超聲提取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定土壤中乙酰甲胺磷與甲胺磷的研究

魏立菲，李 逸，張 熒

(珠江流域水環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，廣東 廣州 510611)

甲胺磷(Methamidophos)是一種毒性強(qiáng)、污染大的高效有機(jī)磷殺蟲劑，我國(guó)自2008年1月起全面禁止甲胺磷的生產(chǎn)和使用。乙酰甲胺磷(Acephate)，學(xué)名O,S-二甲基-N-乙酰基-硫代磷酰胺，為甲胺磷的乙酰化產(chǎn)物，因具有高效、低毒、廉價(jià)等特點(diǎn)而作為甲胺磷的替代物之一在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域廣泛使用。乙酰甲胺磷由甲胺磷乙?；频茫渲苿┲杏猩倭考装妨状嬖?，同時(shí)，乙酰甲胺磷的制劑產(chǎn)品穩(wěn)定性差，在降解過(guò)程中能代謝出甲胺磷[1]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2002年6月5日發(fā)布的第199號(hào)公告中規(guī)定禁止甲胺磷在蔬菜上使用，然而近年來(lái)甲胺磷農(nóng)藥殘留超標(biāo)事件時(shí)有發(fā)生，這與乙酰甲胺磷的使用密切相關(guān)。為保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和農(nóng)業(yè)環(huán)境健康，有必要對(duì)土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的殘留量進(jìn)行監(jiān)控。

目前，檢測(cè)乙酰甲胺磷和甲胺磷的常用方法有氣相色譜法(GC)[2-7]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[8-9]。乙酰甲胺磷和甲胺磷極性強(qiáng)、熱不穩(wěn)定、易分解，易在GC進(jìn)樣口被襯管和色譜柱前端吸附及降解，對(duì)儀器系統(tǒng)潔凈度要求較高，易出現(xiàn)進(jìn)樣不出峰、峰信號(hào)弱、峰形差的情況，而土壤樣品基質(zhì)復(fù)雜，易污染儀器，因此用GC或GC-MS分析土壤樣品中乙酰甲胺磷和甲胺磷的難度較大。文獻(xiàn)[10-12]使用高效液相色譜-紫外法(HPLC-UV)進(jìn)行檢測(cè)，但靈敏度不夠，且紫外檢測(cè)無(wú)法準(zhǔn)確定性[13-14]。

本文采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)，對(duì)比了不同前處理方法，建立了土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的超聲提取/UPLC-MS/MS分析方法。該法簡(jiǎn)便高效、靈敏度高、回收率好、定性準(zhǔn)確，可滿足土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷殘留的檢測(cè)要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC I-Class/Xevo TQ-S超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；MassLynx V4.1工作站；S120H超聲波振蕩器(德國(guó)Elma公司)；Soxtec 2050全自動(dòng)索氏抽提系統(tǒng)(丹麥FOSS公司)。50 mL螺口尖底帶蓋離心管(聚丙烯材質(zhì))；聚醚砜濾膜(直徑13 mm，孔徑0.22 μm，津騰公司)；化學(xué)分析濾紙(雙圈牌)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：乙酰甲胺磷(GSB05-2322-2016)、甲胺磷(GSB05-2289-2016)的質(zhì)量濃度均為100 mg/L(以丙酮為溶劑，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所)；甲醇、丙酮(色譜純，Merck公司)；乙酸銨、甲酸(優(yōu)級(jí)純，Merck公司)；超純水(電阻率18.2 MΩ·cm，美國(guó)Millipore公司)。土壤樣品：采自增城遲菜心菜地。

1.2 前處理方法

1.2.1樣品采集與保存選取代表性的菜地，采集表層土壤，用鑷子剔除植物和葉等有機(jī)殘?bào)w，風(fēng)干過(guò)20目篩，置于陰涼干燥處保存。

1.2.2超聲提取稱取10.0 g新鮮土壤樣品于50 mL帶蓋離心管中，加適量無(wú)水硫酸鈉混勻，加入20.0 mL甲醇，旋緊離心管蓋。超聲萃取30 min后靜置30 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜于2 mL樣品瓶中，待分析。

