直腸癌病理標(biāo)本大體腫瘤周邊微小癌灶距離的測(cè)定*

鮑緒杰 朱蘇雨 陳曉艷 劉科 周菊梅 吳崢 劉媛媛

局部進(jìn)展期直腸癌標(biāo)準(zhǔn)治療方式為術(shù)前新輔助放療和化療后再擇期行全直腸系膜切除術(shù)（total mesorectal excision，TME）。有研究提出對(duì)于新輔助放化療達(dá)到臨床完全緩解（clinical complete regression，cCR）的患者可“等待和觀察”，僅對(duì)其中“再生長(zhǎng)”患者行挽救性手術(shù)治療，其療效和標(biāo)準(zhǔn)治療相當(dāng)，且能免除部分患者的手術(shù)并保留肛門功能從而提高生存質(zhì)量［1-2］。因此，如何提高cCR率成為近期直腸癌新輔助治療臨床研究熱點(diǎn)。有薈萃分析表明，cCR率與直腸癌局部放療劑量呈線性關(guān)系［3］。但高劑量放療常受限于腫瘤周邊正常組織的放療并發(fā)癥。因此，如何精確確定大體腫瘤周邊微小癌灶距離(clinical target volume，CTV)是放療成功的關(guān)鍵。即明確CTV 在原發(fā)大體腫瘤體積（gross tumor volume，GTV）基礎(chǔ)上外擴(kuò)距離。手術(shù)病理標(biāo)本為測(cè)量和檢驗(yàn)此距離的“金標(biāo)準(zhǔn)”，尚缺乏直腸癌影像和病理標(biāo)本的病例對(duì)照研究。因而目前直腸癌放療中CTV的外擴(kuò)范圍尚缺乏統(tǒng)一共識(shí)，通常是四周外擴(kuò)1.5～2 cm、上下兩端各外擴(kuò)2～3 cm，這可能導(dǎo)致大量正常器官接受不必要的高劑量放射。

為嘗試解決上述問(wèn)題，本研究測(cè)量直腸癌病理標(biāo)本大體腫瘤外周微小癌灶距離，并將直腸癌術(shù)前影像與術(shù)后病理標(biāo)本一一對(duì)應(yīng)，計(jì)算手術(shù)標(biāo)本“在體-離體”和病理標(biāo)本處理過(guò)程退縮因子，經(jīng)退縮因子校正后得出“在體”微小癌灶延伸距離（microcarcinoma extension measuredin vivo，MEinvivo），從而為直腸癌后程高劑量放療GTV外擴(kuò)成CTV提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

分析2016年10月至2017年4月在湖南省腫瘤醫(yī)院行TME手術(shù)的28例直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）根據(jù)MRI臨床分期≥T3；2）術(shù)前未接受放療、化療和手術(shù)等治療；3）術(shù)前腸鏡提示為直腸單發(fā)腫瘤，排除多生發(fā)中心癌；4）術(shù)后病理診斷為腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和多重癌；2）有MRI禁忌證或嚴(yán)重疾病無(wú)法耐受手術(shù)者。

1.2 方法

1.2.1 術(shù)前影像獲取 患者取仰臥位，均行術(shù)前盆腔增強(qiáng)序列MRI。MRI 圖像上以T2WI 腸壁增厚，直腸壁黏膜、黏膜下層及肌層信號(hào)帶異常作為GTV 勾畫(huà)標(biāo)準(zhǔn)。由兩位消化道腫瘤影像診斷醫(yī)師對(duì)腫瘤進(jìn)行判定，當(dāng)存在較大差異時(shí)，相互協(xié)商或請(qǐng)第三位醫(yī)師進(jìn)行確認(rèn)。

1.2.2 病理標(biāo)本處理過(guò)程 大體標(biāo)本：28例患者均行TME手術(shù)，術(shù)后即時(shí)標(biāo)本沿腫瘤主體對(duì)側(cè)縱向剖開(kāi)，隨后將腫瘤切成均厚5 mm組織薄片，隔片取材，每片均由腸腔內(nèi)向外取直腸系膜全層，向上下兩端延伸包括肉眼腫瘤邊緣外至少2 cm正常腸組織。在無(wú)外力影響下，結(jié)合腫瘤與周邊正常組織解剖關(guān)系，將所得組織薄片盡可能復(fù)原與活體空間位置相當(dāng)，以大頭針固定于泡沫板?？紤]臨床實(shí)際，直腸癌側(cè)方及上下方向微小癌灶測(cè)量方式有別，故沿大體腫瘤邊緣垂直于直腸系膜將其分為大體腫瘤側(cè)方、下方和上方（basis of measurement，BM）（圖1）。另取腫瘤帶直腸系膜筋膜組織一片，在腫瘤橫斷面中點(diǎn)打一手術(shù)線結(jié)作為標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)Ax，在系膜筋膜四角及標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)下方各打一手術(shù)線結(jié)作為參考點(diǎn)Bx（1，2，3，4，5），以相同方式固定（圖2）。最后，將整塊泡沫板倒置于10%福爾馬林固定液24 h，脫水、浸蠟、包埋制成蠟塊。

