免疫磁珠分選的口腔鱗狀細(xì)胞癌干細(xì)胞誘導(dǎo)分化及成瘤活性研究

廖顯翔 房芳 羊良慧 陳國(guó)生 王代友 彭劍波 劉詩(shī)奇 麥華明

口腔腫瘤是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，95%以上來(lái)源于口腔黏膜的鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）［1]。腫瘤干細(xì)胞是一群具有自我更新、多向分化潛能，可啟動(dòng)腫瘤發(fā)生并維持腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞［2]。干細(xì)胞在腫瘤中的數(shù)量很少，但與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)息息相關(guān)［3]。腫瘤干細(xì)胞具有多種表面標(biāo)志物，如 CD44、醛脫氫酶（ALDH）、CD133和CD117等，而CD44及CD133廣泛用于OSCC干細(xì)胞鑒定［4]。CD133是一種具有5個(gè)跨膜區(qū)域的細(xì)胞表面糖蛋白分子，因其表達(dá)水平隨分化迅速下調(diào)，可將其作為干細(xì)胞的特定分子標(biāo)志物［5-6]。本實(shí)驗(yàn)采用干細(xì)胞標(biāo)志物CD44及CD133，通過(guò)免疫磁珠分選法從6例原代OSCC細(xì)胞中分別分選出CD44或CD133表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，并檢測(cè)其分選純度，觀察其多向分化能力及在體內(nèi)的成瘤活性，以進(jìn)一步了解其生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

PBS液、DMEM培養(yǎng)液及0.25%胰酶購(gòu)自加拿大維森特公司，胎牛血清購(gòu)自南美LONSERA公司，鼠抗人CD44、CD133單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) BD公司，CD44、CD133 免疫磁珠抗體、autoMACSRunningBuffer-MACS Separation Buffer、Mini&MidiMACS Starting Kit 購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司，4%中性甲醛、無(wú)水乙醇、酒精、氨水、10%福爾馬林固定液及二甲苯購(gòu)自諸暨市和諧科技有限公司，蘇木精水溶液、伊紅染色液購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司，成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)液試劑盒及成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)液試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽業(yè)公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自南京Vazyme公司。倒置顯微鏡購(gòu)自日本OlymPus公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司，移液槍購(gòu)自德國(guó)EPPendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。18只4至6周齡裸鼠購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，于無(wú)特定病原體屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，維持正常飲食。OSCC原代細(xì)胞由本課題組前期培養(yǎng)［7] 。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CD44+/CD133+細(xì)胞的分選 將前期研究中生長(zhǎng)良好的OSCC細(xì)胞［7]采用80 μL Buffer溶液制成單細(xì)胞懸液后與CD44+/CD133+免疫磁珠20 μL混勻，放入4℃冰箱，孵化15 min后離心，棄上清液，2 mL Buffer溶液洗滌，加入Buffer溶液將細(xì)胞重懸。按要求擺放分選架及CD44+/CD133+分選柱，依次注入3 mL Buffer溶液與細(xì)胞懸液，以3 mL Buffer溶液重復(fù)沖洗分選柱3次，在柱下收集未標(biāo)記細(xì)胞。將分選柱撤離磁場(chǎng)并用5 mL Buffer溶液沖洗，獲得標(biāo)記細(xì)胞，最后將細(xì)胞離心種瓶，2 d后換液。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選所得細(xì)胞中 CD44、CD133的表達(dá) 將分選傳代培養(yǎng)的CD133+、CD44+細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，離心后將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入95 μL的PBS溶液與5 μL的CD44、CD133抗體，對(duì)照組則加入95 μL的PBS溶液與5 μL的CD44、CD133同型對(duì)照，充分混勻后放入4℃冰箱孵化30 min，離心，棄上清液后加入400 μL的PBS溶液，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化 成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)液按試劑盒說(shuō)明書(shū)配制。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的OSCC細(xì)胞、CD44+細(xì)胞和CD133+細(xì)胞接種于6孔板，均分為誘導(dǎo)分化組與非誘導(dǎo)分化組，用含14%血清培養(yǎng)液在相同條件下培養(yǎng)。誘導(dǎo)分化組細(xì)胞生長(zhǎng)至單孔面積60%～70%時(shí)，PBS沖洗后每孔加入2 mL配好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)液，每隔3 d換新鮮的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)液，期間觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)狀況，3周后誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束，以茜素紅染色。

