高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定沙棘中的11種黃酮類物質(zhì)

蔡 爽， 阮成江， 杜 維， 丁 健， 韓 平， 王海明

(生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，大連民族大學(xué)資源植物研究所，遼寧大連 116600)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬落葉灌木或小喬木，主要分布于歐亞大陸的溫帶地區(qū)，是一種珍貴的藥食同源植物[1]。沙棘果實和葉片富含維生素、氨基酸、微量元素、萜類和黃酮類化合物等生物活性物質(zhì)，其中沙棘黃酮具有降低膽固醉、改善心肌供血狀態(tài)、凈化血液、抗氧化、抗衰老，以及抗腫瘤和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等生理功效及顯著的藥理功能[2 - 3]。

黃酮類化合物種類多，且大多與不同糖結(jié)合形成苷，較難測定，而建立合理的測定方法是黃酮類化合物分析的難題[4]。目前常用的黃酮類物質(zhì)測定方法有分光光度法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)。分光光度法用于測定黃酮總含量，易受雜質(zhì)干擾致定量準確性差、重現(xiàn)性低[5]；高效液相色譜法分離度要求高且只能對少數(shù)幾種黃酮進行定量[6]。HPLC-MS/MS法具有檢測器選擇性強、靈敏度高、抗干擾強等優(yōu)勢[7 - 9]，能快速、準確的定量，利于從植物的提取物中發(fā)現(xiàn)微量目標成分[10]；作為一種軟電離的電噴霧離子源，能產(chǎn)生分子和離子碎片來解析化合物結(jié)構(gòu)，現(xiàn)已在鑒定天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)研究中被廣泛應(yīng)用[11 - 12]。采用HPLC-MS/MS法已分別從沙棘葉和果實中檢測出的黃酮類物質(zhì)主要有：山奈酚、槲皮素、蘆丁、異鼠李素和柚皮素[13 - 17]，但未見應(yīng)用HPLC-MS/MS同時檢測沙棘種子和葉片中黃酮類化合物及其含量的報道。本研究以14份沙棘樣品(11份種子：新俄、渾金、芬蘭、TF-23、2013-10、34、HS-22、06卷葉、大長果42、向陽Ⅰ和TF2-13；3份葉片：5、7、8)為材料，探索了乙醇提取沙棘種子和葉片中的黃酮類成分的樣品處理方法，建立了HPLC-MS/MS法同時分離檢測沙棘種子和葉片中異鼠李素、槲皮素、山奈酚、表沒食子兒茶素、蘆丁、沒食子兒茶素沒食子酸酯、柚皮素、表兒茶素沒食子酸酯、木犀草素、柚皮苷和表兒茶素11種黃酮類物質(zhì)的方法。本方法簡便快速、準確可靠，可作為一種高通量的快速測定沙棘種子和葉片中黃酮類化合物的方法，對沙棘種質(zhì)資源的選擇和開發(fā)利用具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

API3200三重四極桿質(zhì)譜儀(美國，AB公司)；DGU-20A液相色譜系統(tǒng)(日本，島津公司)；SB52000超聲波清洗機(寧波新藝超聲波設(shè)備有限公司)。

黃酮類化合物：異鼠李素、槲皮素、山奈酚、表沒食子兒茶素、蘆丁、沒食子兒茶素沒食子酸酯、柚皮素和表兒茶素沒食子酸酯標準品購自上海源葉生物科技有限公司，純度均在99.99%以上；木犀草素、柚皮苷和表兒茶素標準品購自上海安普實驗科技股份有限公司，純度均在99.99%以上；無水乙醇為分析純(科密歐)；甲酸和甲醇為色譜純(Honeywell)。

2017年8月，在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院漿果研究所沙棘種質(zhì)資源圃內(nèi)，分別采收11份沙棘種子樣品及3份沙棘葉片樣品。取樣后經(jīng)液氮冷凍，于-80 ℃保存。