1.2.3全自動(dòng)索氏抽提稱取10.0 g新鮮土壤樣品于抽提紙筒中，加適量無(wú)水硫酸鈉混勻，以脫脂棉覆蓋樣品，量取80 mL甲醇(或丙酮)至抽提杯中。將裝有樣品的抽提紙筒、抽提杯放入抽提裝置。設(shè)定加熱板溫度160 ℃(丙酮用120 ℃)，浸沒沸騰30 min，回流淋洗60 min后，抽提杯中剩余約5 mL溶劑，將殘液全部轉(zhuǎn)移至20 mL比色管中，加甲醇定容至刻度，搖勻后取溶液過(guò)0.22 μm濾膜于2 mL樣品瓶中，待分析。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取100 mg/L的乙酰甲胺磷、甲胺磷溶液各0.1 mL于同一10 mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，混勻，得1.00 mg/L的乙酰甲胺磷、甲胺磷混合中間溶液。再用甲醇將混合中間溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.002、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、15.0、20.0 μg/L的乙酰甲胺磷、甲胺磷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 色譜條件

Waters超高效液相色譜柱(ACQUITY UPLC HSS T3，2.1 mm×100 mm×1.8 μm)；流動(dòng)相：甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液(體積比65∶35)；等度洗脫；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；運(yùn)行時(shí)間：2 min；進(jìn)樣體積：1 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)，外標(biāo)法定量。離子化方式為電噴霧正離子化(ESI+)，毛細(xì)管電壓為1 kV，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑溫度為500 ℃，脫溶劑氣流量為650 L/h，錐孔氣流量為150 L/h，霧化氣壓力為700 kPa，碰撞氣流量為0.15 mL/min。乙酰甲胺磷和甲胺磷的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 乙酰甲胺磷和甲胺磷的MRM分析參數(shù)Table 1 MRM analytical parameters of acephate and methamidophos

*quantitative ion

圖1 加標(biāo)土壤(40.0 μg/kg)提取液中乙酰甲胺磷和甲胺磷的選擇離子流圖及TIC譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

比較了Waters超高效液相色譜柱HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和BEHC18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)對(duì)目標(biāo)物的分離效果，發(fā)現(xiàn)兩種色譜柱均無(wú)法分離甲胺磷和乙酰甲胺磷,但由于2種化合物有各自的MRM特征離子對(duì)，能提取出獨(dú)立的選擇離子流圖，因此保留時(shí)間重疊并不影響對(duì)2種化合物的定性和定量。在相同的流動(dòng)相條件下，HSS T3色譜柱對(duì)極性大的乙酰甲胺磷和甲胺磷有更強(qiáng)的保留，且峰形更好。同時(shí)考察了甲醇-水、甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相等度洗脫的分離效果，結(jié)果顯示以甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液(65∶35)為流動(dòng)相時(shí)的峰形和靈敏度最佳。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)選擇HSS T3色譜柱，以甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液(65∶35)為流動(dòng)相等度洗脫，所得選擇離子流圖及TIC圖見圖1。

2.2 前處理方法的選擇

比較了超聲提取(提取液過(guò)濾紙)、超聲提取(提取液不過(guò)濾紙)、全自動(dòng)索氏抽提(以甲醇為溶劑160 ℃下提取)和全自動(dòng)索氏抽提(以丙酮為溶劑120 ℃下提取)4種提取條件對(duì)土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷回收率的影響(表2)。結(jié)果顯示，對(duì)于全自動(dòng)索氏抽提法，由于乙酰甲胺磷和甲胺磷有一定揮發(fā)性，且均為熱不穩(wěn)定化合物，在較高溫度下提取易損失，因此提取溫度越高，回收率越低。而超聲提取法在室溫下進(jìn)行，避免了因加熱導(dǎo)致的損失，因此回收率明顯優(yōu)于全自動(dòng)索氏抽提法。由于濾紙會(huì)吸附少量的乙酰甲胺磷和甲胺磷，導(dǎo)致超聲后提取液用濾紙過(guò)濾的回收率偏低。還比較了不同超聲時(shí)間(10、20、30、60 min)對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，結(jié)果顯示回收率無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)最終選擇土壤樣品經(jīng)超聲提取30 min后靜置30 min，直接(不過(guò)濾紙)取上清液過(guò)濾膜進(jìn)行檢測(cè)，該前處理方法簡(jiǎn)單快捷，回收率也更滿意。

