基于基因組突變數(shù)據(jù)分析肝癌預(yù)后分子標(biāo)志物

茅新如 劉文斌 曹廣文

原發(fā)性肝癌是男性第二大癌癥死亡原因［1]。我國原發(fā)性肝癌中95%是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。早期HCC患者術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，1年復(fù)發(fā)率超過50%，5年生存率僅為20%～30%，而晚期HCC缺乏有效的治療手段［2]。因此，尋找預(yù)測HCC復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)的分子標(biāo)志物尤為重要。

腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）被定義為每百萬堿基中被檢測出的體細(xì)胞基因編碼錯(cuò)誤、堿基替換、基因插入或缺失錯(cuò)誤的總數(shù)。研究表明，TMB是免疫檢查點(diǎn)抑制劑敏感的標(biāo)志物［3-5]。一項(xiàng)研究［6]分析了TCGA中22種腫瘤共7 882例患者，發(fā)現(xiàn)在膀胱癌、胃腺癌、子宮內(nèi)膜癌中，TMB與患者預(yù)后呈正相關(guān)，但在頭頸鱗癌、腎透明細(xì)胞癌中，TMB則與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。此外，DEVARAKONDA等［7]在908例可切除的肺癌患者中發(fā)現(xiàn)高TMB的患者預(yù)后較好。然而，TMB對HCC的預(yù)后價(jià)值尚無系統(tǒng)性報(bào)道。

近年來，在驅(qū)動肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究有了較大進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)多種基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［8-11]。常見驅(qū)動HCC發(fā)生發(fā)展信號通路包括細(xì)胞周期調(diào)控通路、WNT-β-catenin通路、表觀遺傳和染色質(zhì)重塑通路、AKT-mTOR-MAPK通路及氧化應(yīng)激通路等［12]。研究表明，上述信號通路的某個(gè)基因突變均可影響患者預(yù)后。AMADDEO等［13]發(fā)現(xiàn)HBV相關(guān)的HCC患者中，TP53 R249S突變與PFS有關(guān)。ZHAN等［14]通過Meta分析發(fā)現(xiàn)TP53突變的HCC患者總生存期（overall survival，OS）和無復(fù)發(fā)生存期（disease free survival，DFS）較差。WANG 等［15]研究報(bào)道β-catenin突變的HCC患者預(yù)后優(yōu)于無突變者。AHN等［16]在231例可手術(shù)的HCC患者研究中發(fā)現(xiàn)RB1突變和缺失與患者復(fù)發(fā)有關(guān)。本研究通過對TCGA和ICGC等數(shù)據(jù)庫中HCC全基因組和全外顯子的二代測序結(jié)果進(jìn)行分析，探討TMB、關(guān)鍵信號通路的基因變異與HCC預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中獲取376例HCC患者的全外顯子測序數(shù)據(jù)，從國際癌癥基因組聯(lián)（international cancer genome consortium，ICGC）（https：//dcc.icgc.org/）數(shù)據(jù)庫中分別獲取JP隊(duì)列394例及FR隊(duì)列250例HCC患者的全基因組測序數(shù)據(jù)，從cBioPortal數(shù)據(jù)庫（http：//www.cbioportal.org/）獲取 schulze2015隊(duì)列 243例HCC患者的全外顯子測序數(shù)據(jù)［17]，同時(shí)下載患者的臨床資料。檢索條件如下：⑴case選項(xiàng)，primary site：Liver；其他選項(xiàng)默認(rèn)系統(tǒng)設(shè)置。⑵Files選項(xiàng)，data type：mutation，copy number alterations（or copy number somatic mutations），clinical。

