荔枝與龍眼中噻蟲啉、螺蟲乙酯及代謝物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

王思威，曾廣豐，劉艷萍，王瀟楠，孫海濱*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所 廣東省植物保護新技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.廣東檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623)

荔枝(LitchichinensisSonn.)和龍眼(DimocarpuslonganLour.)均為無患子科植物，屬亞熱帶地區(qū)重要的常綠果樹，主要產(chǎn)于廣東、廣西、福建等地[1-4]。荔枝含有豐富的維生素C、維生素E、多糖、類黃酮等成分；龍眼具有補血益氣、安神養(yǎng)心之功效，含有糖類、維生素、酚類、多糖等成分[1-4]。南方高溫的氣候特點使得荔枝、龍眼樹的蟲害嚴重，而煙堿類殺蟲劑噻蟲啉和季酮酸類殺蟲劑螺蟲乙酯因具有較強的內(nèi)吸作用，對荔枝、龍眼樹的薊馬、螨類等刺吸式口器害蟲具有良好防效。其中，螺蟲乙酯因具有雙向內(nèi)吸傳導的獨特性能，使其可在植物體內(nèi)移動，抵達葉面和樹皮，有效阻止害蟲的卵和幼蟲的生長發(fā)育，增強防治效果。螺蟲乙酯在植物體內(nèi)的降解產(chǎn)物主要有BYI08330-烯醇糖苷(B-glu)、BYI08330-醇酮(B-keto)、BYI08330-烯醇(B-enol)、BYI08330-羥基(B-mono)4種。噻蟲啉對蜜蜂群落有顯著影響(荔枝、龍眼主要靠蜜蜂傳粉)，且可增加肝臟腫瘤發(fā)病率[5]；螺蟲乙酯及代謝物可引起動物和人的眼部刺激和潛在皮膚過敏效應，且對地下水的潛在影響未知[6]。通過建立荔枝和龍眼中螺蟲乙酯和噻蟲啉的分析方法，可為后續(xù)對荔枝和龍眼中2種殺蟲劑的膳食攝入風險評估及對蜜蜂的風險評價提供研究基礎。當前噻蟲啉和螺蟲乙酯及代謝物殘留測定的研究主要集中于番茄、菠菜、柑橘等，暫未發(fā)現(xiàn)荔枝和龍眼中的相關(guān)報道。

目前，關(guān)于噻蟲啉的檢測方法主要有液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[7-11]，前處理方法主要有液液分配、QuEChERS凈化、弗羅里硅土填充柱或固相萃取柱凈化，定量下限為0.01～0.05 mg/kg[12-15]。螺蟲乙酯的檢測方法有HPLC法、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和LC-MS/MS法，其代謝物均采用液質(zhì)聯(lián)用分析法；前處理方法包括液液分配萃取、固相萃取(SPE)、分子印跡和QuEChERS凈化等[16-22],定量下限為0.005～0.05 mg/kg[23-26]。但液液分配萃取、填充柱凈化等前處理方法的有機溶劑用量大，且操作繁瑣，費時費力；固相萃取和分子印跡技術(shù)的成本較高。QuEChERS法的獨特優(yōu)勢(快速、簡便、通用性強)使其對水果、蔬菜等基質(zhì)中的凈化效果十分突出[27-29]。本研究以荔枝和龍眼為研究對象，建立了噻蟲啉、螺蟲乙酯及代謝物的QuEChERS/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，為不同水果中噻蟲啉、螺蟲乙酯及其代謝物殘留的同時檢測提供了簡便、快速、精準的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX 4000Q 三重四極桿質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(ESI)(美國AB SCIEX公司)；Agilent LC-1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)；GTR22-1離心機(北京時代北利離心機有限公司)；OA-SYS氮吹儀(美國Organomation Associates公司)；XW-80A渦旋儀(上海精科有限公司)。

乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；甲酸(色譜純，美國Fluka公司)；無水硫酸鎂、氯化鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；十八烷基鍵合硅膠(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)吸附劑(上海安譜實驗科技股份有限公司)。標準品：噻蟲啉(純度99.0%，美國Chem Service公司)；螺蟲乙酯及代謝物B-glu、B-keto、B-enol、B-mono的純度分別為99.2%、89.6%、92.8%、99.8% 和98.2%(德國Ehrenstorfer GmbH)。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備溶液：分別準確稱取適量噻蟲啉、螺蟲乙酯及4種代謝物標準品，用乙腈配制成1 000 mg/L的標準儲備溶液，于4 ℃避光保存，待用。

混合標準溶液：分別準確吸取1 mL噻蟲啉、螺蟲乙酯及4種代謝物的標準儲備溶液于同一10 mL容量瓶中，用乙腈定容至10 mL，配制成100 mg/L的混合標準溶液。