表2 不同提取條件下乙酰甲胺磷和甲胺磷的回收率Table 2 Recoveries of acephate and methamidophos under different extraction conditions

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

在土壤等復(fù)雜樣品中，基質(zhì)效應(yīng)往往對(duì)分析物的檢測(cè)產(chǎn)生顯著干擾[12]。本實(shí)驗(yàn)在多份空白土壤中加入甲醇，按照“1.2.2”方法處理土壤樣品后，用所得提取液配成質(zhì)量濃度分別為0.2、2、20 μg/L的乙酰甲胺磷和甲胺磷混合溶液進(jìn)行分析(響應(yīng)峰面積A)，同時(shí)以甲醇配制上述3種質(zhì)量濃度的對(duì)照液進(jìn)行分析(響應(yīng)峰面積A′)，以2種方法所得峰面積的比值(A/A′)表示基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，3種質(zhì)量濃度樣品的峰面積非常接近，A/A′≈1，說(shuō)明本方法基質(zhì)效應(yīng)影響小，無(wú)需凈化可直接進(jìn)樣。

2.4 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

按“1.3”配制標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，按照本法進(jìn)行測(cè)定，以乙酰甲胺磷或甲胺磷的峰面積(Y)對(duì)其質(zhì)量濃度(X，μg/L)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，乙酰甲胺磷和甲胺磷的線性范圍均為0.002～20.0 μg/L，線性方程分別為Y=44 991.5X+3 529.96和Y=118 393X+43.38，相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.999 9、0.999 5。

空白土壤中添加0.012 μg/kg的乙酰甲胺磷、甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法平行測(cè)定7份，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(S)。按照MDL=t(n-1,0.99)×S確定方法檢出限，當(dāng)n=7、置信度為99%時(shí)，t=3.143；以4倍方法檢出限作為定量下限[15]。得到土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的檢出限分別為0.004 9、0.003 4 μg/kg，定量下限分別為0.020、0.014 μg/kg。

2.5 方法回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

對(duì)空白土壤樣品進(jìn)行0.400、4.00、40.00 μg/kg 3個(gè)濃度水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，按“1.2.2”方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，每個(gè)濃度平行測(cè)定6份，考察方法回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。由表3可知，乙酰甲胺磷、甲胺磷在低、中、高3個(gè)濃度水平下的加標(biāo)回收率分別為83.0%～91.5%和88.0%～94.8%，RSD分別為2.3%～4.8%和1.8%～4.2%。

表3 空白土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of acephate and methamidophos from blank soil samples at different spiked levels(n=6)

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法測(cè)定了廣東省增城市小樓鎮(zhèn)遲菜心種植基地24個(gè)土壤樣品的乙酰甲胺磷和甲胺磷含量，結(jié)果均未檢出，表明該地區(qū)菜地土壤樣品未受目標(biāo)物污染。

3 結(jié) 論

本文建立了超聲提取/UPLC-MS/MS檢測(cè)土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的方法，樣品經(jīng)超聲提取、過(guò)濾膜后(無(wú)需濃縮)直接上機(jī)測(cè)試，簡(jiǎn)化了前處理流程，提高了測(cè)試效率，且避免了前處理過(guò)程繁瑣導(dǎo)致的回收率損失。方法簡(jiǎn)便高效、回收率好、靈敏度高、定性準(zhǔn)確，可用于大量實(shí)際土壤樣品中乙酰甲胺磷和甲胺磷含量的檢測(cè)。