圖1 腫瘤“離體”和“在體”厚度測(cè)量與R1的計(jì)算

圖2 R2的測(cè)量與計(jì)算

病理標(biāo)本：所得蠟塊連續(xù)切片（厚度為4 μm），所有切片均予伊紅和美藍(lán)染色，由高年資病理科醫(yī)師在不借鑒任何資料的情況下，首先在低倍鏡下總覽整個(gè)切片，勾畫(huà)出原發(fā)大體腫瘤邊緣，若原發(fā)灶邊緣呈小毛刺狀浸潤(rùn)，則貼近毛刺根部勾畫(huà)，同時(shí)在病理切片上勾畫(huà)出最遠(yuǎn)微小癌灶，其定義為顯微低倍鏡下大體腫瘤邊緣外癌細(xì)胞和癌巢外延距離，微小癌灶包括腫瘤出芽（＜5個(gè)癌細(xì)胞團(tuán)）、腸周癌結(jié)節(jié)、淋巴管侵犯形成的癌結(jié)節(jié)、血管侵犯形成的癌結(jié)節(jié)和神經(jīng)鞘侵犯形成的癌結(jié)節(jié)。直腸癌大體腫瘤下方和上方實(shí)測(cè)微小癌灶延伸距離為最遠(yuǎn)微小癌灶距BM最近直線距離（microcarcinoma extension measured inferiorly/microcarcinoma extension measured superiorly，MEmi/MEms）；直腸癌側(cè)方實(shí)測(cè)微小癌灶延伸距離為最遠(yuǎn)微小癌灶距原發(fā)大體腫瘤邊緣最近直線距離（microcarcinoma extension measured laterally，MEml）（圖3A）。

1.2.3 腫瘤組織退縮因子計(jì)算 直腸癌行TME手術(shù)及術(shù)后標(biāo)本制成病理切片過(guò)程存在腫瘤變形和退縮，其退縮因子分為兩步計(jì)算：在體腫瘤經(jīng)由手術(shù)離體后，因缺乏周圍盆腔筋膜的牽拉發(fā)生第一次退縮，將此定義為“在體-離體”退縮因子（R1）；離體腫瘤在制成病理標(biāo)本過(guò)程中由于組織脫水發(fā)生第二次退縮，稱為病理退縮因子（R2）。

圖3 微小癌灶距離測(cè)量示意圖及微小癌灶類型

R1的測(cè)算：取直腸癌即時(shí)標(biāo)本最中間組織片（圖1A），紅色區(qū)域?yàn)榇篌w腫瘤，綠色區(qū)域?yàn)檎Ｄc黏膜，腫瘤中點(diǎn)垂直于直腸系膜的黃色實(shí)線代表離體腫瘤厚度，標(biāo)記為Dpath。獲取患者所有腫瘤出現(xiàn)層面的MRI T2WI影像（層厚3 mm，層距1 mm），選取最中間層面（圖1B），其中紅色區(qū)域代表大體腫瘤，腫瘤中點(diǎn)垂直于直腸系膜的黃色實(shí)線代表腫瘤在體厚度，標(biāo)記為DMR。據(jù)此R1采用如下公式計(jì)算：R1=Dpath/DMR。

R2的測(cè)算（圖2）：通過(guò)即刻術(shù)后標(biāo)本及組織蠟塊上Ax與Bx（1，2，3，4，5）各點(diǎn)間相對(duì)位置的改變計(jì)算R2，其公式為：

MEinvivo計(jì)算：通過(guò)逐例計(jì)算R1、R2、MEmi、MEms、MEml，則MEinvivo=MEmi/（R1×R2）或MEms/（R1×R2）或MEml/（R1×R2）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)28例患者大體腫瘤側(cè)方、下方、上方MEinvivo及95%頻數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1 病理特征

研究共納入28例患者，臨床病理特征見(jiàn)表1。其中男性17 例（60.7%），女性11 例（39.3%），平均年齡61.9（41～80）歲。腫瘤分布以中低位直腸癌為主（19例），腫瘤分化以中分化為主（24 例），有腸旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者13例（46.4%）。

