甲胺磷生物降解酶對韭菜中農(nóng)殘生物修復(fù)效果研究1）

張娜，郭慶啟，劉曉飛，黃文秀，宋琨，王雙，李爽

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江省食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040）

甲胺磷農(nóng)藥（MAP）殺蟲譜廣，毒性大，制作工藝簡單，曾是我國使用量最大的農(nóng)藥品種，由于其生產(chǎn)和使用對環(huán)境和人體可能造成巨大的污染［1］，國家已經(jīng)禁止生產(chǎn)使用該農(nóng)藥。但是，甲胺磷農(nóng)藥屢禁不止，2007年重慶多種蔬菜中發(fā)現(xiàn)甲胺磷農(nóng)藥，2012年8月蘇州生菜中發(fā)現(xiàn)甲胺磷農(nóng)殘超標(biāo)，2007年在煙臺，2012年在青島分別發(fā)現(xiàn)千余噸含有甲胺磷農(nóng)殘的毒韭菜［2－4］如何從根本上安全而有效的消除甲胺磷農(nóng)殘的危害，是近年來眾多科研人員所關(guān)注的［5－7］。本研究利用實(shí)驗(yàn)室分離得到的一株微生物代謝產(chǎn)生甲胺磷農(nóng)藥降解酶（MAPE），利用該酶液對在生長過程中噴灑甲胺磷農(nóng)藥的毒韭菜進(jìn)行分析，優(yōu)化降解工作參數(shù)，為甲胺磷農(nóng)殘的有效去除奠定了科研基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 供試菌株

實(shí)驗(yàn)室中分離得到XY－C菌株，該菌株為葡萄球菌屬（Staphylococcus Rosehbach）［8］。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SPX－70B型搖床振蕩培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司；722型分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SYQ－DSX－280A型不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料

甲胺磷農(nóng)藥：產(chǎn)自鄭州蘭博爾科技有限公司；規(guī)格為300g／500mL；有效成分為40%。甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品：上海農(nóng)藥研究所提供。其余試劑均為分析純。種植時噴灑甲胺磷農(nóng)藥的韭菜為實(shí)驗(yàn)性原料，購于黑龍江省富?？h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的組成

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaCl 0.5g，MgCl20.5g，K2SO40.5g，CaCl20.1g，F(xiàn)eSO40.01g，MnSO40.001g，蒸餾水1000mL，pH7.0滅菌后，再加入0.5mL甲胺磷農(nóng)藥。

1.2.2 粗酶液的提取

將實(shí)驗(yàn)室分離出來的降解甲胺磷農(nóng)藥的菌株XY－C，接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基，在28℃，180r／min的搖床中振蕩培養(yǎng)72h后將液體培養(yǎng)基4000r／min離心處理，取上清液，即為粗酶液。

1.2.3 甲胺磷含量的測定

待測樣品經(jīng)過前處理后，精確稱取待測樣品的分解液2mL，以試劑空白作參比，其余操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線。測其吸光度值，計算出磷的含量，再根據(jù)計算出來的總磷和無機(jī)磷的量，用兩者之差算出樣品中有機(jī)磷的含量［9］。

1.2.4 降解率公式

式中：m1—酶液反應(yīng)時間為零時所測得的無機(jī)磷含量，mg／L；m2—酶液與韭菜反應(yīng)后測定的無機(jī)磷含量，mg／L；d—韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解率，%；x—韭菜中有機(jī)磷的含量，mg／L；y—韭菜中總磷的含量，mg／L。

1.2.5 韭菜中甲胺磷農(nóng)殘生物降解工藝參數(shù)的確定

每隔一段時間在韭菜表面噴灑不同體積的的粗酶液，于不同溫度下存放不同時間后，分別依照不同處理，取回樣品，去掉非可食部分，用濾紙擦凈蔬菜表面的泥沙，用刀切碎，混勻。用電子天平準(zhǔn)確稱取10g樣品，加入10mL水用組織搗碎機(jī)切碎充分混合、打漿，每個樣品打3份原漿，用于平行試驗(yàn)，進(jìn)行總磷和無機(jī)磷測定，并計算甲胺磷農(nóng)殘的降解率［10］。

2 結(jié)果與討論

在吸光度740nm時，通過比色法測定無機(jī)磷和總磷含量。吸光值與磷含量呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，所得的方程為y（吸光值）＝0.1247x（無機(jī)磷濃度，mg／L）＋0.0088，R2＝0.9995。說明無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度同吸光值之間線性關(guān)系良好，該方程可以用于測定韭菜中無機(jī)磷的含量。

