何首烏有效成分對(duì)大鼠骨癌痛的鎮(zhèn)痛效果

張翼 洪雪琪 段坦炎 時(shí)鵬 楊敏 何并文 林飛

何首烏是始載于《開(kāi)寶本草》的中草藥，為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb的根部，其性微溫，味苦、甘澀。研究表明，何首烏的化學(xué)成分包括二苯乙烯苷類、大黃素和兒茶素類等化合物，具有抗衰老、提高免疫力、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗菌、抗癌、抗誘變等藥理作用［1]。張又枝［2]研究發(fā)現(xiàn)何首烏中的 2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D 葡萄糖苷具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，可能與抑制局部炎癥介質(zhì)如前列腺素和5-羥色胺的釋放、直接抑制PGE2和COX-2合成有關(guān)。LI等［3]研究發(fā)現(xiàn)納米粒子包裹大黃素通過(guò)減少由背根神經(jīng)節(jié)嘌呤2X3受體介導(dǎo)的2型糖尿病大鼠的興奮性傳遞減輕病理性神經(jīng)痛。此外，研究表明兒茶素通過(guò)調(diào)節(jié)胰腺癌不同的信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤進(jìn)展［4]。然而，何首烏是否對(duì)癌痛具有鎮(zhèn)痛效果及其有效成分尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立大鼠骨癌痛模型，采用何首烏有效成分單體灌胃，探討其鎮(zhèn)痛效果。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源及分組

36只雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，4周齡，體重（100±20）g。分籠飼養(yǎng)于不銹鋼鼠籠，室溫控制在（23±1）℃，相對(duì)濕度（70±10）%，自由飲水?dāng)z食。walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞購(gòu)自上海中喬新舟生物有限公司。經(jīng)4周適應(yīng)期后，將36只雌性SD大鼠隨機(jī)分成3組：A組大鼠為正?？瞻讓?duì)照（n=6），B組大鼠注射無(wú)菌生理鹽水（n=6），C組大鼠左后腿脛骨注射walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞建立骨癌痛模型（n=24）。建立骨癌痛模型的C組SD大鼠按灌胃藥物隨機(jī)分成C1、C2、C3、C4 4組，每組6只。建模后 14 d、15 d、16 d連續(xù)對(duì)C1組大鼠灌胃生理鹽水（2 mL）；C2組大鼠灌胃二苯乙烯苷（60 mg/mL，2 mL）；C3組大鼠灌胃大黃素（60 mg/mL，2 mL）；C4組大鼠灌胃兒茶素（60 mg/mL，2 mL）。

1.2 主要試劑

DMSO、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS溶液和胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Von Frey纖維絲痛閾測(cè)試包購(gòu)自美國(guó)stoelting公司；何首烏有效成分二苯乙烯苷單體、大黃素和兒茶素購(gòu)自上海瑞永生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2和100%濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至占滿觀察視野90%以上時(shí)傳代，2～3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、活力旺盛且無(wú)變形的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)量到2×107個(gè)/mL置于清潔試管中備用。

1.4 大鼠骨癌痛模型的建立

參照姚明等［5]研究建立大鼠骨癌痛模型。取1 mL walker256腫瘤細(xì)胞，注射到體重為80 g左右的24只雌性SD大鼠腹腔中，腹水培養(yǎng)7 d。7～9 d后觀察到SD大鼠腹部明顯腫大，脫頸處死大鼠后抽取腹水，1 000 r/min離心5 min，除去上清液，沉淀細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基清洗3次，重新計(jì)數(shù)并調(diào)整到1×108個(gè)/mL，置于冰盒內(nèi)備用。將24只C組大鼠手術(shù)并于左后腿脛骨注射walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞建立骨癌痛模型。具體如下：大鼠腹腔注射10%水合氯酸（3 mL/kg）麻醉后，左側(cè)膝關(guān)節(jié)部位備皮。左手固定膝關(guān)節(jié)，用小型鐘表拿子在膝關(guān)節(jié)髕韌帶內(nèi)側(cè)緣沿脛骨縱軸往脛骨遠(yuǎn)端鉆孔，用微量移液器抽取腫瘤細(xì)胞15～20 μL（或無(wú)菌生理鹽水 15～20 μL），緩緩注射。注射完成后固定15～20 s，然后緩慢拔出，最后用醫(yī)用骨蠟封好鉆孔。使用酒精棉球消毒并擦除溢出的腫瘤細(xì)胞，逐層縫合。

1.5 脛骨HE染色切片

建模后14 d，每組隨機(jī)取1只大鼠并脫頸處死，分離出新鮮脛骨，經(jīng)脫鈣、石蠟包埋后行蘇木素-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤情況及脛骨骨質(zhì)破壞情況。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