1.3.4 成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化 成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)液按試劑盒說(shuō)明書(shū)配制。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的OSCC細(xì)胞、CD44+細(xì)胞和CD133+細(xì)胞接種于6孔板，均分為誘導(dǎo)分化組與非誘導(dǎo)分化組，以含14%血清培養(yǎng)液在相同條件下培養(yǎng)。誘導(dǎo)分化組細(xì)胞生長(zhǎng)至單孔面積的60%～70%時(shí)，PBS沖洗后每孔加入2mL配制好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)液A，于第3天換配制好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂維持液B，加入維持液B的第2天，以A液繼續(xù)誘導(dǎo)分化，經(jīng)3～5個(gè)周期反復(fù)誘導(dǎo)與維持，期間觀察其細(xì)胞的形態(tài)變化及其生長(zhǎng)情況，誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4周后，均油紅O染色。

1.3.5 OSCC干細(xì)胞的細(xì)胞周期測(cè)定 將純化傳代的OSCC細(xì)胞、CD44+細(xì)胞及CD133+細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組均約為1×106個(gè)，于避光條件下加入1mL DNA Staining solution和 10 μL破膜劑，混勻振蕩 10 s。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)前將樣本孵育30 min。

1.3.6 OSCC干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線 將CD133+細(xì)胞接種于96孔板中，500個(gè)/孔，每個(gè)時(shí)間組設(shè)置6個(gè)孔，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于 0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d取出6孔板，測(cè)量孔加入10 μL CCK-8試劑，在避光條件下培養(yǎng)2 h，然后采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值（OD值）。細(xì)胞倍增時(shí)間按以下公式計(jì)算：TD=t×lg2/（lgNt-lgN0）（TD為細(xì)胞倍增時(shí)間，t為培養(yǎng)時(shí)間，Nt為培養(yǎng) t h的 OD值，N0為接種后的 OD值）。

1.3.7 體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期純化傳代的OSCC細(xì)胞、CD44+細(xì)胞及CD133+細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液注射于6只裸鼠的右上肢腋下皮下（CD133+細(xì)胞）、左上肢腋下皮下（CD44+細(xì)胞）及右下肢根部皮下（未分選的OSCC細(xì)胞）。每周測(cè)量裸鼠體重并取出其中1只裸鼠的腫瘤標(biāo)本，直至6只裸鼠腫瘤標(biāo)本全部取出。

1.3.8 HE染色 以10%甲醛溶液將裸鼠的腫瘤標(biāo)本固定，以石蠟進(jìn)行包埋、切片后行HE染色。倒置顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 CD44、CD133在免疫磁珠法分選后細(xì)胞中的表達(dá)情況

免疫磁珠分選法成功獲得CD44+細(xì)胞及CD133+細(xì)胞，其純度分別為94.69%和94.33%，見(jiàn)圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫磁珠分選獲得的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中CD133、CD44的表達(dá)Fig.1 The expression of oral squamous cell carcinoma CD133 and CD44 after sorting

2.2 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化

在OSCC細(xì)胞、CD44+細(xì)胞和CD133+細(xì)胞中，非誘導(dǎo)分化組細(xì)胞為多邊形，可見(jiàn)為鋪路石狀，染色改變不明顯（圖2A、圖3A、圖4A），染色較誘導(dǎo)分化組淡（圖2B、圖3B、圖4B）。誘導(dǎo)分化組細(xì)胞在誘導(dǎo)期間無(wú)法長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔，且形態(tài)不規(guī)則，無(wú)明顯鋪路石形態(tài)，邊角圓鈍（圖2C、圖3C、圖4C），紅色鈣結(jié)節(jié)散在生成（圖 2D～F、圖 3D～F、圖 4D～F）。

圖2 口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化Fig.2 Osteogenic differentiation of oral squamous cell carcinoma cells

圖3 CD44+細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化Fig.3 Osteogenic differentiation of CD44+cells

圖4 CD133+細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化Fig.4 Osteogenic differentiation of CD133+cells

2.3 成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化

在OSCC細(xì)胞、CD44+細(xì)胞和CD133+細(xì)胞中，非誘導(dǎo)分化組細(xì)胞形態(tài)為多邊形，呈鋪路石狀（圖5A、圖6A、圖7A），經(jīng)油紅O染色后未見(jiàn)明顯染色改變，顏色較誘導(dǎo)分化組淺（圖5B、圖6B、圖7B）。誘導(dǎo)分化組細(xì)胞在誘導(dǎo)期間呈不規(guī)則形態(tài)，鋪路石形態(tài)逐漸消失，細(xì)胞形態(tài)逐漸呈圓形，聚集成團(tuán)，其中間可見(jiàn)脂滴形成（圖5C、圖6C、圖7C），經(jīng)油紅O染色后可見(jiàn)明顯散在紫紅色脂滴形成（圖 5D～F、圖6D～F、圖7D～F）。