1.3 樣品前處理

準確稱取荔枝、龍眼樣品5.0 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈進行提取，以10 000 r/min 勻質(zhì)1 min后，加入2 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，劇烈振蕩，渦旋1 min，再以5 000 r/min離心2 min。取2 mL乙腈層溶液，置于裝有0.3 g無水硫酸鎂、0.025 g C18和0.025 g GCB的離心管中，劇烈振蕩，渦旋10 s，再以10 000 r/min離心2 min。取上清液過0.22 μm有機濾膜，待測定。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Poroshell-120 EC-C18柱(150 mm×3.0 mm,2.7 μm)；柱溫為35 ℃；流動相為0.1%(體積分數(shù))甲酸水溶液-乙腈(體積比25∶75)，等度洗脫5 min；流速為0.4 mL/min；進樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為ESI+；掃描模式為多反應監(jiān)測模式(MRM)；離子源溫度為550 ℃；氣簾氣壓力為0.2 MPa；毛細管電壓為5 500 V；霧化氣壓力為0.3 MPa；加熱輔助氣壓力為0.3 MPa。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 噻蟲啉、螺蟲乙酯及代謝物的質(zhì)譜參數(shù)與保留時間Table 1 Mass spectra parameters and retention times of thiacloprid,spirotetramat and its four metabolites

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的選擇考察了乙酸乙酯、乙腈和乙腈-乙酸乙酯(體積比1∶1)作為提取溶劑時對6種目標化合物的提取效率。結(jié)果顯示，以乙腈為提取溶劑時，6種目標農(nóng)藥的提取率為80.7%～103%；以乙酸乙酯為提取溶劑時，B-enol的回收率僅為13%；而乙腈-乙酸乙酯(1∶1)為提取溶劑時，B-enol的回收率為3.3%。這可能是由于乙酸乙酯溶于水，導致其不能從基質(zhì)中完全提取極性較強的B-enol。因此，最終選擇乙腈作為提取溶劑。

2.1.2吸附劑的選擇實驗考察了QuEChERS前處理方法的常用吸附劑(PSA、C18、GCB、PSA+C18、PSA+GCB、C18+GCB)對噻蟲啉、螺蟲乙酯及4種代謝物的吸附效果。結(jié)果顯示：PSA吸附劑對B-enol和B-glu的回收率較低(25.6%～40.8%)；PSA+C18組合對B-enol和B-glu的回收率極低(15.0%～24.3%)；PSA+GCB組合對B-glu的回收率較低(30.2%～34.4%)；采用C18、GCB或C18+GCB組合對上述6種化合物的回收率均在80%以上。C18吸附劑是硅膠基質(zhì)鍵合十八烷基填料，其比表面積大，吸附能力較強，能夠去除脂肪、脂類等非極性干擾物；GCB可顯著去除樣品中的色素。由于荔枝和龍眼樣品中的色素、糖類等物質(zhì)較多，采用單一吸附劑不能有效去除雜質(zhì)，因此本研究選用0.025 g C18+0.025 g GCB吸附劑組合，可使噻蟲啉、螺蟲乙酯及4種代謝物獲得良好的吸附效果及回收率。

圖1 Poroshell-120 EC-C18色譜柱對噻蟲啉、螺蟲乙酯及代謝物的分離色譜圖

2.2 色譜柱的選擇

在乙腈-0.1%甲酸流動相體系下，比較了Poroshell-120 EC-C18(150 mm×3.0 mm,2.7 μm)、XBridge C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)、Atlantis T3 C18(100 mm×3.0 mm，3.0 μm) 3種色譜柱對6種目標物的分離效果。結(jié)果顯示：Poroshell-120 EC-C18柱對目標物的分離效果略好，峰形對稱(圖1)；XBridge C18柱對目標物的分離度較差；Atlantis T3 C18柱對目標物分離的峰形不對稱，產(chǎn)生了拖尾現(xiàn)象，影響定量結(jié)果。綜上，選擇Poroshell-120 EC-C18作為本研究的色譜分離柱。

2.3 流動相的選擇

考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液4種流動相體系對目標化合物的分離度及響應強度。結(jié)果顯示：以甲醇為有機相時，B-glu的峰形不對稱、峰展寬，影響定量結(jié)果。而以乙腈為有機相時，在水相中加入0.1%甲酸可以促進[M+H]+離子峰形成，提高目標農(nóng)藥檢測的靈敏度。因此，流動相選用乙腈-0.1%甲酸水溶液。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

考察了正負離子掃描模式對6種目標化合物的離子化效果，發(fā)現(xiàn)目標物在正離子模式下響應更高，為提高目標化合物的離子化效率，對源內(nèi)參數(shù)進行了優(yōu)化。在正離子模式下，采用針泵進樣的方式對化合物進行全掃描，通過一級質(zhì)譜掃描獲取穩(wěn)定的[M+H]+分子離子，確定母離子后，在MRM模式下對化合物的去簇電壓(DP)進行優(yōu)化；在二級質(zhì)譜中，母離子發(fā)生斷裂或重排等裂解反應，產(chǎn)生不同的m/z離子碎片，選擇響應最高且干擾最少的2個碎片離子為定性和定量離子，分別優(yōu)化其碰撞能量(CE)。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如“1.4”所示，二級質(zhì)譜圖見圖2。