1.2 方法

采用R軟件對篩選獲取的年齡、性別、臨床分期、肝硬化、HBV感染、血管浸潤程度、分化程度、疾病復(fù)發(fā)時(shí)間和總生存時(shí)間等數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。TMB定義為編碼區(qū)域內(nèi)非沉默體細(xì)胞突變的總數(shù)［18]。將TMB數(shù)值從大到小排列，前四分位定義為高TMB，將各樣本數(shù)據(jù)分為高TMB組和低TMB組。LLOVET等［12]列出影響HCC發(fā)展的主要信號通路，包括細(xì)胞周期調(diào)控通路、WNT-β-catenin通路、表觀遺傳和染色質(zhì)重塑通路、AKT-mTOR-MAPK通路及氧化應(yīng)激通路（表1）。將一種信號通路基因列表中的任何一個(gè)基因發(fā)生變異定義為變異，將樣本數(shù)據(jù)分為基因變異組和無基因變異組。

表1 HCC 5大關(guān)鍵通路包含的基因和變異類型Tab.1 The major genes and alterations contained in the five key pathways in HCC patients in this study

1.3 評價(jià)指標(biāo)

本研究預(yù)后評價(jià)指標(biāo)包括OS和DFS。OS定義為確診之日起至因任何原因引起死亡的時(shí)間。DFS定義為從初次治療至最早出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或死亡的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 3.3.1和Stata 15進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Pearson相關(guān)分析分析TMB與患者臨床病理特征的關(guān)系，TCGA、schulze2015和FR隊(duì)列中TMB呈偏態(tài)分布，因此對TMB進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換后，分析其與年齡、腫瘤大小等的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)TMB和5大關(guān)鍵信號通路的基因變異與DFS、OS的關(guān)系，同時(shí)采用Cox回歸計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（HR）及其95%可信區(qū)間（CI）。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納入隊(duì)列的基本情況

本研究共納入4個(gè)隊(duì)列。TCGA隊(duì)列376例，其中男性占 67.55%，年齡（59.45±13.51）歲，亞洲人占42.55%，白種人占49.73%。JP隊(duì)列394例，其中男性占 75.89%，年齡（64.89±10.59）歲，均為亞洲人。FR 隊(duì)列250例，其中男性占 78.80%，年齡（63.20±12.40）歲，均為白種人。schulze2015隊(duì)列243例，男性占80.25%，平均年齡（63.32±11.62）歲，均為白種人。見表2。

2.2 TMB與HCC患者臨床病理特征的相關(guān)性

在4個(gè)隊(duì)列中均發(fā)現(xiàn)，對數(shù)轉(zhuǎn)換后的TMB與年齡呈正相關(guān)（TCGA：r=0.224，P＜0.001；schulze2015：r=0.260，P＜0.001；JP：r=0.122，P=0.015；FR：r=0.217，P＜0.001）；男性 TMB 高于女性（PTCGA=0.038，PJP=0.00，PFR=0.039，Pschulze2015=0.068）。在 schulze2015 隊(duì)列中，對數(shù)轉(zhuǎn)換后的TMB與腫瘤大小呈正相關(guān)（r=0.204，P=0.002），但未發(fā)現(xiàn)TMB與BCLC分期有關(guān)（P＞0.05），有血管浸潤的HCC患者TMB較高（P＜0.001）；分化級別Ⅰ～Ⅱ級的患者TMB較Ⅲ～Ⅳ級患者高（P=0.012）。

2.3 5大關(guān)鍵信號通路基因變異情況

比較5大關(guān)鍵信號通路不同種族的基因變異情況，發(fā)現(xiàn)TCGA隊(duì)列中亞洲人群的細(xì)胞周期調(diào)控通路的基因變異頻率為53.13%，高于TCGA隊(duì)列的白種人群（35.29%）、FR隊(duì)列人群（36.40%）及JP隊(duì)列人群（35.79%）。TCGA隊(duì)列中亞洲人群RB1基因、TP53基因、CDKN2A基因及CCND1基因在細(xì)胞周期調(diào)控通路中的變異頻率均高于隊(duì)列中的白種人群和FR 隊(duì)列人群（RB1：11.88%vs 10.16%，3.06%；TP53：33.75%vs 22.99%，23.60%；CDKN2A：12.05%vs 3.74%，5.06%；CCND1：8.13%vs 5.35%，4.40%）。其他通路基因變異情況見表3。