2.4 OSCC干細(xì)胞的細(xì)胞周期測(cè)定

CD133+細(xì)胞周期結(jié)果（圖8A）顯示大部分細(xì)胞處于G0/G1期，比例約為93.39%；CD44+細(xì)胞周期結(jié)果（圖8B）顯示大部分細(xì)胞處于G0/G1期，比例約為91.23%。

2.5 CD133+細(xì)胞的增殖能力

CD133+細(xì)胞在接種后第2天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5天進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期，生長(zhǎng)曲線呈“S”形，細(xì)胞倍增時(shí)間為3.22 d。見(jiàn)圖9。

圖5 口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞成脂肪誘導(dǎo)分化Fig.5 Adipogenic differentiation of oral squamous cell carcinoma

圖6 CD44+細(xì)胞成脂肪誘導(dǎo)分化Fig.6 Adipogenic differentiation of CD44+cells

圖7 CD133+細(xì)胞成脂肪誘導(dǎo)分化Fig.7 Adipogenic differentiation of CD133+cells

圖8 CD133+和CD144+細(xì)胞周期測(cè)定Fig.8 CD133+，CD144+cell cycle assay

圖9 CD133+細(xì)胞的增殖情況Fig.9 Proliferation of CD133+cells

2.6 體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)

新生腫物在注射后第3天可觸及（圖10A），分別注射CD133+細(xì)胞及CD44+細(xì)胞的6只裸鼠，均可在相應(yīng)的注射區(qū)域觸及到移植瘤；注射原代培養(yǎng)OSCC細(xì)胞的6只裸鼠中有1只未觸及移植瘤。注射CD133+細(xì)胞裸鼠形成的腫物體積最大，注射原代培養(yǎng)OSCC細(xì)胞裸鼠所形成的腫物體積最小。1周后各取其中1只裸鼠處死并解剖，3組相應(yīng)接種區(qū)域均有腫物出現(xiàn)，且腫物體積明顯不一（圖10B），注射CD133+細(xì)胞形成的腫物大小約為23.5 mm，注射CD44+細(xì)胞裸鼠形成的腫物大小約為1.53 mm，注射原代培養(yǎng)OSCC細(xì)胞形成的腫物大小約為22 mm。

圖10 注射不同細(xì)胞后1周裸鼠的成瘤情況Fig.10 Tumor formation in nude mice atone week after injection with differeut cells

2.7 HE染色結(jié)果

病理結(jié)果由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師診斷，均為OSCC。如圖11A，CD133+細(xì)胞移植瘤的主要成分為細(xì)胞異形性及核分裂明顯的不成熟細(xì)胞，幾乎無(wú)法觀察到角化與細(xì)胞間橋，與低分化OSCC相對(duì)應(yīng)。圖11B中，CD44+移植瘤內(nèi)的細(xì)胞可觀察到獨(dú)特的多形核及核分裂相，未見(jiàn)明顯的角化及細(xì)胞間橋，與中分化OSCC相對(duì)應(yīng)OSCC細(xì)胞組移植瘤組織（圖11C）可觀察到明顯的癌巢、多形性核及核分裂，存在少量的角化，未見(jiàn)明顯細(xì)胞間橋，對(duì)應(yīng)高度-中度分化OSCC。對(duì)照為高分化舌癌患者癌組織HE染色（圖11D）。

圖11 3組細(xì)胞移植瘤的HE染色結(jié)果Fig.11 Three groups of cell transplantation tumor HE staining

3 討論

異質(zhì)性是腫瘤組織的特征之一，腫瘤組織中部分細(xì)胞具有干細(xì)胞性質(zhì)。腫瘤干細(xì)胞與正常成體干細(xì)胞生物學(xué)特性類(lèi)似，但其在生長(zhǎng)、增殖方面與正常成體干細(xì)胞不同，處于失控狀態(tài)，具有很強(qiáng)的自我更新能力，能夠形成新的腫瘤，是腫瘤的起源，并可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，甚至使腫瘤對(duì)放療及化療耐受［8-9]。腫瘤干細(xì)胞具有許多正常細(xì)胞所沒(méi)有的特質(zhì)，因此對(duì)腫瘤干細(xì)胞的研究將有助于進(jìn)一步揭示惡性腫瘤的發(fā)病發(fā)展機(jī)制。