1.2 標準品溶液配制

精確稱取各標準品5 mg，溶于5 mL甲醇，配制成1 mg/mL的單標儲備液；分別取50 μL各單標儲備液于新棕色瓶中，加甲醇稀釋到5 mL，濃度為10 μg/mL；各取50 μL 10 μg/mL的溶液，加甲醇稀釋到5 mL，濃度為0.1 μg/mL，用于優(yōu)化質(zhì)譜條件。單標儲備液逐級稀釋成6個濃度梯度(10、20、50、100、500、1 000 ng/mL)，配制成混合標準溶液，用于標準曲線測定。

1.3 供試品溶液配制

準確稱取1～2 g經(jīng)液氮研磨后的樣品粉末，溶于10 mL 75%的乙醇，超聲提取1 h后，離心(4 ℃、4 500 r/min、20 min)，重復(fù)提取2次，合并上清液。上清液用20 mL石油醚反復(fù)萃取除去色素。取0.5 mL萃取溶液，加甲醇定容到5 mL。取1 mL稀釋后的溶液，經(jīng)0.22 μm微孔有機濾膜過濾，待測。

1.4 實驗條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：島津C18色譜柱(50×2.1 mm，1.9 μm)；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇；70%B等度洗脫程序，流速為0.2 mL/min；采集時間為10 min；柱溫為30 ℃；進樣量為2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源，負離子模式(ESI-)；干燥氣(N2)溫度為550 ℃；氣簾氣壓力為30 psi；離子化電壓為-4 500 V；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法選擇

分別采用75%、50%和30%乙醇提取沙棘種子和葉片中的黃酮類化合物，再經(jīng)聚酰胺柱凈化，以蘆丁標準品為對照，采用分光光度法測定總黃酮含量，所得結(jié)果相差在4.5倍以上。這主要由于分光光度法的前處理過程過長，結(jié)果不穩(wěn)定，很難精確測定總黃酮含量。本研究建立的方法為：樣品用75%乙醇水解后，經(jīng)超聲提取，再用HPLC-MS/MS法測定，能同時快速準確的定量多種黃酮類物質(zhì)。

2.2 色譜條件優(yōu)化

采用柱長為150 mm的色譜柱，進行梯度洗脫，但僅能測出部分樣品中的部分黃酮成分。為有效進行黃酮成分分離，本方法采用柱長為50 mm的色譜柱，各黃酮組分得到了較好分離。流動相對色譜分離效果和被測物的檢測靈敏度存在影響。本研究分別對比了三種流動相體系：0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-乙醇和0.1%甲酸溶液-水。結(jié)果表明，0.1%甲酸溶液-甲醇作為流動相時色譜峰分離度較好，峰形對稱，基線平穩(wěn)，保留時間適中，同時被檢物檢出限低，最低(柚皮苷)能達到0.1 μg/L。因此，本方法采用0.1%甲酸溶液-甲醇作為流動相，等度洗脫，在此條件下監(jiān)測得到的11種黃酮的MRM色譜圖質(zhì)量好，清晰度高，如圖1所示。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

電噴霧的“離子霧化”只產(chǎn)生高豐度的準分子離子峰，既可測定不穩(wěn)定的極性化合物，又可直接分析混合物；同時，多電荷離子的形成也可分析大分子量化合物。為獲得二次碎裂產(chǎn)生的子離子，需分別對母離子進行碰撞誘導(dǎo)解離。定性離子對需選擇離子豐度高、基線噪聲低的兩對離子，其中前者可作定量離子對；在此基礎(chǔ)上，逐個優(yōu)化對靈敏度影響較大的碰撞能量及源內(nèi)碎裂電壓，使選定的子離子組成的特征離子的豐度和比例達到最佳[4]。質(zhì)譜分析參數(shù)的最終優(yōu)化結(jié)果見表1。

表1 沙棘11種黃酮類化合物的保留時間及質(zhì)譜分析參數(shù)

(續(xù)表1)

No.NameRetention time(min)Parent ion(m/z)Daughter ion(m/z)Collision energy(eV)Declusteringpotential(V)9Luteolin1.36284.7133.0?135.8-46.4-65.010Naringin0.77579.5150.9?116.0-52.0-80.011L-Epicatechin0.71289.1245.0?123.9-20.0-58.0

*Quantitative ions.