2.5 基質(zhì)效應

采用HPLC-MS/MS分析樣品時，基質(zhì)效應(ME)是影響定量結(jié)果準確性的重要因素。本實驗采用下式計算基質(zhì)效應：ME(%)=[(mmatrix/msolvent)- 1)]× 100%，其中mmatrix為基質(zhì)匹配標準曲線的斜率，msolvent為純?nèi)軇藴是€的斜率。當ME為正值時，表示存在基質(zhì)增強效應；ME為負值時，表示存在基質(zhì)抑制效應；ME=0時，表示不存在基質(zhì)效應。實驗結(jié)果表明(表2)，噻蟲啉、螺蟲乙酯及其4種代謝物在荔枝和龍眼中的ME均為負值，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制作用，其中B-keto在荔枝和龍眼中的基質(zhì)效應絕對值低于47%，其它化合物的基質(zhì)效應絕對值為75.3%～96.7%，表明B-keto的基質(zhì)抑制效應相對較強，其它化合物則相對較弱。本實驗采用基質(zhì)匹配標準溶液校正基質(zhì)效應，從而確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。

表2 噻蟲啉、螺蟲乙酯及代謝物的檢出限、定量下限、回收率、相對標準偏差及基質(zhì)效應Table 2 LODs，LOQs,recoveries,RSDs and matrix effects of thiacloprid,spirotetramat and its four metabolites in litchi and longan samples

(續(xù)表2)

CompoundSampleLOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)Spiked(μg/kg)Recovery(%)RSD(%,n=5)Matrix effect(%)Longan0.31.01,10,10080.4,90.1,97.53.1,4.7,2.6-96.4B-ketoLitchi0.31.51,10,10082.0,88.3,98.22.9,5.6,2.5-40.8Longan0.31.51,10,10085.9,90.3,97.05.8,4.2,4.9-46.9B-enolLitchi0.10.31,10,10080.5,91.3,94.02.4,4.7,6.0-75.3Longan0.20.71,10,10082.1,88.6,98.03.2,4.2,5.0-88.7B-monoLitchi0.31.01,10,10080.9,89.9,99.41.4,3.7,4.5-90.7Longan0.31.01,10,10085.6,96.3,97.55.4,5.4,3.6-94.4

2.6 方法學評價

2.6.1線性范圍、檢出限與定量下限在1～500 μg/L范圍內(nèi)，以基質(zhì)匹配標準溶液的質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標，對應的響應值(y)為縱坐標作圖，經(jīng)最小二乘法得噻蟲啉、螺蟲乙酯及4種代謝物的線性方程。結(jié)果顯示，6種目標物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.990。分別以3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。由表2可知，本方法對噻蟲啉的LOD和LOQ分別為0.03～0.06 μg/kg和0.1～0.2 μg/kg，均低于煙草[9](0.5 μg/kg和0.16 μg/kg)和花生[14](1～5 μg/kg)中的報道值；對螺蟲乙酯及其4種代謝物的LOD和LOQ分別為0.1～0.3 μg/kg和0.3～1.5 μg/kg，均低于動物源食品[21](10～50 μg/kg，30～300 μg/kg)、牛奶[12](0.125～0.75 μg/kg，0.425～2.5 μg/kg)和番茄[15](LOD為0.03～1.6 μg/kg)等基質(zhì)中的報道值。

2.6.2回收率與相對標準偏差在荔枝和龍眼空白樣品中添加1、10、100 μg/kg 3個濃度水平的6種目標物混合標準溶液，每個加標水平重復5次，并作空白對照。6種目標物在荔枝和龍眼中的平均加標回收率為80.4%～99.5%，相對標準偏差(RSD)為1.4%～6.4%(表2)。荔枝空白樣品加標的色譜圖見圖3。本方法具有較高的回收率和良好的精密度，可滿足荔枝和龍眼樣品中噻蟲啉、螺蟲乙酯及4種代謝物的檢測要求。

2.7 方法的應用

采用本方法對市場中隨機購買的20份荔枝和龍眼樣品進行檢測，均未檢出噻蟲啉、螺蟲乙酯及4種代謝物的殘留。

3 結(jié) 論

本文在對樣品前處理和儀器分析條件優(yōu)化的基礎上，建立了測定荔枝和龍眼中噻蟲啉、螺蟲乙酯及4種代謝物殘留的HPLC-MS/MS方法。應用優(yōu)化的QuEChERS方法進行樣品前處理，操作簡便、可靠，方法檢出限為0.03～0.3 μg/kg，定量下限為0.1～1.5 μg/kg。荔枝和龍眼中噻蟲啉、螺蟲乙酯及4種代謝物在1、10、100 μg/kg水平下的平均加標回收率為80.4%～99.5%，RSD為1.4%～6.4%。本方法可用于荔枝和龍眼等水果中噻蟲啉、螺蟲乙酯及代謝物的定性定量分析。