2.1 噴灑次數(shù)對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

圖1 噴灑次數(shù)對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

對在種植過程中噴灑了甲胺磷農(nóng)藥的韭菜在其成熟后，每隔30min噴灑一次甲胺磷農(nóng)藥降解酶液10mL，于室溫下反應(yīng)，對噴灑酶液的韭菜進(jìn)行粉碎、脫色，測定甲胺磷含量并計算甲胺磷農(nóng)藥降解率，結(jié)果如圖1所示。隨著噴灑次數(shù)的增多，韭菜中甲胺磷農(nóng)殘降解率不斷升高，在韭菜表面噴灑1次粗酶液對韭菜中的甲胺磷農(nóng)殘的降解率為31.41±1.01%，而在韭菜表面噴灑5次粗酶液后，韭菜中的甲胺磷農(nóng)殘的降解率提高為66.33±0.50%，在噴灑3次之后，這種降解率提高的情況出現(xiàn)減慢趨勢，因此，選擇甲胺磷降解酶對韭菜的噴灑次數(shù)為3次。

2.2 粗酶液使用量對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

圖2 MAPE使用量對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

對在種植過程中噴灑了甲胺磷農(nóng)藥的韭菜在其成熟后，噴灑甲胺磷農(nóng)藥降解酶，均噴灑3次，每100g韭菜上每次噴灑5～25mL，于室溫下反應(yīng)，對噴灑酶液的韭菜進(jìn)行粉碎、脫色，測定甲胺磷含量并計算甲胺磷農(nóng)藥降解率，結(jié)果如圖2所示。

隨著甲胺磷農(nóng)藥降解酶使用量的增多，韭菜中甲胺磷農(nóng)殘降解率不斷升高，在韭菜表面噴灑3次每次5mL的粗酶液對韭菜中的甲胺磷農(nóng)殘的降解率為30.97±1.70%；而在韭菜表面噴灑3次每次25mL的粗酶液后，韭菜中的甲胺磷農(nóng)殘的降解率提高為64.74±0.76%；在噴灑每次20mL的粗酶液后，雖然降解率在逐漸升高，但是降解率升高并不是十分明顯。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出在不同的酶液添加量的反應(yīng)體系中，底物濃度不變的情況下，在酶液添加量較少時，降解率隨著酶液添加量的增加而增加，降解速率也較快，兩者呈正比關(guān)系；隨著酶液添加量進(jìn)一步的增加，降解率有小幅度的增加，降解速率明顯下降，這可能與底物中酶含量過多，底物與酶中心迅速結(jié)合，導(dǎo)致酶活性受抑有關(guān)。因此，選擇20mL甲胺磷降解酶對100g韭菜進(jìn)行噴灑降解。

2.3 作用溫度對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

對種植過程中噴灑了甲胺磷農(nóng)藥的韭菜在其成熟后，噴灑甲胺磷農(nóng)藥降解酶，于不同溫度下反應(yīng)，對噴灑酶液的韭菜進(jìn)行粉碎、脫色，測定甲胺磷含量并計算甲胺磷農(nóng)藥降解率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

隨著作用溫度由4℃不斷增加到65℃，韭菜中甲胺磷農(nóng)殘降解率出現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在45℃對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘進(jìn)行降解時的降解率為64.63±1.25%，比4℃和65℃作用環(huán)境下，韭菜中的甲胺磷農(nóng)殘的降解率分別提高6.4倍和1.67倍。因此，選擇45℃進(jìn)行甲胺磷降解酶對100g韭菜進(jìn)行噴灑降解。

2.4 作用時間對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

對種植過程中噴灑了甲胺磷農(nóng)藥的韭菜在其成熟后，噴灑甲胺磷農(nóng)藥降解酶，反應(yīng)不同時間后對噴灑酶液的韭菜進(jìn)行粉碎、脫色，測定甲胺磷含量并計算甲胺磷農(nóng)藥降解率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 作用時間對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

隨著作用時間的增多，韭菜中甲胺磷農(nóng)殘降解率不斷升高，在作用20min后，甲胺磷農(nóng)殘降解率增加并不顯著，反應(yīng)30min后甲胺磷農(nóng)殘的降解率為67.17±1.17%，比反應(yīng)20min時甲胺磷農(nóng)殘的降解率僅提高了2.5%。而反應(yīng)20min后甲胺磷農(nóng)殘的降解率為64.63±1.25%，比反應(yīng)15min和反應(yīng)5min時甲胺磷農(nóng)殘的降解率分別提高4.3%和10.1%。因此，選擇20min作為反應(yīng)時間，進(jìn)行甲胺磷降解酶對100g韭菜的降解。采用單因素試驗(yàn)得到的各工藝參數(shù)噴灑三次每次20mL的甲胺磷農(nóng)藥降解酶于45℃反應(yīng)20min，得到的甲胺磷農(nóng)殘降解率高達(dá)68.74±0.86%。

3 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)得到的各工藝參數(shù)，噴灑3次，每次20mL的甲胺磷農(nóng)藥降解酶于45℃反應(yīng)20min，得到的韭菜中甲胺磷農(nóng)殘降解率高達(dá)67.17±1.17%。

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