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

將質(zhì)量濃度為10、20、50、100、500、1 000 ng/mL的11種混合對照品溶液分別在最優(yōu)條件下測定，得出11種物質(zhì)濃度與峰面積的關(guān)系，每個校準曲線相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，呈高度線性相關(guān)。以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)分別確定分析方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。相關(guān)參數(shù)見表2。

2.5 精密度和基質(zhì)效應(yīng)考察

最佳實驗條件下，對日內(nèi)精密度和日間精密度進行考察，每個濃度水平連續(xù)測定6次。結(jié)果表明，11種黃酮類化合物的日內(nèi)精密度和日間精密度分別在5.3%和8.0%以下，回收率>90.9%(表2)，滿足定量分析要求。液-質(zhì)聯(lián)用中基質(zhì)效應(yīng)體現(xiàn)在被測物的離子化程度會受到樣品中雜質(zhì)的影響，使結(jié)果升高或降低，如雜質(zhì)在某種程度上會抑制ESI離子源中被測物的電離[16]?；|(zhì)效應(yīng)強弱的評價標準是將被測物標準品加入到不含被測物成分的樣本中測定，與預(yù)期結(jié)果相比，觀察測定數(shù)據(jù)變化[17 - 18]。本研究采用處理后加標法考察基質(zhì)效應(yīng)，異鼠李素、蘆丁和表兒茶素沒食子酸酯的加標回收率范圍在90.9%～100.2%，接近100%，說明基質(zhì)對這3種黃酮成分的抑制效應(yīng)很弱。表兒茶素和槲皮素的加標回收率分別為90.9%和91.85%，表明這2種黃酮組分受基質(zhì)抑制作用相對較強。其他7種黃酮組分的加標回收率范圍在94.25%～97.6%之間，抑制作用較弱。結(jié)果表明，基質(zhì)對大部分黃酮成分有較低抑制效應(yīng)，且效應(yīng)不明顯。這可能由于各物質(zhì)已充分分離或樣品稀釋倍數(shù)較大，所以目標物質(zhì)的定量不受基質(zhì)影響。

表2 11種黃酮類化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LODs)、定量限(LOQs)和精密度

Note：1:isorhamnetin;2:quercetin;3:kaempferol;4:(-)-epigallocatechin;5:rutin;6:(-)-gallocatechingallate;7:naringenin;8:(-)-epicatechingallate;9:luteolin;10:naringin;11:L-epicatechin.

2.6 方法的實際應(yīng)用

采用本研究建立的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測沙棘種子和葉片中11種黃酮類化合物，檢測結(jié)果表明，不同種質(zhì)種子和種質(zhì)葉片中的不同黃酮類化合物間存在明顯差異。沙棘葉片中檢測出了除柚皮素外的10種黃酮類化合物，種子中檢測出了除山奈酚外的10種黃酮類化合物，結(jié)果見表3。

表3 11份沙棘種子中的10種黃酮類成分含量(μg/g)

Note：1:isorhamnetin;2:quercetin;3:(-)-epigallocatechin;4:rutin;5:(-)-gallocatechingallate;6:naringenin;7:(-)-epicatechingallate;8:luteolin;9:naringin;10:L-epicatechin； “-”:undetected；Totalcontent：sumofcontentsoftenflavonoids；Totalcontentofmailflavonoids:sumofcontentsof(-)-gallocatechingallate,(-)-epicatechingallate,rutinandquercetin.

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定沙棘種子和葉子中11種黃酮物質(zhì)的定量分析方法。將所建立的方法用于11份沙棘種質(zhì)樣品分析發(fā)現(xiàn)，不同種質(zhì)不同器官之間的黃酮類物質(zhì)含量相差很大，葉片中10種黃酮總含量明顯高于種子。本方法簡便快速、準確可靠、覆蓋面廣，可作為一種高通量快速測定沙棘種子和葉片中黃酮類化合物的方法，對沙棘種質(zhì)資源的選擇和開發(fā)利用具有重要意義。