPs和NIPs靜態(tài)、動態(tài)吸附曲線Fig.2 Static and dynamic adsorption curves of MIPs and NIPs

圖3 乙酰甲胺磷及其類似物選擇性吸附柱狀圖Fig.3 Selective adsorption histograms of acephate and its analogues

2.3 固相萃取條件優(yōu)化

將粉末狀MIPs作為固相萃取材料用于目標物的固相萃取，并優(yōu)化了淋洗和洗脫條件。淋洗和洗脫是固相萃取中重要的兩個步驟，恰當?shù)牧芟匆汉拖疵撘嚎梢杂行У南疵摶|(zhì)，同時避免目標物損失[15 - 16]。

2.3.1 淋洗液的選擇淋洗是為了除去MIPs非特異性吸附的某些雜質(zhì)，同時要求對目標物的洗脫率盡可能低。本文分別試驗了以甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷作為淋洗液，考察淋洗溶劑及其用量對模板分子洗脫率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，以二氯甲烷做淋洗液時，模板分子洗脫率最小。這是由于與甲醇、乙酸乙酯相比，二氯甲烷的極性最小，對模板分子與MIPs之間的氫鍵作用破壞較小，因此選擇二氯甲烷為淋洗液。同時，當二氯甲烷的體積小于3 mL時，對模板分子的洗脫率變化不大，為保證充分洗脫雜質(zhì)，選擇淋洗液的體積為3 mL。

2.3.2 洗脫液的選擇洗脫液的作用是破壞MIPs中的印跡孔穴與模板分子的作用力，使目標物從聚合物中脫附。分別選擇體積比均為90∶10的甲醇(MeOH)-水、乙腈(ACN)-水、甲醇-HAc、乙腈-HAc作為洗脫液，考察洗脫溶劑及其用量的影響，結(jié)果見圖5。由圖可知，當洗脫液為甲醇-HAc(90∶10,V/V)時，乙酰甲胺磷的回收率最高，達到98.6%。這是由于甲醇能較好的溶解乙酰甲胺磷，同時加入的HAc中含有羧基，更易與模板分子形成氫鍵，從而將模板與單體之間的氫鍵作用力破壞，提高模板分子的洗脫率。同時，由圖可知隨著洗脫液體積的增大，乙酰甲胺磷的回收率也逐漸增大，當體積為5 mL時，回收率達到最大。因此選擇甲醇-HAc為洗脫液，體積5 mL。

圖4 淋洗液的選擇Fig.4 Eluent selection for template

2.4 實際樣品分析

2.4.1 定量標準曲線與檢出限配制0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.5、2.0、4.0、5.0 μg/mL的乙酰甲胺磷標準系列溶液，結(jié)合MISPE-HPLC法測定。以色譜峰面積(y)對乙酰甲胺磷濃度(x)作圖，其線性回歸方程為:y=6932x+937，相關(guān)系數(shù)R2為0.9990，乙酰甲胺磷在0.01～5.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以三倍信噪比(S/N=3)計算方法的檢出限為1.8×10-3μg/g,其相對標準偏差(RSD)<5%，可用于實際樣品中乙酰甲胺磷殘留分析。

圖6 黃瓜樣品色譜圖Fig.6 Chromatograms of cucumber sample

2.4.2 實際樣品的測定參照1.4的預(yù)處理方法將黃瓜、生菜、甘藍、胡蘿卜進行前處理。采用MISPE對黃瓜、生菜、甘藍、胡蘿卜中乙酰甲胺磷進行分離富集，結(jié)合HPLC法分析測定。在黃瓜和生菜中檢出乙酰甲胺磷含量分別為0.026 μg/g、0.031 μg/g，未超出國家標準[3]，其余兩種樣品中未檢出。對4種實際樣品進行0.01、0.02和0.05 μg/g三個水平的加標回收實驗，回收率在82.7%～102.3%之間，RSD≤4.8%，能滿足復(fù)雜樣品中微量乙酰甲胺磷的測定要求。

圖6為黃瓜樣品采用MISPE和目前廣泛使用的C18柱萃取后的色譜圖。由圖可見，黃瓜的基質(zhì)復(fù)雜，經(jīng)C18和MISPE小柱萃取后均可減少基質(zhì)干擾。但MISPE的效果較為明顯，這是由于MIPs中具有與乙酰甲胺磷相匹配的印跡孔穴，對其表現(xiàn)出較高的吸附能力，可更好地用于乙酰甲胺磷的分離富集。

3 結(jié)論

采用溶膠-凝膠法，以乙酰甲胺磷為模板制備了乙酰甲胺磷分子印跡材料。將其用作固相萃取填料，優(yōu)化的固相萃取條件為：淋洗液為3 mL二氯甲烷，洗脫液為5 mL甲醇-HAc溶液(90∶10,V/V)。建立的MISPE-HPLC方法分離檢測蔬菜中的乙酰甲胺磷，回收率在82.7%～102.3%之間，能夠滿足乙酰甲胺磷殘留分析要求。