2.4 TMB與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

TCGA隊(duì)列中，與低TMB組比較，高TMB組HCC患者的OS明顯降低（70.0個(gè)月vs 27.5個(gè)月，P＜0.001）；高TMB組的DFS亦明顯降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（21.6個(gè)月vs 18.4個(gè)月，P=0.088）。調(diào)整性別、年齡、HBV感染、肝硬化、AJCC分期、ECOG評分等混雜因素后，高TMB組HCC患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是低TMB組的2.156 倍（HR=2.156，95%CI：1.471～3.159，P＜0.001），但未發(fā)現(xiàn)TMB與DFS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=1.322，95%CI：0.933～1.873，P=0.117）。在 JP 隊(duì)列和 FR 隊(duì)列中，均未發(fā)現(xiàn)TMB與OS、DFS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖 1、表 4、表 5。

2.5 關(guān)鍵信號通路基因變異與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

在TCGA隊(duì)列、JP隊(duì)列和FR隊(duì)列中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控通路基因變異的HCC患者中位DFS（TGCA：13.1個(gè)月vs 29.3個(gè)月，P=0.001；JP：17.2個(gè)月 vs 39.2個(gè)月，P=0.009；FR：9.3個(gè)月 vs 25.8個(gè)月，P＜0.001）和中位 OS（TGCA：46.8 個(gè)月 vs 69.5 個(gè)月，P=0.009；JP：80.3 個(gè)月 vs 120.0 個(gè)月，P=0.062；FR：28.9個(gè)月vs 60.0個(gè)月，P＜0.001）均低于無變異的患者，見圖2。調(diào)整相關(guān)混雜因素后，多因素Cox回歸分析顯示，細(xì)胞周期調(diào)控通路基因變異的HCC患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（HRTCGA=1.707，95%CI：1.260～2.314，P=0.001；HRJP=1.603，95%CI：1.143～2.248，P=0.006；HRFR=2.453，95%CI：1.593～3.777，P＜0.001）和死亡風(fēng)險(xiǎn)（HRTCGA=1.536，95%CI：1.075～2.193，P=0.018；HRJP=1.740，95%CI：1.079～2.809，P=0.023；HRFR=2.479，95%CI：1.544～3.980，P＜0.001）均高于無變異者。其余關(guān)鍵信號通路基因變異與HCC患者預(yù)后的關(guān)系見表6、表7。

表2 TCGA、JP、FR和schulze2015 4個(gè)隊(duì)列患者的一般資料Tab.2 Patients characteristics of TCGA，JP，F(xiàn)R and schulze2015

表3 不同種族中5個(gè)關(guān)鍵信號通路的突變頻率Tab.3 Mutation frequency in five key signal pathways in different races

表4 TMB與HCC患者DFS的關(guān)系Tab.4 Relationship between TMB and DFS in HCC patients

表5 TMB與HCC患者OS的關(guān)系Tab.5 Relationship between TMB and OS in HCC patients

表6 關(guān)鍵信號通路的基因變異與HCC患者DFS的關(guān)系Tab.6 Relationship between key signal pathway and DFS in HCC patients

表7 關(guān)鍵信號通路的基因變異與HCC患者OS的關(guān)系Tab.7 Relationship between key signal pathways and OS in HCC patients

圖1 TMB與HCC患者DFS和OS的關(guān)系Fig.1 Relationship of TMB and DFS and OS in in HCC patients

圖2 細(xì)胞周期調(diào)控通路的基因變異與HCC患者DFS和OS的關(guān)系Fig.2 Relationship of genetic aberrations in cell cycle control pathway genes and DFS and OS in HCC patients