表1 28例直腸癌患者臨床病理資料

2.2 微小癌灶類型統(tǒng)計(jì)及MEin vivo

28例直腸癌患者中，在大體腫瘤側(cè)方、下方主上方可觀察到微小癌灶者分別為17 例（60.7%）、3 例（10.7%）和0。微小癌灶最常見(jiàn)的類型為淋巴管性癌結(jié)節(jié)12例（42.9%）、腫瘤出芽9例（32.1%）、腸周癌結(jié)節(jié)5例（17.9%）、血管性癌結(jié)節(jié)2例（7.1%）、神經(jīng)源性癌結(jié)節(jié)0 例（圖3B～E）。經(jīng)兩種退縮因子校正后，MEinvivo在大體腫瘤下方者有3 例，分別為23.24 mm、11.32 mm 和28.06 mm；MEinvivo在大體腫瘤側(cè)方者有17例，其最大值為12.03 mm，最小值為3.13 mm，平均值為7.50 mm（表2）。根據(jù)頻數(shù)表法，28 例患者側(cè)方微小癌灶侵襲范圍95%頻數(shù)值在10 mm內(nèi)（表3）。

表2 17例患者大體腫瘤側(cè)方微小癌灶類型、距離、退縮因子及MEin vivo

表3 28例患者大體腫瘤側(cè)方MEin vivo頻數(shù)值

3 討論

局部晚期直腸癌標(biāo)準(zhǔn)治療模式推薦為術(shù)前聯(lián)合放化療加TME［4］。出于患者生存質(zhì)量和功能保全的考慮，經(jīng)新輔助治療達(dá)cCR后行“等待和觀察”有望成為其治療新策略。此策略由Habr-Gama等［5］于2004年首次報(bào)道265例低位直腸癌患者行新輔助同步放療和化療，71例（27%）達(dá)cCR，行“等待和觀察”，其5年總生存期（overall survival，OS）和無(wú)病生存期（disease free survival，DFS）優(yōu)于未達(dá)cCR選擇手術(shù)的患者。近期一項(xiàng)涉及15個(gè)國(guó)家47家獨(dú)立研究機(jī)構(gòu)的“等待和觀察”數(shù)據(jù)顯示，880例達(dá)cCR的直腸癌患者采用“等待和觀察”策略，其5年OS為85%，5年DFS為94%［1］。據(jù)此可見(jiàn)，經(jīng)新輔助治療達(dá)cCR后行“等待和觀察”與傳統(tǒng)手術(shù)患者的療效相當(dāng)，而無(wú)造口生存期顯著延長(zhǎng)，這成為中低位進(jìn)展期直腸癌的治療新選擇，其優(yōu)勢(shì)在于避免了手術(shù)和手術(shù)相關(guān)的并發(fā)癥，并維持了較好的療效和較高的生存質(zhì)量；其不足之處為cCR率（27%～78%）因治療強(qiáng)度導(dǎo)致不同研究報(bào)道差異較大［5-8］。因此，如何獲得穩(wěn)定且高效的cCR率成為近期研究熱點(diǎn)。Appelt等［8］采用高劑量放療（直腸病灶60 Gy/30次，淋巴結(jié)預(yù)防區(qū)域50 Gy/30次，腔內(nèi)照射推量5 Gy），同步口服卡培他濱化療，入組51例低位直腸癌患者（T2～3N0～1M0），其中40例（78%）達(dá)cCR，行“等待和觀察”，1年局部復(fù)發(fā)率為15.5%，均成功行外科手術(shù)解救治療。一項(xiàng)關(guān)于直腸癌放療強(qiáng)度與cCR率的量效研究［9］發(fā)現(xiàn)，放療反應(yīng)率在放療劑量達(dá)60 Gy后呈指數(shù)增長(zhǎng)，當(dāng)放療劑量達(dá)92 Gy時(shí)，約50%患者可達(dá)cCR，認(rèn)為提高局部放療劑量可以提升直腸癌cCR率。但較大范圍照射靶區(qū)接受高劑量放療有可能影響手術(shù)并增加手術(shù)并發(fā)癥，對(duì)低位直腸癌也可能影響肛門括約肌復(fù)合體的功能，從而影響患者治療后的生存質(zhì)量。因此，如何精確確定直腸癌原發(fā)大體腫瘤及其亞臨床病變范圍顯得尤為關(guān)鍵。病理標(biāo)本為檢測(cè)此范圍準(zhǔn)確性的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但既往關(guān)于直腸癌大體腫瘤周邊微小癌灶分布情況的研究，其方法學(xué)均存在不足：大部分研究?jī)H考慮直腸癌上方和下方的微小癌灶，忽略了微小癌灶分布密度最高的直腸癌側(cè)方，使得最終測(cè)量結(jié)果存在遺漏［10-11］；另外部分研究［12-13］直接將固定后病理標(biāo)本中微小癌灶與大體腫瘤之間距離定義為微小癌灶距離，忽視了手術(shù)切除和病理標(biāo)本處理過(guò)程中直腸腫瘤組織退縮。本次研究結(jié)果表明，直腸癌手術(shù)標(biāo)本R1平均值為0.913，R2平均值為0.803，忽視上述兩部分退縮顯然不恰當(dāng)。因此，在充分考慮上述不足的基礎(chǔ)上，本研究建議如下改進(jìn)：1）沿腸管長(zhǎng)軸方向?qū)⒋篌w腫瘤連同完整直腸系膜切成均厚5 mm組織薄片，使每片薄片同時(shí)含有腫瘤組織與直腸系膜，以保證可同時(shí)測(cè)量大體腫瘤側(cè)方、下方和上方微小癌灶距離；2）首次應(yīng)用MRI影像和即刻術(shù)后標(biāo)本計(jì)算R1及“線結(jié)標(biāo)記法”計(jì)算R2，將術(shù)前影像與術(shù)后病理標(biāo)本一一對(duì)應(yīng)，從而更精確測(cè)量和計(jì)算MEinvivo，為直腸癌術(shù)前高劑量放療精確勾畫(huà)CTV邊徑提供科學(xué)數(shù)據(jù)參考。