機(jī)械性異常性疼痛是骨癌疼痛的行為學(xué)標(biāo)志，通過(guò)測(cè)量50%縮爪閾值（突然抬起、舔舐或移開(kāi)所刺激的后足）來(lái)評(píng)估機(jī)械性痛閾。將SD大鼠放在鐵網(wǎng)上，覆蓋倒置的透明塑料籠，提前20 min放入適應(yīng)。透明塑料籠從低到高放置 Von Frey細(xì)絲（1.4 g、2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、10.0 g、15.0 g 和 26.0 g）。每次測(cè)量都使垂直于足底傳遞的Von Frey力作用于左側(cè)腳掌中部，纖維絲彎曲成S形，持續(xù)4～6 s。刺激期間或之后出現(xiàn)1次突然抬起、舔舐或移開(kāi)所刺激的后足記錄為1次陽(yáng)性反應(yīng)。當(dāng)有陽(yáng)性或陰性反應(yīng)時(shí)，下一次分別施加較弱或較強(qiáng)的單位。每一刻度Von Frey纖維絲進(jìn)行5次測(cè)量，出現(xiàn)3次或以上陽(yáng)性（陰性）反應(yīng)則認(rèn)為該刻度有效（無(wú)效）。若刻度小于1.4 g，動(dòng)物也未做出反應(yīng)，則記錄為1.4 g；反之，記錄該值為30.0 g。當(dāng)測(cè)量出結(jié)果小于4.0 g時(shí)，則認(rèn)為大鼠出現(xiàn)痛覺(jué)超敏現(xiàn)象［6]。在術(shù)前 1 d、術(shù)后 1 d、術(shù)后 3 d、術(shù)后 5 d、術(shù)后7 d、術(shù)后10 d和術(shù)后14 d分別對(duì)A組、B組和C組SD大鼠進(jìn)行痛閾測(cè)量。術(shù)后14 d開(kāi)始，對(duì)C1～C4組大鼠進(jìn)行連續(xù)3 d的灌胃。在灌胃前、灌胃后30 min和灌胃后1 h對(duì)大鼠進(jìn)行痛閾測(cè)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，若整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)；每組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析，評(píng)價(jià)其時(shí)間效應(yīng)、組間效應(yīng)和交互效應(yīng)。本研究以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 每組大鼠機(jī)械痛閾的改變

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，組間效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19.789，P＜0.001），提示排除時(shí)間效應(yīng)影響，各組大鼠機(jī)械痛閾值有差異；時(shí)間效應(yīng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.673，P=0.060），提示各組大鼠機(jī)械痛閾值不隨時(shí)間變化而變化；交互效應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.673，P=0.091），提示各組大鼠機(jī)械痛閾值時(shí)間變化趨勢(shì)相同。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，A組和B組大鼠各時(shí)點(diǎn)的機(jī)械痛閾值差異均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。C組大鼠術(shù)后7 d、10 d和14 d機(jī)械痛閾值較A組B組大鼠同期明顯降低（P＜0.05），且C組大鼠術(shù)后7 d、10 d和14 d機(jī)械痛閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。C組大鼠術(shù)后7 d機(jī)械痛閾值較術(shù)后第5天明顯降低（t=7.885，P=0.001），其余時(shí)點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 1。

表1 每組大鼠機(jī)械痛閾的比較Tab.1 Comparison of mechanical pain thresholds in each group of rats

2.2 各組大鼠骨質(zhì)破壞情況

鏡下觀察可見(jiàn)A組和B組大鼠脛骨骨質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密且骨小梁完整，骨細(xì)胞清晰可辨，骨小梁邊緣有許多成骨細(xì)胞成行排列；C1～C4組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)排列紊亂，邊緣模糊，骨質(zhì)破壞明顯，伴隨細(xì)胞核分裂增多，腫瘤細(xì)胞在骨髓腔內(nèi)聚集浸潤(rùn)，表明骨癌痛大鼠脛骨組織被腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)侵襲并出現(xiàn)損傷。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠左后腿脛骨HE染色結(jié)果（HE×400）Fig.1 HE staining results of the left hind leg tibia in rats（HE×400）

2.3 何首烏提取物對(duì)骨癌痛模型大鼠機(jī)械痛閾的影響

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，C1～C4組大鼠術(shù)后14 d、15 d和16 d的機(jī)械痛閾值組間效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示排除時(shí)間效應(yīng)影響，各組大鼠機(jī)械痛閾值有差異；時(shí)間效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示各組大鼠機(jī)械痛閾值隨時(shí)間變化而變化；交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示各組大鼠機(jī)械痛閾值時(shí)間變化趨勢(shì)不相同，見(jiàn)表2。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與灌胃前比較，C2組大鼠術(shù)后14～16 d灌胃后30 min和1 h的機(jī)械痛閾明顯升高（P＜0.05）。但灌胃后30 min和1 h的機(jī)械痛閾差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。C2組大鼠術(shù)后14～16d灌胃后30 min和1 h的機(jī)械痛閾較其余3組均明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 C1～C4組大鼠術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)的機(jī)械痛閾重復(fù)測(cè)量方差分析Tab.2 Repeated measurement analysis of variance of pain threshold at different time points in rats in C1-C4 group

表3 C1～C4組大鼠灌胃前、灌胃后30 min、灌胃后1.0 h機(jī)械痛閾改變Tab.3 Pain threshold changes in rats in C1-C4 group before gavage，30 min after gavag，and 1 h after gavage