3 討論

在慢性炎癥促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展過程中，體細(xì)胞突變和修復(fù)功能失調(diào)，絕大部分變異細(xì)胞失去生存優(yōu)勢，逐漸被淘汰，賦予細(xì)胞生長優(yōu)勢的變異得以保留下來，體現(xiàn)了“癌癥進(jìn)化發(fā)育學(xué)”的基本特征［8]。本研究發(fā)現(xiàn)在HCC中TMB隨年齡增長而增加，可能與細(xì)胞增殖歲月痕跡有關(guān)。CHALMERS等［19]在10萬例不同癌種患者的研究中亦發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加TMB顯著增加（P＜1×10-16），線性模型預(yù)測10歲和90歲之間TMB的差異為2.4倍。男性高發(fā)是肝癌的一個(gè)重要流行病學(xué)特征，但亦有研究［19]發(fā)現(xiàn)男性與女性患者TMB無顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)男性TMB顯著高于女性，可能與男性患者中有更多體細(xì)胞突變積累有關(guān)。ZHANG等［20]從599例中國臨床樣本中發(fā)現(xiàn)早期肺腺癌患者的TMB水平低于晚期肺腺癌，但該研究未發(fā)現(xiàn)TMB與臨床分期有關(guān)，因此需要更多的臨床研究驗(yàn)證。2018年ESMO報(bào)道，TMB在不同腫瘤中的預(yù)后預(yù)測價(jià)值不同，且TMB在同一癌種不同分期階段的預(yù)后預(yù)測價(jià)值也不盡相同［6]。這可能與TMB在不同腫瘤和腫瘤的不同階段發(fā)揮著不同的作用有關(guān)。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，TCGA隊(duì)列中高TMB的HCC患者預(yù)后不良，但該結(jié)論未能在FR隊(duì)列及JP隊(duì)列中得到驗(yàn)證，可能是不同隊(duì)列校正的混雜因素不相同造成。

細(xì)胞周期調(diào)控通路的基因是HCC發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因，驅(qū)動腫瘤的發(fā)展。有研究表明，TP53、RB1等分子變化與預(yù)后不良有關(guān)，可能導(dǎo)致更具攻擊性的表型［13-14，16]。本研究分析5大關(guān)鍵信號通路的基因變異與HCC復(fù)發(fā)和死亡的關(guān)系，均未發(fā)現(xiàn)WNT-β-catenin通路、表觀遺傳與染色質(zhì)重塑通路、氧化應(yīng)激信號通路的基因變異影響HCC患者的DFS和OS。其中AKT-mTOR-MAPK信號通路基因變異的患者DFS和OS更短，但該結(jié)論只在TCGA和JP隊(duì)列中成立。進(jìn)一步納入TP53、RB1、CCND1和CDKN2A 4個(gè)細(xì)胞周期調(diào)控通路高頻突變基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞周期調(diào)控通路的基因變異在TCGA隊(duì)列中頻率為53.13%，JP隊(duì)列為35.79%，F(xiàn)R隊(duì)列為36.40%，且攜帶此細(xì)胞周期調(diào)控基因變異的HCC患者更早出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)和死亡，上述結(jié)果校正了混雜因素且在TCGA隊(duì)列、FR隊(duì)列及JP隊(duì)列中均得到了驗(yàn)證，說明這4個(gè)基因突變與HCC患者的預(yù)后有關(guān)，細(xì)胞周期調(diào)控通路可能對HCC預(yù)后有一定預(yù)測作用。

本研究發(fā)現(xiàn)年齡大、男性或腫瘤直徑大的HCC患者TMB更高，細(xì)胞周期通路的基因變異顯著促進(jìn)HCC早期復(fù)發(fā)和死亡。但由于納入隊(duì)列提供的信息有限，無法校正其他因素對DFS和OS的影響，因此相關(guān)結(jié)論仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。