本研究微小癌灶檢出率為60.7%（17/28），高于繼往研究結(jié)果（17%～43%）［14-16］，這與標(biāo)本收集時(shí)，取材的傾向性有關(guān)，本研究初期入組42例，在后續(xù)病理切片制作時(shí)，排除14例腸管壁肌層連續(xù)者（即病理分期≤pT2），最終入組28例（包含5例pT2，但直腸肌層連續(xù)性中斷病例）。在提高微小癌灶檢出率的同時(shí)也提升最終結(jié)果的臨床意義。參照既往研究分類［15-17］，本研究中所定義的微小癌灶包括腫瘤出芽（32.1%）、腸周癌結(jié)節(jié)（17.9%）、淋巴管性癌結(jié)節(jié)（42.9%）、血管性癌結(jié)節(jié)（7.1%）和神經(jīng)源性癌結(jié)節(jié)（0），本次標(biāo)本中并未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)源性癌結(jié)節(jié)，這與標(biāo)本數(shù)量有限有關(guān)。

經(jīng)各自退縮因子校正后，3例患者大體腫瘤下方MEinvivo分別為23.24 mm、11.32 mm 和28.06 mm，由于在體最遠(yuǎn)距離為28 mm。因此，CTV邊徑在上下兩端外放時(shí)，30 mm 的距離已足夠覆蓋靶區(qū)，這與Ono等［15］的結(jié)果一致。17例患者大體腫瘤側(cè)方MEinvivo平均為7.50 mm，64.7%（11/17）的病例距離分布在6～10 mm 之間，若＞10 mm，其微小癌灶密度急劇下降。根據(jù)28例直腸癌患者側(cè)方微小癌灶距離頻數(shù)分布情況，可知側(cè)方微小癌灶侵襲范圍95%頻數(shù)值在10 mm內(nèi)，說(shuō)明直腸癌后程高劑量放療靶區(qū)在前后左右方向GTV 外擴(kuò)CTV 時(shí)邊徑僅需10 mm。大部分放療科醫(yī)師在此方向外擴(kuò)值為15～20 mm，通常包括整個(gè)直腸系膜區(qū)，結(jié)合本研究結(jié)果，這種外擴(kuò)邊徑在直腸癌后程局部推量放療時(shí)顯得過(guò)大。此外，受限于入組病例例數(shù)，本研究暫無(wú)法行腫瘤的病理分級(jí)及臨床分期與其外侵范圍相關(guān)性分析，且既往文獻(xiàn)尚缺乏相關(guān)報(bào)道，后續(xù)擴(kuò)充樣本量以明確外侵范圍與兩者間關(guān)系。最后，本研究在測(cè)量直腸標(biāo)本“在體-離體”退縮上仍存在不足：由于MRI 掃描層厚及層間距的原因，影像與病理標(biāo)本上所測(cè)腫瘤層面存在一定誤差，導(dǎo)致最終所測(cè)微浸潤(rùn)距離存在細(xì)微偏差，如果在腫瘤中心及四周植入金屬標(biāo)記物，在體影像和離體組織中，其相對(duì)距離的改變將能更為精準(zhǔn)的測(cè)量“在體-離體”組織的退縮因子。

綜上所述，本研究從病理標(biāo)本測(cè)量報(bào)道28 例直腸癌患者側(cè)方微小癌灶侵襲范圍95%頻數(shù)值在10 mm 內(nèi)。建議直腸癌后程高劑量放療靶區(qū)在前后左右方向GTV外擴(kuò)成CTV時(shí)邊徑為10 mm。