AL-HAJJ等［10]首次鑒定了實(shí)體瘤中的腫瘤干細(xì)胞，所采用標(biāo)志物為CD44和CD24。腫瘤干細(xì)胞亦已通過(guò)CD44及CD133在多種實(shí)體瘤中被鑒定出來(lái)，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［11]、骨肉瘤［12]、軟骨肉瘤［13]、前列腺癌［14]、喉癌［15]、卵巢癌［16]。本研究采用 CD44、CD133進(jìn)行口腔腫瘤干細(xì)胞分選并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究。根據(jù)腫瘤干細(xì)胞的特點(diǎn)，通常采用以下幾種方法分選：流式細(xì)胞分選術(shù)［17]、免疫磁珠分選法［18]（magnetic cell sorting，MACS）、側(cè)群細(xì)胞分離法［19]以及無(wú)血清培養(yǎng)基微球培養(yǎng)法等分離技術(shù)。MACS法具有原理簡(jiǎn)單、操作方便、儀器設(shè)備要求低、細(xì)胞分選純度較高等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選擇MACS法分選OSCC干細(xì)胞，結(jié)果顯示分選所得的CD133+細(xì)胞及CD44+細(xì)胞純度均在94%以上，且分選所得的細(xì)胞可正常培養(yǎng)，活性良好，證明MACS技術(shù)是分選腫瘤干細(xì)胞可行有效的方法。

腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)與腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān)，且多數(shù)腫瘤干細(xì)胞處于靜止或休眠狀態(tài)［20]，使其能夠逃脫特異性細(xì)胞毒性藥物的殺傷作用，所以常規(guī)化療難以將其殺滅，且其化療后如受到適宜刺激會(huì)復(fù)蘇而進(jìn)入細(xì)胞周期［21]，造成腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。細(xì)胞周期主要由分裂間期及分裂期兩大過(guò)程組成，間期具體可分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）及DNA合成后期（G2期）。細(xì)胞開(kāi)始分裂至結(jié)束為分裂期，即M期。分裂間期在整個(gè)細(xì)胞周期中所占的時(shí)間比遠(yuǎn)大于分裂期，因此大多數(shù)正常細(xì)胞90%～95%的細(xì)胞周期時(shí)間為分裂間期。一些細(xì)胞反復(fù)分裂數(shù)次后，會(huì)處于一個(gè)特殊的時(shí)期，在此期間細(xì)胞停止分裂，但一旦受到適宜刺激又可重回細(xì)胞周期，即為G0期，又因期間DNA不復(fù)制，與G1期無(wú)法徹底分離，所以從結(jié)果上看為G0/G1期。本研究細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CD133+細(xì)胞和CD44+細(xì)胞多處于G0/G1期，符合腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性，可能更易造成腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。

為驗(yàn)證干細(xì)胞具有的多向分化能力，本研究以原代培養(yǎng)OSCC細(xì)胞為對(duì)照，將CD44+細(xì)胞及CD133+細(xì)胞進(jìn)行成骨細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)形成鈣結(jié)節(jié)，經(jīng)茜素紅染色顯示為紅色，同時(shí)可誘導(dǎo)形成脂滴，以油紅O染色后為紫紅色，表明CD44+細(xì)胞及CD133+細(xì)胞有較強(qiáng)的多向分化能力，而OSCC細(xì)胞也具有一定成骨分化能力，這可能與其中含有一定數(shù)量的 CD44+、CD133+相關(guān)［7]。

致瘤性是鑒定腫瘤干細(xì)胞的關(guān)鍵特征。本研究經(jīng)裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OSCC細(xì)胞、CD133+細(xì)胞及CD44+細(xì)胞均有體內(nèi)成瘤能力，但CD133+細(xì)胞成瘤體積在同等細(xì)胞注射數(shù)及同等觀察時(shí)間條件下最大，HE染色發(fā)現(xiàn)CD133+細(xì)胞形成的腫瘤符合低分化OSCC特點(diǎn)，由此可見(jiàn)CD133+細(xì)胞的致瘤能力較強(qiáng)，惡性特點(diǎn)更明顯。進(jìn)一步繪制CD133+細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)其倍增時(shí)間為3.22 d，說(shuō)明CD133+細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖能力。但本實(shí)驗(yàn)中所形成的腫瘤體積總體較小，可能有以下兩方面原因：⑴實(shí)驗(yàn)所用的裸鼠并未完全喪失免疫能力，對(duì)植入的異體腫瘤細(xì)胞仍有一定的殺傷；⑵由于注射部位不在口腔部位，皮下區(qū)血供不夠豐富，脫離了相似的內(nèi)環(huán)境。且本研究未設(shè)置對(duì)照組，因此相關(guān)結(jié)論需加以驗(yàn)證。

綜上所述，CD133和CD44可作為OSCC干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，應(yīng)用免疫磁珠分選法可分選出純度高的CD44+細(xì)胞和CD133+細(xì)胞，且其具有高成瘤性和多向分化等干細(xì)胞特性，增殖快速，成瘤組織病理接近中低分化口腔鱗癌組織的特點(diǎn)，而CD133+在分化和成瘤特性上更具優(yōu)越性，可用于構(gòu)建口腔鱗癌動(dòng)物模型及致癌和抗癌機(jī)制研究。