3 討論

癌痛是晚期癌癥患者最常見(jiàn)的癥狀之一，骨癌導(dǎo)致的疼痛包括癌癥進(jìn)展導(dǎo)致的侵襲性疼痛和神經(jīng)性疼痛［6-7]。癌痛治療是長(zhǎng)期的過(guò)程，鎮(zhèn)痛藥物長(zhǎng)期給藥導(dǎo)致的臨床耐受和帶來(lái)的不良反應(yīng)是治療中的難題。阿片類藥物雖可有效鎮(zhèn)痛，但成癮性和嚴(yán)重的副作用限制了其應(yīng)用［8]。為了對(duì)癌痛機(jī)制進(jìn)行更深入探討，尋找緩解癌痛的新辦法和篩選更有效的鎮(zhèn)痛途徑，中藥鎮(zhèn)痛受到了越來(lái)越多關(guān)注和研究。中藥對(duì)急性或慢性疼痛均能起到一定的鎮(zhèn)痛作用，其低成癮性和較少的副作用有望成為新的鎮(zhèn)痛選擇。何首烏的藥理、藥代動(dòng)力學(xué)等研究證實(shí)其具有一定的臨床作用，包括抗衰老作用、降血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化作用、心肌保護(hù)作用、免疫保護(hù)作用、保肝作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗菌作用等［9]，但是在何首烏及其活性成分是否對(duì)癌痛治療有效未進(jìn)行更深一步的研究。本研究通過(guò)成功構(gòu)建大鼠骨癌痛模型，同時(shí)進(jìn)行何首烏有效成分單體進(jìn)行灌胃，發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷可有效緩解骨癌痛。

癌癥進(jìn)展導(dǎo)致動(dòng)物模型在不同時(shí)期表現(xiàn)出不同的行為，早期多表現(xiàn)為熱覺(jué)過(guò)敏和機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏，晚期熱覺(jué)痛敏與機(jī)械誘發(fā)痛同時(shí)存在［10]。本研究發(fā)現(xiàn)，A組和B組大鼠各時(shí)點(diǎn)機(jī)械痛閾及HE染色骨質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，而C組大鼠術(shù)后7 d、10 d和14 d機(jī)械痛閾明顯降低；骨質(zhì)失去正常形態(tài)，結(jié)構(gòu)排列紊亂，邊緣模糊，骨質(zhì)破壞明顯，伴細(xì)胞核分裂增多，腫瘤細(xì)胞在骨髓腔內(nèi)聚集浸潤(rùn)，表明骨癌痛模型成功構(gòu)建。

研究證明，何首烏主要有效成分為蒽醌類、二苯乙烯類、磷脂類、黃酮類和酚類［2]。本研究分別以蒽醌類、二苯乙烯類和兒茶素對(duì)骨癌痛大鼠進(jìn)行灌胃，發(fā)現(xiàn)在連續(xù)3 d的灌胃實(shí)驗(yàn)中，二苯乙烯苷的鎮(zhèn)痛效果較其他成分更顯著，且隨時(shí)間變化的趨勢(shì)不同，表明中藥何首烏中二苯乙烯類化合物對(duì)骨癌痛具有鎮(zhèn)痛作用。腫瘤細(xì)胞可分泌大量腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素（interleukin，IL）和前列腺素E2等因子，這些因子均可促進(jìn)NF-κB表達(dá)加重炎癥導(dǎo)致疼痛［11-13]。二苯乙烯苷則可抑制腫瘤細(xì)胞促炎因子如TNF-α，IL-1β和IL-6的釋放，同時(shí)降低NF-κB蛋白表達(dá)水平，發(fā)揮抗炎和抗氧化性的作用［14]。FAN等［15]研究發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷劑量依賴性的減輕小鼠后爪的腫脹和疼痛，可能與二苯乙烯苷抑制扣帶回前皮質(zhì)含N-甲基-d-天冬氨酸受體的GluN2B上調(diào)和GluN2A下調(diào)、增加Bcl-2而降低Bax和Caspase-3的表達(dá)、抑制p38磷酸化及保護(hù)神經(jīng)元存活率等有關(guān)。環(huán)氧化酶-2在食管癌、胃癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌中呈過(guò)度激活狀態(tài)［16-17]，提示環(huán)氧化酶-2可能是多種腫瘤細(xì)胞引起組織發(fā)生炎癥和疼痛的重要物質(zhì)。應(yīng)用環(huán)氧化酶-2抑制劑則對(duì)多種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出了抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用［18]，所以二苯乙烯苷可能在細(xì)胞水平抑制環(huán)氧化酶-2活性而達(dá)到鎮(zhèn)痛效果。

綜上所述，本研究表明何首烏可有效降低大鼠的骨癌痛，其有效單體成分是二苯乙烯苷。但本研究樣本量較少、具體機(jī)制及在細(xì)胞層面的研究尚不明確，今后本課題組將擴(kuò)大樣本量、進(jìn)行體內(nèi)和體外的鎮(zhèn)痛機(jī)制研究，為何首烏用于臨床鎮(zhèn)痛提供理論依據(jù)。